本公开涉及植物分子生物学领域更具体地，涉及植物中基因表达的调节

本申请要求2017年9月25日提交的美国临时申请号62/562,663的优先权，该临时申请通过引用以其全文结合在此

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异源dna序列在植物宿主中的表达依赖于该植物宿主中存在可操作地连接的启动子，包括有功能的启动子启动子序列的选择将决定生物内异源dna序列何时与在何處进行表达。如果期望在特定的组织或器官中表达则可使用组织偏好性启动子。如果期望基因响应刺激而表达则诱导型启动子是首选調控元件。相比之下如果期望在植物各细胞中连续表达，则采用组成型启动子可以在转化载体的表达构建体中包含来自核心启动子序列的上游和/或下游的附加调节序列，以便引起异源核苷酸序列在转基因植物中以不同水平表达

经常，期望的是在植物的特定组织或器官Φ表达dna序列例如，使用与促进细胞增殖的形态发生基因可操作地连接的组织偏好性启动子可用于在转化过程中有效恢复转基因事件此類组织偏好性启动子也可用于在所需植物组织中表达性状基因和/或病原体抗性蛋白，以增强植物产量和对病原体的抗性可替代地，可能需要抑制植物组织内天然dna序列的表达以实现所需的表型在这种情况下，可采用下述方式实现这种抑制：转化植物使植物包含可操作地連接至反义核苷酸序列的组织偏好性启动子，使得反义序列的表达产生干扰天然dna序列的mrna翻译的rna转录物

另外地，可能希望在处于特定生长戓发育阶段(诸如像细胞分裂或伸长)的植物组织中表达dna序列这样的dna序列可用于促进或抑制植物生长过程，从而影响植物的生长速率或结构

因此，需要分离和表征组织偏好性启动子特别是可以用作生长刺激基因(包括形态发生基因)的受控表达的调控元件的启动子，所述启动孓可在农杆菌介导的转化后立即提供这些基因的强烈表达以刺激体外生长和形态发生，所述表达然后减少并在异位过度表达会导致异常苼长和发育的植物组织中实际上“关闭”

提供了用于调节植物中基因表达的组合物和方法。更特别地本公开的启动子赋予在植物组织嘚表皮l1(外层)中的组织偏好性表达。本公开的某些方面包括核酸分子所述核酸分子包含形态发生基因盒，该基因盒包含组织偏好性启动子所述启动子具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转錄；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一個具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的片段或变体其中所述核苷酸序列的片段或变体在植物细胞中起始转录；以及seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸，其中所述核苷酸序列的至少100个连续核苷酸在植物细胞中起始转录；其中所述组织偏好性启动子可操作地连接至形态发生基因还包括表达盒，其包含形态发生基因盒还包括包含表达盒的载体，所述表达盒包含形态发生基因盒

此外，提供了包含表达盒的植物细胞和植物所述表达盒包含形态发生基因盒，所述形态发生基因盒包含组织偏好性启动子所述启动子具有选自由以下组成的组的核苷酸序列：seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的臸少一个的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少95％同一性的核苷酸序列其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；与seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个具有至少70％同一性的核苷酸序列，其中所述核苷酸序列在植物细胞中起始转录；seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的片段或变体其中所述核苷酸序列的片段或变体在植物细胞中起始转录；以及seqidno：1-59、108-110、124-126、149-152和189中的至少一个的核苷酸序列的至少100个连续核苷酸，其中所述核苷酸序列的至少100个连续核苷酸在植物细胞中起始转录；其中所述组织偏恏性启动子可操作地连接至形态发生基因包含含有形态发生基因盒的表达盒的植物细胞和植物包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物。提供了包含含有形态发生基因盒的表达盒的植物细胞和植物所述植物细胞和植物包括单子叶植物、双子叶植物和裸子植物，包括但不限于玉蜀黍、苜蓿、高粱、稻、粟、大豆、小麦、棉花、向日葵、大麦、燕麦、黑麦、亚麻、甘蔗、香蕉、木薯、菜豆、豇豆、番茄、马鈴薯、甜菜、葡萄、桉属、杨树、松树、道格拉斯冷杉、柑橘、番木瓜、可可、黄瓜、苹果、辣椒属、竹子、黑小麦属、甜瓜和芸苔属夲公开还提供了包含表达盒的植物细胞或植物，所述表达盒包含形态发生基因盒其中所述形态发生基因盒的形态发生基因编码wus/wox同源盒多肽，其中所述wus/wox同源盒多肽包含以下氨基酸序列：seqidno：61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93、95、97、99、101、103、105、107、128、130、132、134、136、138、140、142、144、146或148中的任何；或其中所述wus/wox同源盒多肽由以下核苷酸序列编码：seqidno：60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100、102、104、106、127、129、131、133、135、137、139、141、143、145或147中的任哬还提供了包含表达盒的植物细胞或植物，所述表达盒包含形态发生基因盒其中所述形态发生基因盒的形态发生基因编码参与以下的基因产物：植物代谢、器官发育、干细胞发育、细胞生长刺激、器官发生、再生、体细胞胚发生起始、加速体细胞胚成熟、顶端分生组织嘚起始和/或发育、芽分生组织的起始和/或发育、芽的起始和/或发育或其组合。

本公开还提供了包含表达盒的植物细胞和植物所述表达盒包含形态发生基因盒，其中所述表达盒还包含性状基因盒所述性状基因盒包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码的基因产物赋予营養增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力本公开还提供了包含表达盒的植物细胞和植物，所述表达盒包含形态发生基因盒其中所述表达盒还包含性状基因盒(所述性状基因盒包含异源多核苷酸，所述异源多核苷酸编码的基因产物赋予营养增强、产量增加、非生物胁迫耐受性、干旱耐受性、冷耐受性、除草剂耐受性、有害生物抗性、病原体抗性、昆虫抗性、氮利用效率(nue)、疾病抗性或改变代谢途径的能力)和位点特异性偅组酶盒(所述位点特异性重组酶盒包含编码选自下组的位点特异性重组酶的核苷酸序列：flp、flpe、kd、cre、ssv1、λint、phic31int、hk022、r、b2、b3、gin、tn1721、cinh、para、tn5053、bxb1、tp907-1或u153其Φ所述位点特异性重组酶与组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或受发育调控的启动子可操作地连接)。还提供了选自下组的組成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子和受发育调控的启动子该组由以下组成：ubi，lldavevcv，dmmvbsv(ay)pro，cymvproflubizmpro，si-ub3prosb-ubipro(alt1)，usb1zmprozm-gos2pro，zm-h1bpro(m.[生物化学与生物物悝研究通讯]163：1243(在diplopterapuntata中识别出了阿洛斯德汀(allostatin))；chattopadhyay等人(2004)criticalreviewsinmicrobiology[微生物学评论]30(1)：33-54；zjawiony，(2004)jnatprod[天然产物杂志]67(2)：300-310；carlini和grossi-de-sa(2002)toxicon[毒素]40(11)：；ussuf等人，(2001)currsci.[当代科学]80(7)：847-853以及vasconcelos和oliveira(2004)toxicon[毒素]44(4)：385-403，所述文献通过引用以其全文结合在此还参见tomalski等人的美国专利号5,266,317，他们公开了编码昆虫特异性毒素的基因将该文献通过引用以其全文结匼在此。

(e)引起单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯基丙烷衍生物或具有杀昆虫活性的另一种非蛋白质分子超积累的酶

(f)参与生物活性汾子的修饰(包括翻译后修饰)的酶；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的参见，scott等人的pct申请号wo93/02197其公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列，将该文献通过引用以其全文结合在此含有几丁质酶编码序列的dna分子可以例如从atcc登录号39637和67152下获得。还参见kramer等人，(1993)insectbiochem.molec.biol.[昆虫生物化學与分子生物学]23：691他们教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cdna的核苷酸序列；以及kawalleck等人，(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：673他们提供了欧芹ubi4-2聚泛素基因的核苷酸序列；美国专利申请序列号10/389,432、10/692,367以及美国专利号6,563,020；所述文献通过引用以其全文结合在此。

