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电泳凝胶回收方法全攻略
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LOFTER精选
本文转载自江中浪子
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历史上的今天
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blogTitle:'【转载】DNA胶回收实验中常见问题和解答',
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1、如何看待提取得率？
影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。&&&
2、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？',
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影响回收率的因素很多，如DNA片段大小、点样量、凝胶种类、电泳缓冲液的缓冲能力、切胶操作、紫外灯照射强度和时间、溶胶是否彻底等等，所以不能单凭1-2次的实验来判断其质量好坏，最好是多做几次实验或用几种不同品牌的产品做平行对照实验，结果相对真实。
2、用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？
1） 胶块溶解不完全，可适当延长时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；
2） 胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收；
3） 紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内；
4） 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率；
5） TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好；
6） 回收前的样品量太少，加大点样量；
7） 洗脱前，预先65℃预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。
3、如何计算提取率？
1) 回收前样品中，往往含有非目的DNA 片段、引物、dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率；
2) 可将回收前后DNA 片段一起电泳，使用系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比；
3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。
4、回收率为什么与点样量和片段大小有关？
DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。
5、如何简易测算提取率？
取胶回收后的DNA溶液体积的1/5&1/10，与等体积的回收前的DNA溶液的5-10倍稀释液一起电泳，肉眼观察回收后的条带相对于回收前条带的亮度，粗略测算回收率（如亮度只有一半时，其回收率可粗略为50%）。
6、加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？
1） 胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶；
2） 胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收；
3） 水浴温度是否达到规定温度65℃，用检测。
7、糖凝胶块不溶？
1） 糖质量不好；
2） 含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干躁，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4 ℃或-20℃；
3） 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
8、点样时发现DNA样品有漂出点样孔外的现象？
柱子上的乙醇未完全挥发干净，延长室温下空柱静置时间以确保乙醇完全挥发干净。
9、能否使用去离子水洗脱回收？
可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值＞7.0，以增加回收得率。
10、能否使用TE（PH8.0）洗脱？
11、可否使用小于30&l的洗脱液进行洗脱？
不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。
12、关于DNA片段大小与回收率的问题？
100bp-500bp，30-60%；500bp-4kb，80-95%；4kb以上，30-50%。
13、OD值与琼脂糖凝胶中的DNA产量不相符？
从柱子上洗脱下来的痕量杂质增加了A260的值。
14、吸光度纯度测定时应注意哪些问题？
吸光度测量的是未知样品与调零标准之间的相对吸光度，所以请用与洗脱液体相同的液体，对测量样品进行稀释和调零。
15、为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？
在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密的结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。
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易生物VIP企业推荐色氨酸作为必需的氨基酸之一，对于人和动物的生长发育及其新陈代谢都有着重要的意..
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大肠杆菌生物合成中心代谢途径的改造及其对工程菌色氨酸产量的影响
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3秒自动关闭窗口二、DNA电泳常见问题与对策
&1. DNA带模糊
1) &DNA降解：避免核酸酶污染；
&电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液；
