人外周血单个核细胞（PBMC）的分离
第四章&& 免疫细胞的分离、纯化和鉴定
&&&&&&&&&&&
第一节&&& 免疫细胞的分离、纯化技术
各种免疫细胞的分工与协作，共同完成免疫应答及其调控，因此，各种免疫细胞的分离及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞分离的方法有很多，主要是根据细胞的理化性状、功能，以及细胞表面标志等的差异而设计的。粘附分离法、尼龙毛柱分离法、羰基铁分离法等主要根据细胞的属性（如粘附）和功能不同，旨在将粘附和非粘附或粘附力较小的细胞分离开。有人证实免疫细胞在玻璃或塑料平面上的粘附能力分别为：巨噬细胞或单核细胞＞树突状细胞=抗体产生细胞＞B淋巴细胞＞T淋巴细胞=红细胞。粘附的细胞可通过trypsin洗脱而收集。葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法和Percoll不连续密度梯度离心法等是根据细胞的大小及比重的差异进行细胞分离。E花环沉淀分离技术主要是利用细胞表面标志进行细胞分离。尚可利用特异性单克隆抗体结合其它技术分选细胞，如补体细胞毒分离法，洗淘分离法（panning）、流式细胞术分离法，以及免疫磁珠法分离细胞技术等。一般应根据实验的目的及所需细胞的种类、纯度及数量等要求来确定采用何种方法。
实验一& Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞（PBMC）
外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell,PBMC）的分离是免疫学研究中的一项基本技术。目前国内外分离PBMC的常用方法是葡聚糖-泛影葡胺密度梯度离心法（ficoll-hypaque density gradient centrifugation），用此方法分离PBMC纯度可达95％，淋巴细胞约占90％，其中T淋巴细胞占80％，B淋巴细胞占4～10％。ficoll-hypaque混合溶液，又称淋巴细胞分层液，在分离人PBMC时，要求其比重为1.077；分离小鼠单个核细胞时比重为1.080；分离大鼠单个核细胞时比重为1.084～1.087；分离马单个核细胞时比重为1.090。
血液中各有形成分的比重存在差异，利用比重为1.077、近于等渗的ficoll-hypaque混合溶液（又称淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层液的上部；红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部；PBMC密度稍低于分层液，故位于分层液界面上，这样就可获得PBMC。
&&& 【器材与试剂】
&& &1.刻度离心管、吸管、试管、毛细吸管、橡皮乳头、载玻片、盖玻片、离心机等。
&&& 2.pH7.2 Hanks液、肝素、生理盐水溶液，淋巴细胞分层液。
&& &【方法】
1.静脉取血2ml，加入含肝素溶液(10～50u／m1血样本)的试管中，混匀，使血液抗
凝。用pH7.2
Hanks液将抗凝血稀释1倍。
2.吸取2ml淋巴细胞分层液置于刻度离心管中，然后将离心管倾斜45O角，用毛细滴管将稀释的全血沿管壁缓慢加至分离液上面，应注意保持两者界面清晰。
3.在18℃～20℃下，用水平离心机以2000r/min离心20min。离心后细胞分布如图。