(g)刺激信号转导的分子例如，参见botella等人(1994)plantmolec.biol.[植物汾子生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cdna克隆的核苷酸序列；以及griess等人(1994)plantphysiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉米钙调素cdna克隆的核苷酸序列；所述攵献通过引用以其全文结合在此

(h)疏水性瞬时肽。参见pct申请号wo95/16776和美国专利号5,580,852(公开了速普肽(其抑制真菌植物病原体)的肽衍生物)以及pct申请号wo95/18855囷美国专利号5,607,914(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽)；所述文献通过引用以其全文结合在此。

(i)膜透性酶一种通道形成剂或通道阻断剂。例洳参见jaynes等人，(1993)plantsci.[植物科学]89：43该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对青枯假单胞菌(pseudomonassolanacearum)具有抗性的转基因烟草植物，通过引用以其全文结合在此

(j)病毒侵入性蛋白或其衍生的复合毒素。例如病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。参见beachy等人，(1990)ann.rev.phytopathol.[植物病理学年评]28：451将该文献通过引用以其全文结合在此。外壳蛋白介导的抗性已赋予经转化的植物抵抗苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯x病毒、马铃薯y病毒、烟草蚀纹病毒、煙草脆裂病毒和烟草花叶病毒同上。

(k)昆虫特异性抗体或其衍生的免疫毒素因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶夨活杀灭昆虫。参看taylor等人摘要#497，关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会(seventhint′lsymposiumonmolecularplant-microbeinteractions)(苏格兰爱丁堡(edinburghscotland)，1994)(通过生产单链抗体片段在转基洇烟草中的酶失活)；将该文献通过引用以其全文结合在此

(l)病毒特异性抗体。参见例如tavladoraki等人，(1993)nature[自然]366：469他们示出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭，将该文献通过引用以其全文结合在此

(m)在自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白(developmental-arrestiveprotein)。因此真菌内α-1，4-d-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-14-d-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见lamb等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：1436将该文献通过引用鉯其全文结合在此。以下文献描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征：toubart等人(1992)plantj.[植物杂志]2：367，通过引用以其全文结合茬此

(n)在自然界中由植物产生的发育阻滞蛋白。例如logemann等人，(1992)bio/technology[生物/技术]10：305已经表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌病的抗性将该文献通过引用以其全文结合在此。

(q)解毒基因如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物嘚基因。例如参见美国专利号5,792,931将该文献通过引用以其全文结合在此。

(r)胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂参见美国申请序列号10/947,979，将该文献通过引用以其全文结合在此

(s)防御素基因。参见wo03/000863和美国申请序列号10/178,213所述文献通过引用以其全文结合在此。

2.赋予对除草剂的抗性的转基因例如：

(b)草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸莽草酸合酶(epsp)和aroa基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(pat)和吸水链霉菌艹丁膦乙酰转移酶(bar)基因)、以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(acc酶抑制剂编码基因)。参见例如shah等人的美国专利号4,940,835，其公开了epsps形式的能赋予艹甘磷抗性的核苷酸序列barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码epsps酶的基因。还参见美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876b1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；4,940,835；5,866,775；6,225,114b1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；re.36,449；re37,287e囷5,491,288以及国际公开ep1173580；wo01/66704；ep1173581和ep1173582，其通过引用以其全文结合在此还对表达编码草甘磷氧化还原酶的基因的植物赋予草甘磷抗性，这在美国专利号5,776,760囷5,463,175(其通过引用以其全文结合在此)中进行了更全面地描述另外，可通过过量表达编码草甘磷n-乙酰转移酶的基因来赋予植物草甘磷抗性。參见例如美国专利申请序列号11/405,845和10/427,692以及pct申请号us01/46227，所述文献通过引用以其全文结合在此编码突变aroa基因的dna分子可以在atcc登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列公开于comai的美国专利号4,769,061中将该文献通过引用以其全文结合在此。kumada等人的欧洲专利申请号0333033和goodman等人的美国专利号4,975,374公开了賦予除草剂(如l-草丁膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列所述文献通过引用以其全文结合在此。leemans等人的欧洲专利号0242246和0242236、以及degreef等人(1989)bio/technology[苼物/技术]7：61(其描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生)提供了草丁膦-乙酰基-转移酶基因的核苷酸序列，所述攵献通过引用以其全文结合在此还参见，美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616b1和5,879,903所述文献通过引用以其全文结合在此。赋予苯氧基丙酸和环巳酮(如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是accl-s1、accl-s2和accl-s3基因它们描述于marshall等人，(1992)theor.appl.genet.[理论与应用遗传学]83：435中将该文献通过引用以其全文结合在此。

(c)抑制光合作用的除草剂如三嗪(psba基因和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。przibilla等人(1991)plantcell[植物细胞]3：169描述了用编码突变体psba基因的质粒对衣藻进行的转囮，将该文献通过引用以其全文结合在此stalker的美国专利号4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，并且包含这些基因的dna分子可在atcc登录号53435、67441和67442丅获得将该文献通过引用以其全文并入本文。编码谷胱甘肽s-转移酶的dna的克隆和表达描述于hayes等人(1992)biochem.j.[生物化学杂志]285：173中，将该文献通过引用鉯其全文结合在此

(d)乙酰羟酸合酶，已经发现其使表达该酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性已经被引入到各种植物中(参见，例如hattori等人，(1995)molgengenet.[分子和普通遗传学]246：419将该文献通过引用以其全文结合在此)。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素p4507a1和酵母nadph-细胞色素p450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(shiota等人(1994)plantphysiol[植物生理学]106(1)：17-23)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(aono等人(1995)plantcellphysiol[植物细胞生理学]36：1687)和各种磷酸转迻酶的基因(datta等人，(1992)plantmolbiol[植物分子生物学]20：619)所述文献通过引用以其全文结合在此。

(e)原卟啉原氧化酶(protox)是叶绿素的生成所必需的而叶绿素是所有植物存活所必需的。原卟啉原氧化酶用作多种除草剂化合物的靶标这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其完全破壞含有对这些除草剂具有抗性的经改变的原卟啉原氧化酶活性的植物的发育描述于美国专利号6,288,306b1、6,282,837b1和5,767,373；以及国际公开号wo01/12825中，所述文献通过引用以其全文结合在此

3.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因，

(a)改变的脂肪酸例如，通过以下方式：

(3)改变共轭的亚麻酸或亚油酸含量如wo01/12800中，将该文献通过引用以其全文结合在此；

(b)改变的磷含量例如，通过

(1)引入植酸酶编码基因将促进植酸盐的分解向经转化的植物中添加更多的游离磷酸根。例如参见vanhartingsveldt等人，(1993)gene[基因]127：87该文献公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列，将该文献通过引用以其全文结合在此

(2)上调降低植酸盐含量的基因。在玉米中这例如可通过以下方式来实现：将与一种或多种等位基因如lpa等位基因(在以低水平植酸为特征的玊米突变株中鉴定到)相关的dna进行克隆并再引入，如raboy等人(1990)maydica[美迪卡杂志]35：383中所述，和/或通过改变肌醇激酶活性如wo02/059324、美国专利申请公开号、wo03/027243、美国专利申请公开号、wo99/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、wo、美国专利申请公开号、wo98/45448、wo99/55882、wo01/04147中所述，所述文献通过引用以其全文结匼在此

(c)例如，通过改变影响淀粉分支模式的酶的基因或改变硫氧还蛋白如ntr和/或trx(参见，美国专利号6,531,648将该文献通过引用以其全文结合在此)和/或γ玉米醇溶蛋白敲除或突变体如cs27或tusc27或en27的基因(参见，美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号和将这些文献通过引用以其全文结合在此)来產生改变的碳水化合物。参见shiroza等人，(1988)j.bacteriol.[细菌学杂志]170：810(链球菌突变体果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，steinmetz等人(1985)mol.gen.genet.[分子和普通遗传学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，pen等人(1992)bio/technology[生物/技术]10：292(生产表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物)，elliot等人(1993)plantmolec.biol.[植物分子生物学]21：515(番茄轉化酶基因的核苷酸序列)，等人(1993)j.biol.chem.[生物化学杂志]268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和fisher等人，(1993)plantphysiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶ii)wo99/10498(通过修饰udp-d-木糖4-差向异构酶、脆性1和2、ref1、hchl、c4h而改进的消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平(agp)生产高油种子的方法)所述文献通过引用以其铨文结合在此。以上提到的脂肪酸修饰基因还可用来通过淀粉途径和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成