&所用电泳条件不合适：电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30&#8451;；巨大DNA链电泳，温度应＜15&#8451;；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力；
4) &DNA上样量过多：减少凝胶中DNA上样量；
5) &DNA样含盐过高：电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐；
6) &有蛋白污染：电泳前酚抽提去除蛋白；
7) &DNA变性：电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。
2. 不规则DNA带迁移
1) &对于λ/Hind III片段cos位点复性
电泳前于65&#8451;加热DNA 5分钟，然后在冰上冷却5分钟；
&电泳条件不合适：电泳电压不超过20V/cm；温度＜30&#8451;；经常更换电泳缓冲液；
3) &DNA变性： 以20mM NaCl Buffer稀释DNA，电泳前勿加热。
3. 带弱或无DNA带
1) DNA的上样量不够：增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低；
2) &DNA降解：避免DNA的核酸酶污染；
3) &DNA走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度；
4) &对于EB染色的DNA，所用光源不合适：应用短波长（254nm）的紫外光源。
4. &DNA带缺失
1) &小DNA带走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度；
2) &分子大小相近的DNA带不易分辨：增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度；
3) &DNA 变性：电泳前请勿高温加热DNA链，以20mM NaCl
Buffer稀释DNA；
4) &DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适：在脉冲凝胶电泳上分析。
5. &DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？
1） 配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的。最好是同时配制.电泳时缓冲液高过液面1－2mm即可。
2） 电泳时电压过高，可以在电泳前15分钟用较低电压(3V/cm)，等条带出孔后比较漂亮了.然后再调电压。
3） 上样时尽量慢慢加样，等样品自然沉降后再加电压。
6. 做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？为什么？
有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。有经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实片段没有问题。也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可是PCR结果显示就是大小不一致。然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
三、 DNA回收常见问题分析与策略
没有回收到 DNA 片段
一点都不能得到产物的回收情况很少见，有些情况是判定回收效率的方式不对。如对，请检查一下Wash中有没有加入酒精；检查加入的DNA结合剂（Solution
S或Solution
SN）的量对不对；洗脱前有没有将残留得酒精去彻底；洗脱液有没有使吸附材料充分接触（洗脱），接触的时间是否充分。
2. 提取率低
1) 融胶液为酸性缓冲液，如融胶后，其 pH 值升高将影响提取得率。请加入 0.1 倍体积的 3M 乙酸钾(pH5.0)。
2) 长时间使用后没有更换的电泳缓冲液，其 pH 值较高，将影响 DNA
的吸附。请更换新的电泳缓冲液后，再进行电泳，然后切胶。
3) 在洗脱前，将洗脱液于30～60&#8451;温浴，可提高提取效率。
3. 如何计算提取率
1) 由于回收前样品中，往往含有非目的 DNA 片段，引物，dNTP 等，所以不能用测回收前后吸光度的的方法计算回收率。
2) 可将回收前后 DNA 片段一起电泳，使用凝胶成像系统拍照后，用配套的软件进行电泳条带灰度对比.
3) 注意，电泳条件及拍摄条件将对灰度对比结果造成很大影响，请仔细操作，以减小误差。
4. &如何提高胶回收的得率？
Agarose抑制DNA与吸附材料的结合，将不含DNA片段多余的
Agarose切除，能显著提高回首效率。DNA结合到吸附材料，需要一定浓度的结合剂，Agarose多了，结合剂（Solution
SN）的相对浓度就会下降，得率就受到影响。大多数情况下，是由于电泳时琼脂糖的浓度不同，切下的胶块有大有小，得率自然不同。回收的得率还与回收片段的大小有关。提高结合剂（Solution
SN）的相对浓度，增加
DNA与吸附材料作用时间（放置时间），控制好离心速度都一定程度上可以提高得率。改善洗脱条件，如提高洗脱溶液的pH值，温度，增加洗脱液的体积等也可以提高得率，但是对于pH过高，可能会影响下游反应，通常情况下采用pH8-8.
5.&回收得片段为什么电泳上样会漂起来？
主要问题是纯化过程中的乙醇没有除干净。
6.&纯化过程中乙醇或核酸结合剂（Solution S, SN,
B等）不能去除干净，对下游实验有影响吗？
影响非常大。操作过程中有专门除残留乙醇的步骤，不可以省略，否则下游的酶切和连接都可能遇到问题。可以使核酸结合到吸附材料上的吸附剂很多，这些吸附助剂的残留对克隆影响较大。
7.&胶很难融如何处理？
将融胶问题提高到60度；可能是胶的浓度太高，需要提高融胶液的体积；融胶过程中每隔一段时间就震荡几下帮助融胶。
8. 如何鉴定回收的效果？
电泳比较回收前后的条带强弱。比较时需要将回收的产物全部加到胶中去，具有可比性。如果您的样品难得，可以选无关的片段验证一下。
&9. 如果胶在后续过程发生胶没有彻底融化，如何补救？
补加融胶液，将胶悬起来，50-60度继续保温至彻底融化。
10. 洗脱DNA用什么洗脱好？
需要根据您回收片段下游用途确定。一般情况下，采用TE或Tris
缓冲液可以。测序反应，请用无菌水洗脱。如果你洗脱的DNA需要长期保存，请用TE洗脱。
&11. 用Ez-Resin如果凉干过头，如何处理？
加TE, 50-60度处理10分钟，间或振荡，离心收集上清。
12. 什么情况下需要在50-60度的情况洗脱?