图4-1& 离心前、后分层情况
&& &4.用毛细吸管轻轻插到混浊带，沿管壁轻轻吸出此层细胞，移入另一支离心管中。即要吸取所有单个核细胞，又要避免吸取过多的分层液或血浆，以免混入其他细胞成分。
5.用Hanks液洗涤细胞3次。第一次2000r/min ，10
min；第2～3 次1500r/min ，10 min，可去掉大部分混杂的血小板。
6.将沉淀细胞悬于培养基中备用。
&& &&&&&【注意事项】
&& &1、实验所用玻璃器皿应该洁净。如果制备的单个核细胞悬液用于细胞培养时，上述操作过程都要在无菌条件下进行，所用器材、试剂都应为无菌。
&&& 2、实验中的细胞得率与室温及分层液比重等有关。分层液应避光4℃保存。
3、往淋巴细胞分层液中加入稀释全血时，不得将血液冲入分离液中，须保持两层液体的清晰界面。
实验二&& Percoll不连续密度梯度沉淀法分离纯化NK细胞
　　[原理]
Percoll是一种经聚乙烯吡喀烷酮(PVP)处理的硅胶颗粒，是一种新型密度梯度离心分离剂。渗透压很低(&20mosm／kg H２O), 粘度也很小，可形成高达1.3g／ml密度，采用预先形成的密度梯度时可在低离心力(200～1000g)于数分至数十分钟内达到满意的细胞分离结果。由于Percoll扩散常数低，所形成的梯度十分稳定。此外，Percoll不穿透生物膜，对细胞无毒害，因此广泛用于分离细胞、亚细胞成分、细菌及病毒，还可将受损细胞及其碎片与完好的活细胞分离。
【器材与试剂】
&&&&& B淋巴细胞百分率= &&&&&&&&&&&&&&&&&&× 100％
&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&200
&&& 参考值：通常人外周血Smlg阳性细胞为8％～15％，骨髓为60％，胸导管为18％，淋巴结20.7％～25％，脾24％～35％，扁桃体为42.4％。
&&& 【注意事项】
&&& 1.为防止表面Ig游动、脱落，测定中应保持低温。同时，已荧光染色后的细胞应在短时间内固定检查，如超过半天则计数结果显著下降。
&&& 2.镜检时必须用油镜计数，仔细区别淋巴细胞与中性粒细胞、单核细胞。
实验八&& T细胞亚群分离技术
&&& 一、流式细胞仪分离法&&&
&&& 【原理】
&&& 根据待分离的免疫细胞膜表面抗原的不同，制备出相应的荧光标记抗体，分离前，首先将待分离细胞制成单细胞悬液，经相应的荧光标记抗体染色后，进入流式细胞仪。此细胞仪以激光为光源，通过高速流动系统将样品中的细胞排列成行，一个一个地从流动室喷嘴处流出，形成细胞液柱。液柱与高速聚焦的激光束垂直相交，细胞受到激光激发后产生散射光并发射荧光，由光电倍增管接收光信号并转化成脉冲信号，数据经电脑处理，分辨出细胞的类型，并对各类型分别计数和统计。同时，细胞根据其表面的电荷使液滴瞬间感应相应的带电性，然后在电场的偏转作用下进入不同的收集管，从而将各种免疫细胞分离。
&&& 用FACS(流式细胞仪)分离细胞准确快速，分选纯度高（为99%），不损伤细胞活性，可在无菌条件下进行，并可直接统计出各类细胞的相对含量。
& &&【器材与试剂】
&&& 1.抗CD3、CD4、CD8的单克隆抗体。&&&
&&& 2.FITC—羊抗鼠IgG。
&&& 3.正常小鼠IgG 。&&
&&& 4.细胞洗涤液(NaCl
8.47g，K2HPO4 4.11g，KH2PO4 1.36g，NaN3
0.1g，小牛血清20ml，加蒸馏水至1000m1)。