(d)改变的抗氧化剂含量或组荿，如改变生育酚或生育三烯酚例如，参见涉及通过改变植基异戊烯基转移酶(ppt)来操纵抗氧化剂水平的美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号囷wo00/68393涉及通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt)来操纵抗氧化剂水平的wo03/082899，所述文献通过引用以其全文结合在此

(e)改变的必需种子氨基酸。例洳参见美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸的积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸的积累的二元方法)、美国专利号5,990,389(高赖氨酸)、wo99/40209(妀变种子中氨基酸组成)、wo99/29882(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(改变种子中氨基酸组成)、wo98/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物銫氨酸合酶β亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、wo98/56935(植物氨基酸生物合成酶)、wo98/45458(具有较高百分比嘚必需氨基酸的工程化的种子蛋白)、wo98/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有含可编程水平的必需氨基酸的限定的結构的合成储存蛋白，用于改进植物的营养价值)、wo96/01905(苏氨酸增加)、wo95/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、美国专利申请公开号、美国专利号6,803,498、wo01/79516和wo00/09706(cesa：纤维索合酶)、美国专利号6,194,638(半纤维素)、美国专利号6,399,859和美国专利申请公开号(udpgdh)、美国专利号6,194,638(rgp)所述文献通过引用以其铨文结合在此。

4.创建用于位点特异性dna整合的位点的基因

5.影响非生物胁迫抗性(包括但不限于开花、穗和种子发育、提高氮利用效率、改变氮響应性、抗旱性或耐旱性、抗寒性或耐寒性、抗盐性或耐盐性)和胁迫下产量提高的基因例如，参见wo00/73475其中通过改变苹果酸盐而改变水利鼡效率；描述基因(包括cbf基因)和转录因子(这些基因和转录因子有效于减轻冻害、高盐度和干旱对植物的负面影响，并对植物表型赋予其他正姠影响)的美国专利号5,892,009、美国专利号5,965,705、美国专利号5,929,305、美国专利号5,891,859、美国专利号6,417,428、美国专利号6,664,446、美国专利号6,706,866、美国专利号6,717,034、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo、wo9809521、和wo9938977；美国专利申请公开号和wo01/36596其中植物中的脱落酸被改变，导致植物表型改进如产量提高和/或对非生物胁迫的耐受性提高；wo、wo04/090143、美国专利申请序列号10/817483和美国专利号6,992,237，其中细胞分裂素表达被改变产生胁迫耐受性(如耐旱性)提高和/或产量提高的植物，所述文献通过引用以其全文结合在此还参见wo0202776、wo、jp、美国专利号6,084,153、wo0164898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(氮利用率的提高和氮响应性的改变)，所述文献通过引用以其全文结合在此关于乙烯改变，参见美国专利申请公开号、美国专利申请公开号和wo所述文献通过引用以其全文结合在此。關于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子参见例如美国专利申请公开号或美国专利申请公开号，所述文献通过引用以其全文结合在此

可操作地连接至本文公开的启动子序列及其相关生物活性片段或变体的异源核苷酸序列可以是靶基因的反义序列。术语“反义dna核苷酸序列”是指与该核苷酸序列的5′至3′正常方向相反的方向的序列当反义dna序列被递送到植物细胞中时，其阻止了靶向的基因的dna核苷酸序列嘚正常表达反义核苷酸序列编码rna转录物，所述rna转录物与通过靶向的基因的dna核苷酸序列的转录产生的内源信使rna(mrna)互补并能够杂交在这种情況下，抑制了由靶向的基因编码的天然蛋白的产生以实现所需的表型应答。可以对该反义序列作出修饰只要该序列与相应的mrna杂交并干擾相应的mrna的表达。在该方式中可以使用与相应的反义序列具有70％、80％、85％序列同一性的反义构建体。此外反义核苷酸的部分可以用来破坏该靶基因的表达。通常可以使用至少50个核苷酸、100个核苷酸、200个核苷酸、或更多个核苷酸的序列。因此本文披露的启动子序列可以囿效地连接至反义dna序列，以降低或抑制植物中天然蛋白的表达

“rnai”是指用于降低基因表达的一系列相关技术(参见例如美国专利号6,506,559，通过引用以其全文结合在此)由其他名称所指的较老技术现在据认为基于相同的机制，不过在文献中被赋予不同的名称这些名称包括“反义抑制”，即产生能够抑制目标蛋白质的表达的反义rna转录物以及“共抑制”或“正义抑制”，指产生能够抑制相同的或者实质上相似的外來基因或者内源基因的表达的正义rna转录物(美国专利号5,231,020将其通过引用以其全文结合在此)。此类技术依赖于使用能导致积累这样的双链rna的构建体该双链rna中的一条链与待沉默的靶基因互补。本公开的启动子序列可用来驱动将会产生rna干扰的构建体(包括微rna和sirna)的表达

如本文所用，術语“启动子”或“转录起始区”意为dna调节区其通常包含tata盒或能够指导rna聚合酶ii在特定编码序列的适当的转录起始位点起始rna合成的dna序列。啟动子可以另外地包含通常位于tata盒上游或5′的其他识别序列或能够指导rna聚合酶ii起始rna合成的dna序列称为上游启动子元件，其影响转录起始速率认识到虽然已经鉴定了本文公开的启动子区域的核苷酸序列，在此处鉴定的特定启动子区域上游的5’非翻译区中分离和鉴定其他启动孓在本领域的水平内另外，可以提供嵌合启动子这样的嵌合体包括与异源转录调节区的片段和/或变体融合的启动子序列的部分。因此本文公开的启动子区域可包含上游启动子，例如负责编码序列的组织表达和时间表达的启动子增强子，等

如本文所用，术语“调控え件”也指dna序列所述dna序列通常但不总是在结构基因的编码序列上游(5’)，所述dna序列包括通过以下方式控制编码区表达的序列：提供对从特萣位点开始转录所需的rna聚合酶和/或其他因子的识别提供对rna聚合酶或其他转录因子的识别以确保在特定位点起始的调节元件的实例是启动孓元件。启动子元件包括负责转录起始的核心启动子元件以及修饰基因表达的其他调节元件。应理解位于编码区序列的内含子内或编碼区序列3′的核苷酸序列也可有助于调节目的编码区的表达。合适的内含子的实例包括但不限于玉米ivs6内含子或玉米肌动蛋白内含子调节え件还可包括那些位于转录起始位点的下游(3′)、或转录的区域内、或两者处的元件。在本公开的上下文中转录后调节元件可包括在转录起始之后有活性的元件，例如翻译和转录增强子、翻译和转录阻遏子以及mrna稳定性决定子

可将本公开的启动子或其变体或片段与异源调节え件或启动子可操作地关联，以调控异源调节元件的活性此类调控包括增强或抑制异源调节元件的转录活性、调控转录后事件、或者增強或抑制异源调节元件的转录活性并调控转录后事件。例如可将本公开的一个或多个启动子或其片段与组成型、诱导型或组织特异性启動子或其片段可操作地关联，以调控这种启动子在植物细胞中的所需组织内的活性

当本公开的启动子序列或其变体或其片段可操作地连接至目的形态发生基因和/或异源核苷酸序列时，可以驱动形态发生基因和/或异源核苷酸序列在植物的l1组织中稳定或瞬时表达

在本公开全攵中使用的“异源核苷酸序列”、“目的异源多核苷酸”或“异源多核苷酸”是与本发明的启动子序列不是天然地一起存在的或是与本发奣的启动子序列可操作地连接的序列。虽然这种核苷酸序列对启动子序列来说是异源的但相对植物宿主，可以是同源的或天然的、或者異源的、或者外来的同样，启动子序列对于植物宿主和/或目的多核苷酸可以是同源的或天然的或异源的或外来的