如果您十分关心效率，回收的片段为大片段（10kb 左右），单链片段等需要预保温洗脱液。
13. UV方式定量回收的量合适吗？
对于Miniprep,回收的量很少，用UV方式定量不合适，用琼脂糖电泳方式确定。
14. 跑完PCR，暂时不方便胶回收，条带已经切下来放到ep管里了，这个能保存么？会不会有不良影响？
割下来的胶放在-20保存两个星期完全没有问题。切下来的胶放在4度冰箱中4、5小时没有问题回收的效果也很好。
15.&凝胶回收DNA实验的关键在哪里?
最关键的是切胶之后，溶胶的那一步。切胶的时候要尽量把多余的琼脂糖凝胶切干净，按照实验步骤，第一步应该是将胶充分的溶化。这以后步一定要做充分，保证凝胶已经完全溶解了。加乙醇这步也很关键，当凝胶溶解后最好多过几次柱子。还有就是洗脱的那一步。洗脱的时候最好用加热到60度
的洗脱液洗脱，如果实在效果不好可以分两次洗脱。
16. 切胶的时候如何能切的准呢？条带的位置肉眼很难判断出来，如何判断条带的位置呢？
可以将产物与Marker一起电泳，染色后，在紫外灯下观察结果，跟Marker进行相比，就知道要的是哪条带。注意，紫外灯下切胶速度要快，否则DNA会降解，另外，紫外线对身体伤害很大，特别是眼睛，请注意采取保护措施（比如在专门的箱子里切，带眼镜等）。RNA
用具要用10%的NaOH浸泡过液，再用DEPC水冲洗干净&&70%的乙醇用过
国产分析乙醇有杂质，RNA酶还会有，并带入其它污染。
17. 回收率为什么与点样量和片段大小有关？
DNA片断越大，和固相基质的结合力越强，就越难洗脱，回收率就低；DNA的量越少，相对损失越大，回收率越低。
18. 用胶回收试剂盒从凝胶中回收DNA得率低是什么原因？
1） 胶块溶解不完全，可适当延长水浴时间和上下颠倒的次数以及增加溶胶液的比例；
2） 胶块体积太大，应使用枪头捣碎，还不能充分溶解则先将其切为小块，分多次回收；
3） 紫外灯下切胶时间过长，导致DNA部分降解，应尽量把切胶时间控制在30s以内；
4） 洗涤液使用后未及时盖严瓶盖，乙醇挥发，影响回收效率；
TAE或TBE电泳缓冲液不新鲜，失去了缓冲能力，导致PH值升高，降低DNA和膜的吸附力，应及时更换电泳缓冲液，最好使用新鲜配制的电泳缓冲液，效果更好；
6） 回收前的样品量太少，加大点样量；
洗脱前，预先65&#8451;预热洗脱液、延长室温静置时间、增加洗脱次数可以有效提高回收率30%以上。
19. 加入溶胶液温浴后，液体仍很粘稠或后续步骤有堵柱子现象？
1） 胶块溶解不充分，可再补加一些溶胶液或延长水浴时间并增加上下颠倒次数帮助溶胶；
2） 胶块体积过大，应尽量切除多余部分，并将其切为小碎块，分几次回收；
3） 水浴温度是否达到规定温度65&#8451;，用温度计检测。
20. 琼脂糖凝胶块不溶？
1） 琼脂糖质量不好；
2） 含目的片断的凝胶在空气中放置过久，使胶块失水干燥，建议切胶后立即进行回收或将胶块保存于4
&#8451;或-20&#8451;；
3） 制胶的电泳缓冲液浓度过高或陈旧。
21. 能否使用去离子水洗脱回收？
可以，但是实验室所用去离子水一般PH值偏低，可用NaOH适当调高PH值＞7.0，以增加回收得率。
22. 能否使用TE（PH8.0）洗脱？
23．可否使用小于30μl的洗脱液进行洗脱？
不可以。因为说明书提供的最少洗脱体积是能完全覆盖吸附膜的最小体积。
24．为什么溶胶不彻底会影响回收结果的纯度？
在电泳过程中，DNA会与大分子的多糖紧密的结合在一起，凝胶的种类和质量不同，DNA与之结合力也不同，只有凝胶充分溶解，DNA才能充分释放，否则，凝胶将与DNA一起沉淀下来，洗脱后将影响回收结果的纯度。