&&& 5.红细胞裂解液(KHCO3
1.0g，NH4C1 8.3g，EDTA
37mg，加蒸馏水至100ml)。
&&& 6.固定液(25％戊二醛3.2ml，葡萄糖2.0g，加无血清上述细胞洗涤液至100m1)。
7.肝素抗凝血。
8.离心机、流式细胞仪等。&&&
&&& 【方法】
&&& 1.取肝素抗凝血0．4ml，分别加入4支小试管中（其中3支为待测管，1支为对照管）各0.1ml。然后在各待测管中分别加入0.1ml抗CD3、CD4、CD8的单克隆抗体(1：1000稀释)，在对照管中加入0.1ml正常小鼠IgG，30℃ 孵育45min。
&&& 2.加入细胞洗涤液3ml，1000r／min，离心2min。以洗去未结合的抗体，重复洗2次。
&&& 3.摇匀管底沉淀细胞。加入0.1ml FITC-羊抗鼠IgG，30℃孵育45min。
&&& 4.加入红细胞裂解液3ml，见红细胞悬液变为真溶液时，立即以1000r／min离心2min。
&&& 5.弃血红蛋白上清液，用细胞洗涤液离心洗涤2次，每次1000r／min离心2min。
&&& 6.恢复体积至0.5ml，加入固定液20μl。&&&
&&& 7.上机检测。
&&& 【结果】
流式细胞仪的检测指标经计算机自动算出CD阳性细胞的百分率，并且将不同CD阳性细胞收集到不同试管进行分离。
&&& 二、间接免疫吸附分离法
&&& 【原理】
&&& 将总体T细胞与针对某种T细胞亚群的特异性鼠抗人单克隆抗体一起孵育，然后置入预先包被有羊抗鼠IgG的平皿中。此时结合有鼠抗人特异性抗体的T细胞亚群将被吸附在平皿中，而其他T细胞则不被吸附，由此即可将某一T细胞亚群从T细胞群体中分离出来。现介绍以抗CD8单克隆抗体将T细胞分为CD4+与CD8+细胞两大类的具体方法。
&&& 【器材与试剂】
&&& 1.羊抗鼠Ig。&&&
&&& 2.特异性鼠抗人CD8单克隆抗体或多抗。
&&& 3.15×100mm塑料平皿。
&&& 4.已纯化的T细胞悬液。
5.pH9.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液、5％小牛血清的PBS、1％小牛血清的PBS。
6.离心管、试管、吸管、离心机、倒置显微镜等。
&&& 【方法】
&&& 1.用pH9.5，0.05mol/L的Tris-HCl缓冲液稀释羊抗鼠Ig至10μg／m1，加10ml至平皿中，室温下孵育40min，或4℃下孵育24h，轻摇平皿使整个皿底均被抗体包被。（此平皿在4℃下可贮存1—2周。）
&&& 2.测定抗CD8单抗的最适使用浓度，并用PBS将抗CD8单抗稀释至该浓度。
&&& 3.将2×107～3×107个T细胞置于15ml离心管中，在4～10℃下，以1300r／min离心10min，弃上清后，将抗CD8单抗加至T细胞中，悬浮细胞置冰浴30min。
&&& 4.用吸管吸出平皿中未吸附的羊抗鼠Ig(可再用于包被平皿)，用含5％小牛血清的PBS 5～7ml洗涤平皿，轻轻摇动后吸出，重复洗涤3次。
&&& 5.将含5％小牛血清的PBS 5～10ml加至T细胞中，在4℃下，以1300r／min离心10min，弃上清，重复洗涤一次。用3ml上述液体悬浮T细胞。
6.将T细胞悬液倒入上述经洗涤后的平皿中，立即置4℃下孵育30min，取出后轻摇30s，继续在4℃下孵育30min。