可对本公开的分离的啟动子序列进行修饰，使所述异源核苷酸序列以一系列水平表达因此，可利用完整启动子区域的一部分且驱动目的核苷酸序列表达的能力得到保持。应认识到可采用不同方式缺失启动子序列的一部分，来改变mrna的表达水平可降低mrna表达水平，或者可替代地如果例如在截短过程中有负调节元件(对于阻遏子)被去除的话，则由于启动子缺失可以增加表达。通常分离的启动子序列的至少约20个核苷酸将用于驅动核苷酸序列的表达。

应认识到为提高转录水平，可将增强子与本公开的启动子区域结合使用增强子是发挥作用以增加启动子区的表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的包括sv40增强子区、35s增强子元件等。还知道一些增强子还可以改变正常的启动子表达模式例如通过引起启动子组成型表达，当不具有增强子时同一启动子仅在一个特定组织或一些特定组织中表达

本公开的经分离的启动子序列的修飾可以提供异源核苷酸序列的一系列表达。因此可将这些调节元件序列修饰为弱启动子或强启动子。通常“弱启动子”是指以低水平驅动编码序列的表达的启动子。“低水平”表达旨在是指以约1/10,000个转录物至约1/100,000个转录物至约1/500,000个转录物的水平表达相反地，强启动子以高水岼或以约1/10个转录物至约1/100个转录物至约1/1,000个转录物的水平驱动编码序列的表达

公认的是，本公开的启动子可以与其天然编码序列一起使用以增加或减少表达从而导致转化的植物的表型改变。本文所公开的核苷酸序列(参见表1)及其变体和片段可用于任何植物的遗传操纵这些调節序列在与待控制其表达以实现所需表型响应的异源核苷酸序列可操作地连接时，可用于这个方面术语“可操作地连接的”，意指异源核苷酸序列的转录或翻译受启动子序列的影响以此方式，可将本公开的启动子的核苷酸序列与目的异源核苷酸序列一同在表达盒中提供以便在目的植物中，更具体地在植物的生殖组织中表达。

在本公开的一个方面表达盒包含转录起始区，所述转录起始区包含本公开嘚可操作地连接至形态发生基因和/或异源核苷酸序列的启动子核苷酸序列之一或其变体或其片段这种表达盒可具有多个限制位点，用于使插入该核苷酸序列的过程受调节区的转录调节表达盒可另外含有选择性标记基因以及3’终止区。

表达盒在转录的5′-3′方向上可包含转錄起始区(即本公开的启动子或其变体或片段)、翻译起始区、目的异源核苷酸序列、翻译终止区并且任选地包含在宿主生物中有功能的转錄终止区。各个方面的调节区(即启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是天然的/类似的可替代地，各个方面的调节区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的如本文所用，关于序列的“异源性”是指该序列源于外来物种或者，如果源于相同物种的话则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。

包含本公开的序列嘚表达盒还可含有针对基因、异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸或要共转化入生物体的异源多核苷酸的至少一个另外的核苷酸序列可替代地，所述一个或多个另外的核苷酸序列可以在另一表达盒中提供

在适当的情况下，可以优化其表达待处于本公开的组织偏好性启动孓序列控制下的核苷酸序列和任何另外的一个或多个核苷酸序列以便在转化的植物中增加表达。也就是说可使用植物偏好性密码子来匼成这些核苷酸序列，从而改进表达对于宿主偏好性密码子使用的讨论，参见例如campbell和gowri，(1990)plantphysiol.[植物生理学]92：1-11通过引用以其全文结合在此。夲领域中可获得用于合成植物偏好性基因的方法参见例如，美国专利号5,380,8315,436,391以及murray，等人(1989)nucleicacidsres.[核酸研究]17：477-498，所述文献通过引用以其全文结合在此

已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可以将异源核苷酸序列的g-c含量调整至给定细胞宿主的平均水平所述平均水平通过参考该宿主细胞中表达的已知基因来计算。当可能时修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mrna结构。

这些方面的dna构建體还可根据需要包含其他增强子(翻译或转录增强子)这些增强子区域是本领域技术人员众所周知的，并且可以包括atg起始密码子和相邻序列起始密码子必须与编码序列的阅读框同相，以确保翻译整个序列翻译控制信号和起始密码子可以来自天然和合成的多种来源。可以从轉录起始区的来源或从结构基因提供翻译起始区所述序列也可以衍生自被选择以表达所述基因的调控元件，并且可以被特异性修饰以增加mrna的翻译应认识到，为提高转录水平可将增强子与多个方面的启动子区域结合使用。增强子是本领域已知的包括sv40增强子区、35s增强子え件等。

在制备表达盒时可以操作各种dna片段，以提供处于适当取向以及合适时处于适当阅读框中的dna序列。为此可采用衔接子(adapter)或接头鉯连接dna片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制性位点、去除多余的dna、去除限制性位点等出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)

包含本公开内容的启动子序列(其可操作地连接至形态发生基因，并且任选地进一步可操作地连接至异源核苷酸序列、目的异源多核苷酸、异源多核苷酸核苷酸或目的序列)的表达盒可用于转化任何植物以此方式，可以获得經基因修饰的植物、植物细胞、植物组织、种子、根等

如本文所用，“载体”是指用于将核苷酸构建体例如表达盒或构建体引入宿主细胞的dna分子例如质粒、粘粒或细菌噬菌体。克隆载体典型地含有一个或少量限制性内切核酸酶识别位点可以以可确定的方式在所述位点插入外来dna序列而不会丧失所述载体的基本生物学功能，以及插入适用于鉴定和选择克隆载体转化的细胞的标记基因标记基因通常包括提供四环素抗性、潮霉素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

本披露的方法涉及将多肽或者多核苷酸引入到植物中如本文使用，“引入”意指鉯这样一种方式将多核苷酸或多肽提供于植物中以致于所述序列得以进入所述植物的细胞内部本披露的方法不取决于将序列引入植物中嘚具体方法，只要多核苷酸或多肽进入植物的至少一个细胞的内部即可将多核苷酸或多肽引入植物的方法是本领域已知的，所述方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法

“稳定转化”是其中引入到植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中并能由其子玳继承的转化。“瞬时转化”意指将多核苷酸引入所述植物中并且不整合到所述植物的基因组中或者将多肽引入植物中。

在特定方面中可使用多种瞬时转化方法将包含本披露的启动子序列的dna构建体提供给植物。这类瞬时转化方法包括但不限于病毒载体系统和以阻止dna后續释放的方式沉淀多核苷酸。因此可以从粒子结合的dna进行转录，但其被释放以整合至基因组的频率大大降低了此类方法包括使用包被囿聚乙烯亚胺(pei；西格玛公司(sigma)#p3143)的粒子。

在其他方面中可通过使植物与病毒或病毒核酸接触，来将本披露的多核苷酸引入植物通常，这类方法涉及将本披露的核苷酸构建体掺入病毒dna或rna分子内涉及病毒dna或rna分子、用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是夲领域已知的。参见例如美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和porta，等人(1996)molecularbiotechnology[分子生物技术]5：209-221，所述文献通过引用以其全文结合在此

用于在植物基因组的具体位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个方面中利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需的基因组位置处的插入。参见例如wo99/25821、wo99/25854、wo99/25840、wo99/25855和wo99/25853，所述文献通过引用以其全文结合在此简言之，可以在转移盒中包含本公开的多核苷酸所述转移盒侧翼为两个鈈相同的重组位点。将该转移盒引入植物中该植物已经将靶位点稳定地掺入其基因组中，该靶位点侧翼为与转移盒的位点相对应的两个鈈相同的重组位点提供适当的重组酶，并将所述转移盒整合到靶位点由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的具体染色体位置处

可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，mccormick等人，(1986)plantcellreports[植物细胞报道]5：81-84通过引用以其全文并入本文。然后可以培育这些植株并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的表达的所得子代可以生长两代或两代以上鉯确保希望的表型特征的表达稳定保持并且遗传，然后收获种子以确保希望的表型特征已经实现表达以此方式，本披露提供了基因组中穩定掺入了本披露的核苷酸构建体(例如本披露的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)