四、 外源质粒对大肠杆菌的转化常见问题分析与对策
1. &TA克隆常见问题与解决方案
a． 没有或极少量菌落
1） 感受态细胞效率低：使用转化效率高于 107 cfu/mg 的感受态
连接酶失效：2x快速连接反应体系应于-20&#8451;保存；用时于冰上融解，使用前需充分混匀；每次用量少应适量分装
产物加A比例过低：使用高保真DNA聚合酶扩增的产物需进行加A处理；PCR产物如不能及时连接，应于-20&#8451;保存≤2周
4） PCR产物量不足：电泳定量，浓缩PCR产物
5） PCR产物中含有阻碍TA连接反应的杂质：脱盐纯化（电转化必须做!）
6） UV照射过久导致PCR产物变性：切胶动作要快，尽量缩短UV照射时间
7） 载体3’末端T降解：EZ-T载体应于-20&#8451;保存；每次用量少应适量分装
8） 抗生素用错或浓度过高：使用Amp终浓度为100 mg/ml的琼脂糖平板
b． 蓝色菌落过多
过度连接：使用2x快速连接反应体系时，16&#8451;反应不应超过2小时；当天不能立即转化时，可于-20&#8451;保存连接反应液
2） 插入片段较小，未破坏读码框：挑选几个蓝斑，看是否有插入片段
c． 白色菌落不含目标长度的插入片段：PCR产物含非特异片段或引物二聚体，可胶纯化回收目标产物
d． 菌落过多：可能过度连接，可使用Amp终浓度为100
mg/ml的琼脂糖平板；37&#8451;培养不超过16小时
2. &连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少。
1） 可能感受态细菌转化效率太低，用质粒作为阳性对照同时检测感受态的转化效率。
2） 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。
3） 可能载体酶切不够充分，用未经连接的载体转化作为阴性对照。
4） 用存放DNA的溶液进行转化，作为阴性对照，检测感受态细菌是否存在问题。
3. 超级感受态得到的转化效率低的问题出在哪里的呢？
1） 菌液OD值 偏大或偏小
2） 原始菌株不好
3） 试剂超纯程度不够
4） 操作时，对菌体伤害过大
影响感受态效率的其实就一条：状态。生长时控制OD就是为了达到对数期，此时菌活力最高而处理时要使这种好的状态保持，但CaCl2处理又要使之处理充分，使膜局部变化达到最佳的感受状态，从这个意义上说，任何可能影响菌状态的步骤或试剂均有可能最终影响到感受效率，比如离心力是否太大导致菌破碎，CaCl2的纯度浓度处理时间……。
4. 我们所做的普通氯化钙法制备的感受态细胞所能吸收的最大基因是多少？
多大都可以吸收,主要是你的载体可以容纳多大的片段,不同的载体容纳外援片段是不同的
用碱裂解法提取的质粒,取3ul转化感受态大肠杆菌涂amp抗性平板，却出现阳性克隆较少（含绿色荧光蛋白，阳性克隆应该显绿色，在紫外灯下非常明显，就几十个菌落）大部分菌落不发绿，这些菌落比发绿的菌落小一些的现象，为什么？
做一次阴性对照,拿空白菌涂布在含amp的平板上,如生长,说明amp过期,一般这种情况不多见。一般粉末状的amp不容易失效,如果amp有效的话,可以配制远高于标准的浓度,如果细菌耐药的话,也能生长良好,如不耐药,则放置数天仍不见细菌生长。
2) 拿阴性和阳性的细菌各取数个放于高浓度的amp液体培养基中,如能生长,说明空白菌中带有耐药菌,建议换菌。
3) 提质粒的菌受污染了，重新划线挑单克隆。
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