&&& 7.用吸管将未吸附的细胞悬液轻轻吸出，用含1％小牛血清的PBS轻轻洗涤平皿，洗涤时将吸管尖嘴抵住平皿的边缘并缓慢滴加PBS，然后吸出，重复2～3次，将吸出的液体留置于另一试管中，以便分离未吸附的CD4+细胞。
&&& 8.在倒置显微镜下检查平皿，并对未吸附的残留细胞计数，继续洗涤，直至所有未吸附的CD4+细胞均被洗出。
&&& 9.在平皿中加入5～7ml含1％小牛血清的PBS，用无菌刮匙轻轻刮下吸附的CD8+细胞，重复2～3次，或者加入15ml上述液体，用吸管猛烈吹打，将吸附的CD8+细胞洗下。
&&& 10.分别将CD4+细胞与CD8+细胞悬液在4℃下，以1300r／min离心10min，弃一清液，用完全RPMI-1640悬浮细胞，计数并调整细胞至所需浓度。&&&
如果需提高细胞纯度，可再重复(7)～(9)步。497电玩，电视游戏玩家基地！
您的位置：
太极熊猫PVP巅峰对决怎么打_武神的搭配及运用攻略详解
太极熊猫PVP巅峰对决怎么打_武神的搭配及运用攻略详解
太极熊猫巅峰对决是玩家通过PVP决斗获得每日以及每周不同的奖励。武神是巅峰对决中的大热门，但是巅峰对决中武神究竟该怎么打呢？以下的攻略将为你详细研究武神在巅峰对决中的搭配和运用技巧
太极熊猫巅峰对决武神运用
巅峰中最幸福的是莫过于先把对手打出破防，这证明我们已经掌握了战斗的主动，对A我们是不怕的。破防之后，我们要做的并不是简简单单的白打对手几秒，我们需要在对手无法反击无法逃跑的情况下给对手造成最大伤害。
1、变汉克强杀，这个要注意变身是有个时间的，连击要连好，否则对手趁你变身就跑掉了，绝对是胜负逆转，汉克再想追人可就难了。一般来说，对方浮空之后，变身是比较有把握的，宝藏要注意：2技能打上天以后不要放最后一段，否则砸下来，卡了一个共CD，再变身，攻击，对方早就起身跑掉了。
2、开冰龙技能。冰龙和汉克都是在巅峰中兑换，冰龙技能是增加对破防状态下的敌人210%的伤害，也就是刀刀都是3倍伤害。3万多的暴击，打在对方身上10万。基本在一个破防的时间里打残对面是没什么太大问题。缺点就是只有5秒钟(应该是吧，楼主没有换冰龙，技能升级后增不增加持续时间就不知道了)。并且，由于和汉克一起兑换冲突，所以换的人并不多，不过，只换一个出来为那一下爆发还是不错的。
二、被破防
巅峰中最痛的事情莫过于被对方先打出破防，这证明我们已经失去了战斗的主动，对A我们是很虚的。被破防之后，对手要做的并不是简简单单打我们几秒，对手要在我们无法反击无法逃跑的情况下告诉我们挖掘机到底哪家最强。其实，被对方破防之后僵直状态下的我们除了要被对手天上飞地下滚的打，无法逃跑无法反击之外，我们是可以做一件除去强退游戏以外的事情&&切换武神。而武神可是会自动放技能的。
1、神牛&&没错，是那个四脚着地的神牛而不是那个已经进化出直立行走能力的怒炎。神牛的三技能很变态，晕眩三秒。当我们被对方破防的那一刹那，我们要做的就是切换神牛，让对方晕上三秒然后赶紧从地上滚起来有多远跑多远。除此之外，有类似功能的还有守护战神晕1秒，熊猫晕1秒等等，但是蛋疼的起身动画要求对手当然是晕的时间越长越好。
2、当对手打完我们一套，有相当一部分会选择离开一下，因为当我们起身之后他们是以半防面对我们全防，哪怕跑一跑，回上几点防御也是值得的。女娲，回血能力非常凶残的武神。技能5秒CD：每秒回复8%的血，持续2秒，也就是5秒16%。10秒可以开3次，48%。呵呵，当你的对手离开你在外面浪了一圈之后你的已经满了。
以上只是抛砖引玉，在破防和被破防的时候如何处理，大家打了这么久肯定都有自己的想法。最后再随便说说