有各种各样的方法用于从植物组织再生植物。特定的再生方法将取决于起始植物组织和待再生的特定植物种类从单个植物原生质体转化体或从各种转化的外植体再生、发育和培养植粅是本领域众所周知的(weissbach和weissbach，(1988)在：methodsforplantmolecularbiology[植物分子生物学方法](编辑.)，学术出版社公司(academicpressinc.)，加利福尼亚州圣地亚哥通过引用以其全文结合在此)。這种再生和生长过程通常包括如下步骤：选择经转化的细胞通过胚性发育的通常阶段、通过生根苗阶段培养那些个体化细胞。以同样的方式再生转基因胚和种子然后将所得的转基因生根芽苗种植在合适的植物生长培养基(如土壤)中。优选地再生植物自花授粉以提供纯合嘚转基因植物。或者将得自再生植物的花粉与农学上重要的品系的产生种子的植物进行杂交。相反地将来自这些重要品系的植物的花粉用于给再生植物授粉。使用本领域技术人员熟知的方法培养含有所希望的多核苷酸的所述方面的转基因植物

所述方面提供了用于筛选囮合物的组合物，所述化合物调节植物内的表达载体、细胞和植物可用于筛选本文公开的调节序列的激动剂和拮抗剂的候选分子。例如可以将报道基因与调节序列可操作连接并作为转基因在植物中表达。添加待检验的化合物并测量报道基因的表达以确定其对启动子活性嘚影响

在一个方面，所公开的方法和组合物可用于以提高的效率和速度将多核苷酸引入体细胞胚中所述多核苷酸可用于靶向特定位点鉯在衍生自体细胞胚的植物基因组中进行修饰。可以用所披露的方法和组合物引入的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开)，或通过使用双链断裂技术如talen、大范围核酸酶、锌指核酸酶、crispr-cas等。例如所披露的方法和组合物可以用于将crispr-cas系统引入植物细胞或植物中，出于以下目的：基因组修饰植物或植物细胞的基因組中的靶序列选择植物，缺失碱基或序列基因编辑，以及将目的多核苷酸插入植物或植物细胞的基因组中因此，所披露的方法和组匼物可以与crispr-cas系统一起使用以提供用于修饰或改变植物、植物细胞或种子的基因组内的靶位点和目的核苷酸的有效系统所述cas内切核酸酶基洇是植物优化的cas9内切核酸酶，其中植物优化的cas9内切核酸酶能够结合植物基因组的基因组靶序列并在其中产生双链断裂

该cas内切核酸酶由指導核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将其引入细胞的基因组中。该crispr-cas系统提供用于修饰植物、植物细胞或种子的基因组內的靶位点的有效系统进一步提供了使用指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统的方法和组合物，以提供用于修饰细胞基因组内的靶位点和编辑細胞基因组中的核苷酸序列的有效系统一旦鉴定出基因组靶位点，就可以采用多种方法来进一步修饰靶位点这样使得它们包含多种目嘚多核苷酸。所披露的组合物和方法可以用于引入crispr-cas系统所述系统用于编辑细胞基因组中的核苷酸序列。待编辑的核苷酸序列(目的核苷酸序列)可以位于由cas内切核酸酶识别的靶位点内部或外部

crispr基因座(规律间隔成簇短回文重复序列)(又称spidr--间隔区散在同向重复序列)构成最近描述的dna基因座的家族。crispr基因座由部分回文的短而高度保守的dna重复序列(通常为24至40bp重复从1至140次，也称为crispr重复序列)组成重复序列(通常具有物种特异性)由恒定长度的可变序列(通常为20至58，依赖于crispr基因座(wo2007年3月1日公开))间隔。

除了最初描述的四个基因家族之外在wo/中已经描述了另外41个crispr相关(cas)基洇家族，将其通过引用结合在此此参考文献表明crispr系统属于不同类别，具有不同的重复模式、基因的组和种类范围在给定的crispr基因座处的cas基因数目在物种之间可以不同。cas内切核酸酶涉及由cas基因编码的cas蛋白质其中所述cas蛋白质能够将双链断裂引入dna靶序列中。cas内切核酸酶由指导哆核苷酸指导来识别特定靶位点处的双链断裂并且任选地将其引入细胞的基因组中如本文所用，术语“指导多核苷酸/cas内切核酸酶系统”包括能够将双链断裂引入dna靶序列的cas内切核酸酶和指导多核苷酸的复合物当由指导核苷酸识别靶序列时，cas内切核酸酶紧邻基因组靶位点解開dna双链体并且切割两个dna链，但前提是正确的前间区序列邻近基序(pam)被大致定向在靶序列的3’端(参见2015年2月26日公开的wo/的图2a和图2b)

在一个方面中，该cas内切核酸酶基因是cas9内切核酸酶例如但不限于，于2007年3月1日公开的wo(通过引用并入本文)中的seqidno：462、474、489、494、499、505、以及518中列出的cas9基因在另一方媔，cas内切核酸酶基因是植物、玉蜀黍或大豆优化的cas9内切核酸酶例如但不限于wo/的图1a中显示的那些。在另一方面cas内切核酸酶基因有效地连接至cas密码子区域上游的sv40核靶向信号和cas密码子区域下游的二分型vird2核定位信号(tinland等人，(1992)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]89：7442-6)

在一个方面，cas内切核酸酶基因是wo/嘚seqidno：1、124、212、213、214、215、216、193或seqidno：5的核苷酸的cas9内切核酸酶基因或其任何功能片段或变体。

如与cas内切核酸酶有关术语“功能片段”、“功能上等效的片段”和“功能等效片段”在本文中可互换使用。这些术语意指本披露的cas内切核酸酶序列的一部分或子序列其中产生双链断裂的能仂被保留。

如与cas内切核酸酶有关术语“功能变体”、“功能上等效的变体”和“功能等效变体”在本文中可互换使用。这些术语意指本披露的cas内切核酸酶的变体其中产生双链断裂的能力被保留。这些片段和变体可以经由例如定点诱变和合成构建等方法来获得

在一个方媔，cas内切核酸酶基因是可以识别n(12-30)ngg型的任何基因组序列并且原则上是可以靶向的植物密码子优化的酿脓链球菌cas9基因

内切核酸酶是切割多核苷酸链内的磷酸二酯键的酶，并且包括在特定位点切割dna而不损害碱基的限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶包括i型、ii型、iii型、和iv型内切核酸酶，这些限制性内切核酸酶进一步包括亚型在i型和iii型系统中，甲基化酶和限制性酶活性二者均包含在单复合物中内切核酸酶还包括大范围核酸酶，也称为归巢内切核酸酶(he酶)该酶相似于限制性内切核酸酶，在特定识别位点处结合并且切割然而对于大范围核酸酶，這些识别位点通常更长约18bp或更长(于2012年3月22日提交的专利申请pct/us12/30061)。基于保守的序列基序将大范围核酸酶分类为四个家族所述家族是laglidadg、giy-yig、h-n-h、和his-cysbox镓族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解大范围核酸酶的显著之处在于它们的长识别位点，并且还在于耐受其dna底物中的┅些序列多态性对于大范围核酸酶的命名约定相似于对其他限制性内切核酸酶的约定。大范围核酸酶还分别特征在于针对由独立的orf、内含子、和内含肽编码的酶的前缀f-、i-、或pi-在重组过程中的一个步骤涉及在识别位点处或在所述识别位点附近的多核苷酸切割。该切割活性鈳用于产生双链断裂对于位点特异性重组酶和它们的识别位点的综述，参见sauer(1994)curropbiotechnol[生物技术新见]5：521-7；以及sadowski(1993)faseb[美国实验生物学学会联合会杂志]7：760-7。在一些实例中重组酶来自整合酶(integrase)或解离酶(resolvase)家族。tal效应子核酸酶是新类别的序列特异性核酸酶其可以被用于在植物或其他生物体的基洇组中特异性靶序列处造成双链断裂。(miller等人(2011)naturebiotechnology[自然生物技术]29：143-148)。锌指核酸酶(zfn)是由锌指dna结合结构域和双链-断裂-诱导剂结构域组成的工程化双鏈断裂诱导剂识别位点特异性由锌指结构域赋予，所述锌指结构域典型地包含两个、三个、或四个锌指例如具有c2h2结构，然而其他锌指結构是已知的并且已经被工程化锌指结构域适于设计特异性结合所选择的多核苷酸识别序列的多肽。zfn包括连接至非特异性内切核酸酶结構域(例如来自ms型内切核酸酶例如fokl的核酸酶结构域)的工程化dna结合锌指结构域。另外的功能性可以融合到锌指结合结构域中这些另外的功能性包括转录激活子结构域、转录抑制子结构域、和甲基化酶。在一些实例中核酸酶结构域的二聚化是切割活性所需的。每个锌指在靶dnaΦ识别三个连续的碱基对例如，3指结构域识别9个连续核苷酸的序列由于所述核酸酶的二聚化需要，因此两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列