1、只要打了几天就知道，被沉默要跑，对面开神牛破防要跑，对面变汉克了要跑。所以我们在做这些动作的时候，要选取恰当的时机。
2、宝藏的大招是一把双刃剑，虽然自己是几乎无敌状态，但是10刀面对多个目标时就会分散伤害，而且飞来飞去被普通攻击是会掉防御值，所以起手开大招效果是很差的。
3、对自己伤害有信心的战士们可以选择开场直接中路开大清对面武神，哪怕逼得对方不得不用某些濒死武神的武神技，那也是赚到了。
4、人人都能认出沉默，但是不一定都能认出皮特的模糊。模糊是个好技能8秒内提升闪避90点，这个90点说实话是不知道怎么算的，但是楼主开50点的闪避面对BOSS时是全部闪避，楼主也开过50点的闪避硬刚汉克无压力。有闪避，可以面对很多情况，打都打不中我怎么伤害我、控制我、僵直我? 可惜闪避套穿到极致好像也只有百分之五六十的闪避，不然人人百分之8090的闪避穿出来，只能呵呵了。
5、并不是每一条灵魂连接都值得激活，比如鞋子衣服，本身伤害非常低，加成了20的伤害灵魂连接也没几点，而灵魂祭坛的空位是很珍贵的，尤其对于混搭来讲。
6、金币十连性价比还是很高的，大中经验符、紫丹蓝丹都很不错，有闲钱可以抽个五六十万。
7、虽然战场说是优化了匹配规则，但还是很坑爹。不过因为是按战力匹配，大家可以试试降低战力进场，比如楼主就是一组：绿色的毒刹和沉默猫;二组，绿色皮特和汉克。毒杀技能开场就用掉，皮特是在变身汉克之前用。总之，这两个就是凑数的用来降低自己的战斗力以迎合低战斗力战场。
太极熊猫巅峰对决武神搭配
目前最主流的巅峰武神搭配就是第一排陈+牛，第二排汉克+皮特。相信很多玩家在晚上排巅峰的时候80%的对手都是用了这一武神组合，这一组合确实非常强。
1.全面的控制：陈的沉默和晕眩;牛的破防和眩晕;皮特的禁锢，减速和闪避，让这一武神组合兼具各方面的技能与优势，多元的控制技能也让这套武神组合能打出众多的Combo来获得比赛的胜利。
2.不俗的伤害：这一武神组合输出主要来源于汉克和牛，由于神牛的稀有技能可以尽快破防，同时破防后配合汉克变身后的高输出可以打出不俗的伤害。让这一武神组合在兼具控制的情况下也有一定的伤害。
3.万精油的组合：这一组合在打其他武神组合的时候都有一战之力，且任何套装装备能使用这组武神来进行巅峰对决，但核心特点不明显。
打法要点：利用好陈和牛的稀有技进行先手或反手的攻击，在对拼时开启皮特的闪避，利用汉克的变身进行爆发输出(具体打法需要随机应变)。
1.完美的克制：神枪手是这套武神组合最关键的一个点，由于神枪手稀有技(弹无虚发)最高增加50%的命中， 完美克制了皮特的稀有技，让皮特的稀有技丧失效果。同时较厚的血量保证了神枪手比皮特拥有更好的生存能力，在极限的对决中，武神最后关头的生存很多时候会改变比赛的战局。
2.稳定的输出：由于神枪手的稀有技CD较短且持续时间较长，几乎能将普通套装敌人所自带的闪避忽略，刀刀命中从而保持稳定且持续的输出。
3.局限性：只是较为克制带有皮特的武神组合，在对抗高爆发或极高闪避套的对手时效果欠佳。
打法要点：牛和陈依然是先手或反手的利器，同时带着神枪手稀有技变身汉克，保证自己的高伤害。神枪手稀有技冷却时间比皮特的冷却时间短很多，利用好这点来让他的皮特无处发挥
游戏下载排行
最新游戏更新
||商务合作||友情链接
CopyRight2014年-2015年
497电玩 All Rights Reserved
备案编号:沪ICP备号-3马铃薯病毒检测,马铃薯病毒病,马铃薯病毒检测方法,在线病毒检测,马铃薯病毒检测试..
扫扫二维码，随身浏览文档
手机或平板扫扫即可继续访问
马铃薯病毒检测
举报该文档为侵权文档。
举报该文档含有违规或不良信息。
反馈该文档无法正常浏览。
举报该文档为重复文档。
推荐理由：
将文档分享至：
分享完整地址
文档地址：
粘贴到BBS或博客
flash地址：
支持嵌入FLASH地址的网站使用
html代码：
&embed src='/DocinViewer-4.swf' width='100%' height='600' type=application/x-shockwave-flash ALLOWFULLSCREEN='true' ALLOWSCRIPTACCESS='always'&&/embed&
450px*300px480px*400px650px*490px
支持嵌入HTML代码的网站使用
您的内容已经提交成功
您所提交的内容需要审核后才能发布，请您等待！
3秒自动关闭窗口4.1戒律牧师PVP如何骗打断？_百度知道
4.1戒律牧师PVP如何骗打断？
戒律牧DK 加职业打33
提问者采纳
wlk曾经用牧师死骑术士组合打<img class="word-replace" src="/api/getdecpic?picenc=0af00+等级至于ctm嘛木听说许blz亲师些首先牧师要刻意骗打断种赌博容错率低jjc面千万要种想策使手打断技能落空需要意识运气面打断技能职业使用打断都选择：1见读条打断<img class="word-replace" src="/api/getdecpic?picenc=0ad等读<img class="word-replace" src="/api/getdecpic?picenc=0a006c655f/3再打断所骗打断种赌博已候按照规律骗打断吧说牧师别读条加血选择读条加血刻其实讲究：举例：面师候放读条呢师读条用奥术技能候候能马用反制CD看见师突取消读条必须立刻取消读条<img class="word-replace" src="/api/getdecpic?picenc=0ad616c%能要反制面盗贼血量高候玩玩读条读32再取消高端盗贼般交代脚踢技能知道候用脚踢纯属浪费能量考虑爆发轮压低血线牧师血量紧张情况要看盗贼能量盗贼能量没见底要冒读条推荐血线危险候冒骗脚踢用瞬发技能看能量读条吧盗贼用能量难压制高韧牧师血量术士反制宝宝身占CD所要刻刻ss操作宝宝两种情况种站位试牧师恐惧旦宝宝恐惧走点悲剧所牧师焦点术士宝宝拉术封锁距离再读条（具体几码我忘网查查）第二贴着牧师咬点简单恐惧走赶快能量灌注读条ss技能让宝宝解恐惧旦看ss用技能立刻取消读条说定骗反制职业都打断技能体牧师经能少打断经验外乎些距离走位看手选择等JJC内场要良利用各种形哦
其他类似问题
按默认排序
其他4条回答
骗打断自读条快五四打断灵专注般能骗打断技能加师盗贼错师腿牧师要抱
LR FS都可以吧，骗打断的话技能很多啊，看你跟什么等级的人打了。。。。。。
MS和DK的话加个CJQ或者LR FS都不错
LR挺暴力 对法系压制不错 FS强控 CJQ爆发 DK就多元化了 可辅助伤害可输出 贼法牧如果不是大神级的人物玩 什么组合都虐
骗打断一般都在读条读到30%的时候动一下 太快不好太慢也不好 每个职业打断都不一样
ZS一般喜欢读条读一半打断 DZ喜欢看见读条就打断 DK就喜欢读到80%在打断 当然 骗打断最好在50%以上
血在70%以上不用骗了 原地刷一口一般职业不会打断的
贼啊 贼DK 戒律牧
戒律牧师的相关知识
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁mu武器的PVP怎么弄的?_百度知道
mu武器的PVP怎么弄的?
我有更好的答案
按默认排序
1： 组合材料+4追4以上的380级武器或防具加一个 再生宝石、一个守护宝石、金（1千万金）2) 组合方法选择玛雅哥布林的‘添加属性’选项合成，增加物品属性就可以了。注：380级武器或防具的等级越高合成成功率越高。
+4追4以上的380级武器或防具 1件再生宝石 1个守护宝石 1个 好像+13的东西的合成成功率都只有50%不过请楼主放心失败了东西不会消失
一个在生宝石，一个守护宝石，一件＋4＋属性的380装备。在仙踪林找哥布林和。成功率80％，
其他类似问题
等待您来回答
下载知道APP
随时随地咨询
出门在外也不愁