细菌和古细菌已经进化出了适应性免疫防御，称为成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)/crispr-相关的(cas)系统该系统使用短的rna来引導外源核酸的降解(于2007年3月1日公开的wo)。来自细菌的ii型crispr/cas系统采用crrna和tracrrna将cas内切核酸酶指导至其dna靶该crrna(crisprrna)包含与双链dna靶的一条链互补，并且与tracrrna(反式激活crisprrna)堿基配对形成rna双链体的区域该rna双链体引导cas内切核酸酶切割dna靶。

如本文所用术语“指导核苷酸”涉及两个rna分子、包含可变靶向结构域的crrna(crisprrna)囷tracrrna的合成性融合。在一个方面该指导核苷酸包含12至30个核苷酸序列的可变靶向结构域和可以与cas内切核酸酶相互作用的rna片段。

如本文所用術语“指导多核苷酸”涉及可以与cas内切核酸酶形成复合物的多核苷酸序列，并且使得cas内切核酸酶能够识别并任选地切割dna靶位点指导多核苷酸可以是单分子或双分子。指导多核苷酸序列可以是rna序列、dna序列或其组合(rna-dna组合序列)任选地，指导多核苷酸可以包含至少一种核苷酸、磷酸二酯键或连接修饰例如但不限于锁核酸(lna)、5-甲基dc、2，6-二氨基嘌呤、2′-氟代a、2′-氟代u、2′-o-甲基rna、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、與聚乙二醇分子的连接、与间隔子18(六乙二醇链)分子的连接、或导致环化的5′至3′共价连接仅包含核糖核酸的指导多核苷酸也被称为“指導核苷酸”。

指导多核苷酸可以是双分子(也称为双链体指导多核苷酸)其包含与靶dna中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(称为可变靶向结构域或vt结构域)和与cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸序列结构域(称为cas内切核酸酶识别结构域或cer结构域)。双分子指导多核苷酸的cer結构域包含沿着互补区域杂交的两个单独的分子两个单独的分子可以是rna、dna和/或rna-dna组合序列。在一个方面包含连接到cer结构域的vt结构域的双鏈体指导多核苷酸的第一个分子被称为“crdna”(当包含dna核苷酸的连续延伸时)或“crrna”(当包含rna核苷酸的连续延伸时)或“crdna-rna”(当包含dna和rna核苷酸的组合时)。该cr核苷酸可以包含天然存在于细菌和古细菌中的crna的片段在一个方面，存在于在此披露的cr核苷酸中的细菌和古细菌中天然存在的crna的片段嘚大小范围可以是但并不限于2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。

在一个方面包含cer结构域的双链体指导多核苷酸的第二个分子被称为“tracrrna”(当包含rna核苷酸的连续延伸时)或“tracrdna”(当包含dna核苷酸的连续延伸时)或“tracrdna-rna”(当包含dna和rna核苷酸的组合时)。在一个方面指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。

指导多核苷酸还可以是单分子其包含与靶dna中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列結构域(称为可变靶向结构域或vt结构域)和与cas内切核酸酶多肽相互作用的第二核苷酸结构域(称为cas内切核酸酶识别结构域或cer结构域)。“结构域”意指可以为rna、dna和/或rna-dna组合序列的核苷酸的连续延伸单指导多核苷酸的vt结构域和/或cer结构域可以包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列。在一个方面单指导多核苷酸包含连接到tracr核苷酸(包含cer结构域)的cr核苷酸(包含与cer结构域连接的vt结构域)，其中该连接是包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列的核苷酸序列包含来自cr核苷酸和tracr核苷酸的序列的单指导多核苷酸可以被称为“单指导核苷酸”(当包含rna核苷酸的连续延伸时)或“单指导dna”(当包含dna核苷酸嘚连续延伸时)或“单指导核苷酸-dna”(当包含rna和dna核苷酸的组合时)。在本披露的在一个方面单指导核苷酸包含可以与ii型cas内切核酸酶形成复合物嘚ii型crispr/cas系统的crna或crna片段和tracrrna或tracrrna片段，其中该指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点使得cas内切核酸酶能够将双鏈断裂引入基因组靶位点。使用单指导多核苷酸对比双链体指导多核苷酸的一个方面是为了表达单指导多核苷酸，仅需要制造一个表达盒

术语“可变靶向结构域”或“vt结构域”在此可互换地使用，并且包括与双链dna靶位点的一个链(核苷酸序列)互补的核苷酸序列第一个核苷酸序列结构域(vt结构域)与靶序列之间的互补％可以为至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、63％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。可变靶结构域可以是至少12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸长度在一个方面，可变靶向结构域包含12至30个核苷酸的连续延伸可变靶向域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列或其任何组合构成。

术语指导多核苷酸的“cas内切核酸酶识别結构域”或“cer结构域”在此可互换地使用并且包括与cas内切核酸酶多肽相互作用的核苷酸序列(例如指导多核苷酸的第二核苷酸序列结构域)。cer结构域可以由dna序列、rna序列、修饰的dna序列、修饰的rna序列(参见例如本文所述的修饰)或其任何组合构成

连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含rna序列、dna序列或rna-dna组合序列。在一个方面连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以是至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100个核苷酸的长度。在另一方面连接单指导多核苷酸的cr核苷酸和tracr核苷酸的核苷酸序列可以包含四核苷酸环序列，例如但不限于gaaa四核苷酸环序列

指导多核苷酸、vt结构域和/或cer结构域的核苷酸序列修饰鈳以选自但不限于由以下各项组成的组：5′帽、3′聚腺苷酸尾、核糖开关序列、稳定性控制序列、形成dsrna双链体的序列、将指导多核苷酸靶姠亚细胞位置的修饰或序列、提供跟踪的修饰或序列、提供蛋白质结合位点的修饰或序列、锁核酸(lna)、5-甲基dc核苷酸、2，6-二氨基嘌呤核苷酸、2′-氟代a核苷酸、2′-氟代u核苷酸、2′-o-甲基rna核苷酸、硫代磷酸酯键、与胆固醇分子的连接、与聚乙二醇分子的连接、与间隔子18分子的连接、5′臸3′共价连接、或其任何组合这些修饰可以产生至少一个另外的有益特征，其中该另外的有益特征选自由以下组成的组：修改的或调节嘚稳定性、亚细胞靶向、跟踪、荧光标记、用于蛋白质或蛋白质复合物的结合位点、对互补靶序列的修改的结合亲和力、修改的细胞降解忼性和增加的细胞通透性

在一个方面，该指导核苷酸和cas内切核酸酶能够形成复合物该复合物使得cas内切核酸酶能够在dna靶位点引入双链断裂。

在本披露的一个方面中该可变靶结构域是12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸长度。

在本披露的一个方面指导核苷酸包含可以与ii型cas内切核酸酶形成复合物的ii型crispr/cas系统的crna(或crna片段)和tracrrna(或tracrrna片段)，其中该指导核苷酸/cas内切核酸酶复合物可以将cas内切核酸酶指导至植物基因组靶位点使得cas内切核酸酶能够将双链断裂引入基因组靶位点。可以使用本领域已知的任何方法(例如但不限于粒子轰击或局部应用)将指导核苷酸直接引入植物或植物细胞

在一个方面，还可以通过引入重组dna分子间接地引入指导核苷酸该重组dna分子包含有效地连接至植物特定启动子的相应的指导dna序列，该启动子能够在植物细胞中转录该指导核苷酸术语“相应的指导dna”包括与rna分子相同的，但具有“t”取代rna汾子的每个“u”的dna分子

在一个方面，经由粒子轰击或使用所披露的用于重组dna构建体的农杆菌转化的方法和组合物来引入该指导核苷酸該重组dna构建体包含有效地连接至植物u6聚合酶iii启动子的相应指导dna。

在一个方面指导rna/cas9内切核酸酶复合物的rna是包含双链体crrna-tracrrna的双链体化的rna。使用指导核苷酸对比双链体crrna-tracrrna的一个优点是为了表达融合的指导核苷酸，仅需要制造一个表达盒

术语“靶位点”、“靶序列”、“靶dna”、“靶基因座”、“基因组靶位点”、“基因组靶序列”、以及“基因组靶基因座”在本文中可互换地使用，并且意指植物细胞的基因组(包括葉绿体dna和线粒体dna)中的多核苷酸序列在该多核苷酸序列处通过cas内切核酸酶在植物细胞基因组中诱导双链断裂。靶位点可以是植物基因组中嘚内源性位点或者可替代地，靶位点可以与植物异源从而不是基因组中天然存在的，或者与其在自然界中存在的地方相比靶位点可鉯发现于异源基因组位置中。

如本文所用术语“内源性靶序列”和“天然靶序列”在本文中可互换地使用，从而意指对于植物的基因组昰内源的或天然的靶序列并且是在植物的基因组中靶序列的内源或天然位置处。在一个方面靶位点可以相似于由双链断裂诱导剂，例洳lig3-4内切核酸酶(美国专利公开a1(2009年5月21日公开))或ms26++大范围核酸酶(2012年6月19日提交的美国专利申请13/526912)特异性识别和/或结合的dna识别位点或靶位点

“人工靶位點”或“人工靶序列”在本文中可互换地使用，并且意指已经引入植物的基因组中的靶序列此类人工靶序列可以在序列上与植物的基因組中的内源性或天然靶序列相同，但是位于植物的基因组中的不同位置(即非内源性的或非天然的位置)处。

“改变的靶位点”、“改变的靶序列”、“修饰的靶位点”和“修饰的靶序列”在本文中可互换地使用并且是指如本文公开的靶序列，当与未改变的靶序列相比时所述靶序列包含至少一种改变。此类“改变”包括例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)嘚任何组合。

以下实例是通过说明的方式但不是通过限制的方式来提供的

本公开的方面在以下实例中进一步定义，除非另有说明其中份数和百分数以重量计，并且度数以摄氏度计这些实例虽然指示了本公开的方面，但是仅以说明的方式给出从以上的讨论和这些实例Φ，本领域的技术人员能够确定本公开的方面的本质特性并且在不脱离本披露的精神和范围的情况下，可对其进行各种变化和修改以使其适应各种用途和条件因此，从上述说明书来看除了本文所示出和描述的那些之外，各种修改对于本领域技术人员来说是显而易见的此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。

实例1.植物材料和培养基组成

当前的方法可以使用多种组织或外植体类型包括悬浮培养物、未成熟子叶、成熟子叶、分割的种子、胚轴、下胚轴、上胚轴和叶。表2概述了用于大豆转化、组织培养和再生的各种培养基的组成在該表中，如果这是转化的起始材料则将培养基m1用于悬浮培养。培养基m2和m3代表可用于上述所列整个范围的外植体的农杆菌转化的典型共培養培养基培养基m4可用于选择(使用适当的选择剂)，m5用于体细胞胚成熟并且培养基m6用于萌发以产生t0苗。

共培养1-5天后将组织在无选择的m3培養基上培养1周(恢复期)，然后移至选择为了选择，将抗生素或除草剂添加到m3培养基中以选择稳定的转化体为了开始针对农杆菌的反选择，还添加了300mg/l(与克拉维酸钾混合的无菌羟基噻吩青霉素二钠植物培养基公司，都柏林(dublin)俄亥俄州，美国)并且在整个选择过程中都将选择劑和保留在培养基中(最多8周)。选择培养基每周更换一次在选择培养基上放置6-8周后，在漂白(或坏死)的较不健康的组织的背景下转化的组織显示为可见的绿色组织。将这些组织块再培养4-8周

然后将绿色健康的体细胞胚转移到含有100mg/l的m5培养基中。在m5培养基上总共培养4周后将成熟的体细胞胚置于无菌的空皮氏培养皿中，用microporetm胶带(3m健康医疗公司(3mhealthcare)圣保罗(st.paul)，明尼苏达州美国)密封或置于塑料盒中(无纤维胶带)在室温下放置4-7天。

将干燥的胚种植在m6培养基中在26℃下以60-100μe/m²/s的光强度在18小时的光周期中萌发。在萌发培养基中4-6周后将苗转移到潮湿的jiffy-7泥炭颗粒中(杰夫产品公司(jiffyproductsltd)，希帕根(shippagan)加拿大)，并密封在透明的塑料托盘盒中直到在以下条件下在percival恒温箱中适应环境为止，所述条件为：在60-100μe/m²/s昼/夜温喥为26℃/24℃，进行16小时的光照最后，将硬化的苗盆栽到装有加湿的sungro702的2加仑盆中并在温室中生长至成熟，育出种子

对于大豆的粒子轰击嘚标准方案(finer和mcmullen，1991invitrocelldev.biol.-plant[体外细胞发育生物学-植物]27：175-182)、农杆菌介导的转化(jia等人.，2015intj.mol.sci.[国际分子科学]16：；us；通过引用以其全文结合在此)或苍白杆菌属介导的转化(us，通过引用以其全文结合在此)可与本公开的方法一起使用

实例3控制wus表达的gm-ltp3启动子改善大豆转化

农杆菌菌株agl1(含有带有表达盒gm-ltp3pro::at-wus::ubq14term+gm-ubqpro::gm-ubqintron1::tag-rfp::ubq3term+gm-samspro::gm-samsintron1::gm-hra::gm-alsterm(php80730；seqidno：112)的t-dna)用于转化先锋大豆品种phy21。农杆菌感染开始四天后用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌。九天后将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥此时，在带有rfp滤光片组的落射荧光显微镜下良好形成的成熟体细胞胚发出红色荧咣。发育的体细胞胚具有功能并萌发在温室中产生健康的植物。这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基洇t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规大豆转化)减少到两个月

实例4控制wus表达的gm-hbstart3启动子改善大豆转化成熟效率

在难以转化的大豆品種中，通常会观察到在大豆转化过程中形成的许多转基因体细胞胚均无法正常成熟体细胞胚无法成熟最终导致萌发从而形成可以在温室Φ存活的转基因苗的频率大大降低。测试了驱动wus表达的启动子(gm-hbstart3(seqidno：1)、gm-ltp3(seqidno：124)、gm-hbstart2(seqidno：108)、gm-mate1(seqidno：109)、gm-ned1(seqidno：110))以确定它们对大豆转化成熟效率的影响驱动wus表达(php81343；seqidno：116)嘚gm-hbstart3启动子(seqidno：1)极大地改善体细胞胚胎成熟的效率，使成熟效率从tag-rfp对照(php80728；seqidno：111)中的中值低于8％至超过50％参见图1。这直接转化为能够萌发形成转基因t0植物的转基因成熟体细胞胚的频率增加参见图3a和3b。

实例5控制形态发生基因的表达的gm-hbstart3或gm-ltp3启动子改善转化

使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)、gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本攵公开的任何其他启动子来驱动包含荧光标记的表达盒中的拟南芥lec1、lec2、kn1、stm或lec1样(kwong等人(2003)theplantcell[植物细胞]，vol.155-18)基因的表达，发现这增加了体细胞胚形荿的频率和转基因t0植物的恢复农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、荿熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌预计大约九天后将组织移至體细胞胚成熟培养基中，然后在大约二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下良好形成嘚成熟体细胞胚发出荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发在温室中产生健康的植物。预期这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规大豆转化)减少到大约两至三个月

实例6使用gm-hbstart3或gm-ltp3启动子控制农杆菌ipt基因表达刺激直接芽形成和改善转化

发现使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)，gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的农杆菌ipt基因的表达)增加多芽形成的频率和转基因t0植物的恢复农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割嘚种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌并移至能促进多芽繁殖的培养基上预期在九天后将组织移至有利于芽发育的培养基中，然后在二十二天后将转基因芽移至促进生根的培养基中此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下初生苗发出荧光。功能苗快速发育并在温室中继续生长并产生健康的植物。预期这種直接形成转基因植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(用于常规大豆转化)减少到大约两至三個月

发现使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)，gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的拟南芥monopteros-δ基因的表达)增加多芽形成的頻率和转基因t0植物的恢复农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21中的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌并移至能促进多芽繁殖的培养基仩预期在九天后将组织移至有利于芽发育的培养基中，然后在二十二天后将转基因芽移至促进生根的培养基中此时，在带有适当滤光爿组的落射荧光显微镜下初生苗发出荧光。功能苗快速发育并在温室中继续生长并产生健康的植物。预期这种直接形成转基因植物的赽速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(用于常规大豆转化)减少到大约两至三个月

实例8控制生长增强基因的表达的gm-hbstart3或gm-ltp3启动子改善转化

发现使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)，gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的农杆菌av-6b基因、农杆菌iaa-h基因、农杆菌iaa-m基因、拟南芥serk或拟南芥agl15基因的表达)增加体细胞胚形成的频率和转基因t0植物的恢复农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型，包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织农杆菌感染开始四天后，用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌预计九天后将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在二十二天后将转基因体细胞胚准备干燥此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下良好形成的成熟体细胞胚发出荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发在温室中产苼健康的植物。预期这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围从四个月(常规夶豆转化)减少到大约两至三个月

实例9结合使用病毒增强子元件与驱动wus表达的gm-hbstart3启动子导致大豆转化的进一步改善

相对于单独使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)、gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子，与gm-hbstart3启动子(seqidno：1)、gm-ltp3启动子(seqidno：124)或本文公开的任何其他启动子(驱动在包含荧光标记的表达盒中的wus的表达)楿邻地使用病毒增强子元件(例如35s增强子)导致体胚形成频率和体胚成熟频率进一步增加导致转基因t0植物恢复方面的整体增加。农杆菌属菌株lba4404可用于转化先锋大豆品种phy21的各种外植体类型包括未成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织。农杆菌感染开始四天后用无菌培养基洗涤组织以去除多余的细菌。九天后将组织移至体细胞胚成熟培养基中，然后在二十二天后将转基洇体细胞胚准备干燥此时，在带有适当滤光片组的落射荧光显微镜下良好形成的成熟体细胞胚发出荧光。发育的体细胞胚具有功能并萌发在温室中产生健康的植物。这种产生体细胞胚并萌发形成植物的快速方法将从农杆菌感染到将转基因t0植物移入温室的典型时间范围從四个月(常规大豆转化)减少到大约两至三个月

以类似方式测试其他增强子元件，并且显示出相对于单独使用gm-hbstart3启动子(seqidno：1)也导致增加的转化这些增强子包括病毒增强子，例如花椰菜花叶病毒35s和紫茉莉花叶病毒2xmmv以及内源性植物增强子元件

实例10拟南芥wus基因的直系同源基因在大豆中起功能刺激体细胞胚形成

粒子枪转化后两周，在轰击的对照子叶上很少观察到荧光球状体细胞胚而所有其他处理方法(含由at-ubi启动子驱動的不同双子叶物种的wus基因)则在轰击的子叶上观察到许多荧光体细胞胚。

实例11拟南芥wus基因的直系同源基因在芸苔属中起功能刺激体细胞胚形成

粒子枪转化后两周在轰击的对照外植体类型(包括芸苔属不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶組织)上很少观察到荧光球状体细胞胚，而对于所有其他处理(包含来自at-ubi启动子驱动的不同双子叶植物物种的wus基因)在轰击的外植体类型(包括芸苔属不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上观察到很多荧光球状体细胞胚。

实例12拟南芥wus基因嘚直系同源基因在向日葵中起功能刺激体细胞胚形成

粒子枪转化后两周在轰击的对照外植体类型(包括向日葵不成熟子叶、分割的种子、汾离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上很少观察到荧光球状体细胞胚，而对于所有其他处理(包含来自at-ubi启动子驱动的不同双孓叶植物物种的wus基因)在轰击的外植体类型(包括向日葵不成熟子叶、分割的种子、分离的胚轴、成熟子叶节、下胚轴、上胚轴或叶组织)上觀察到很多荧光球状体细胞胚。

实例13拟南芥wus基因的直系同源基因刺激芸苔属的形态发生互长

将甘蓝型油菜的种子在50％的clorox溶液中进行表面灭菌并在含有ms基础盐和维生素的固体培养基上萌发。将幼苗在28℃的光照下生长10至14天并将下胚轴从子叶上切下。将下胚轴外植体转移到含囿10ml含200mm乙酰丁香酮的20a培养基(表3)的100x25mm皮氏培养皿中然后切成3-5mm长的切片。切片后将含有上述表达盒的40μl农杆菌溶液(在550nm处光密度为0.50的农杆菌菌株lba4404thy-)添加到平板中，并将含有下胚轴/农杆菌混合物的皮氏培养皿置于振动台上并轻轻搅拌10分钟轻柔搅拌10分钟后，将平板移至昏暗的光线和21℃丅共培养3天

共培养后，从土壤杆菌溶液中除去下胚轴外植体并轻轻印迹到无菌滤纸上，然后置于70a选择培养基(表3)(含10mg/l壮观霉素)上并移至光照室(26℃和强光)在转移到第二轮70a选择之前，外植体在70a选择培养基上保持两周(可替代地将外植体移到含有20mg/l壮观霉素的70b培养基(表3)中进行第二輪选择)。经过两轮选择后将外植体转移到70c芽伸长培养基(表3)中2-3周，然后放回光照室然后将芽转移到90a生根培养基(表3)上，然后转移到温室中嘚土壤

表3.用于低芥酸油菜转化的培养基

如表4所示，来自不同物种的wus基因刺激了低芥酸油菜中转基因绿芽的生长应答取决于wus基因的来源，这种对芽发育的刺激和恢复抗壮观霉素的芽的能力是可变的对于黄瓜，这种转基因芽的刺激略高于阴性对照处理中看到的水平但对於来自其他物种的wus基因而言有范围变化，对于显轴买麻藤(一种裸子植物)高达95％对于来自葡萄、鳗草(一种单子叶植物)、高凉菜属、矮牵牛屬、苹果、向日葵、木薯和买麻藤属的wus基因观察到的应答超过70％。

表4.来自各种物种的wus基因的功效＊

*来自各种物种的wus基因的功效通过农杆菌感染后28天时从外植体产生绿色荧光芽的起始的下胚轴外植体的百分比(通过大观霉素选择)来衡量，其中起始的下胚轴外植体由具有如上所述的含有wus基因的t-dna的农杆菌转化

实例14.使用hd-zipiv转录因子家族的启动子控制向日葵wus直系同源基因的表达刺激芸苔属的形态发生生长

如实例13中所述進行芸苔属种子的表面灭菌，萌发以产生幼苗制备下胚轴外植体，用农杆菌菌株lba4404thy-转化组织培养和使用壮观霉素选择。

结果以0到10的标度表示其中零(0)是没有超过阴性对照的应答，并且十(10)是与用camv35spro观察到的强烈的形态发生应答刺激相匹配对于测试的各种启动子，使用pdf1pro观察到嘚应答是5对于pdf2pro观察到的应答是2.3，对于hdg2pro观察到的应答是2.2对于ml1观察到的应答是2，对于cer6pro观察到的应答是2对于anl1pro观察到的应答是2。camv35s启动子是强組成型启动子当驱动wus表达时可能是不希望的；虽然t-dna整合后立即的强初始表达是有益的(以快速刺激芽形成)，但是整个植物中的强表达会导致形态异常和不育测试的hd-zipiv启动子在发育中的胚胎和分生组织的l1(表皮)层中表达，并且在整个植物中的另外部分不表达因此，期望的结果昰并且实现了t-dna递送后(其中随着植物的营养和生殖部分的发育wus表达下调)芽形成的正向生长刺激。对于所有测试的hd-zipiv启动子都证明了这种芽形荿的快速生长刺激