限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现
限制酶的多种切割方法以及在高中生物试题中的体现
摘要： 本文总结了限制酶的多种割切方法，并分析其优缺点，并结合相关生物试题，对其更加深入理解。
关键字：限制酶 单酶切 双酶切 高考题
限制酶是基因工程中的工具酶之一，为了让目的基因能连接到运载体上，需要用限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和运载体，切割方法有多种，现就其切割方法进行总结，分析其优缺点。近几年高考生物试题中几乎年年涉及到限制酶的切割方法，这应该引起教师的注意。
1&&&&&&&&&单酶切&
1.1&&&&&&&&同一种限制酶分别切割目的基因与运载体
这是最简单的一种方法，用同一种酶切割后能产生相同的粘性末端，末端之间能发生碱基互补配对而形成重组DNA分子。
1.2&&&&&&&&用同裂酶分别切割目的基因与运载体
同裂酶：有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。&&同裂酶差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限制性内切酶可以切割，另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是&&5’……G|CG&G……3’&&和
3’……G&GC|G……5’&，
如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割。
例1&&（2009年江苏生物高考题）苏云金杆菌(Bt)能产生具有杀虫能力的毒素蛋白。下图是转Bt毒素蛋白基因植物的培育过程示意图ampr为抗氨苄青霉素基因)，据图回答下列问题。
(2) 图中②表示HindIII与Bam I酶切、DNA连接酶连接的过程，此过程可获得_______种重组质粒；如果换用Bst
I与BamH I酶切，目的基因与质粒连接后可获得_______种重组质粒。
解析 题中考查的是相同的粘性末端才能发生碱基互补配对而连接这一知识点。用HindIII与Bam
I酶切，则质粒产生两个粘性末端，分别是H和B，也就是说能与质粒连接的DNA分子的粘性末端也只能是H和B，用HindIII与Bam
I酶切含目的基因的DNA片段，可得到4种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和H、H和B、B，因此有中间的两个DNA片段可以与质粒连接，形成2种重组质粒。如果换用Bst
I与BamH I酶切，属于同裂酶，产生相同的粘性末端，切割后的质粒两侧的粘性末端都是B，用Bst I与BamH
I酶切含目的基因的DNA片段，可得到3种DNA片段，他们的粘性末端分别是B、B和B、B,因此只有中间的DNA片段才能与质粒连接，形成1种重组质粒。
1.3&&用同尾酶分别切割目的基因与运载体
有时两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶。同尾酶的切割产物可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏。
&&&&例2&&&（2005年天津理综）限制性内切酶Ⅰ的识别序列和切点是—G↓GATCC—，限制性内切酶Ⅱ的识别序列和切点是—↓GATC—。在质粒上有酶Ⅰ的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶Ⅱ的切点。
①请画出质粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。
②请画出目的基因两侧被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。
③在DNA连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏性末端能否连接？为什么？
解析 这两种酶属于同尾酶，能产生相同的粘性末端，因此能够连接起来。
③由于两者产生的粘性末端相同，因此粘性末端之间能发生碱基互补配对而连接。
例3&&（2010年江苏生物奥赛初赛）限制酶SalⅠ识别的序列是GTCGAC，酶切后在5’侧产生4个碱基突出，限制酶XhoⅠ识别的序列是CTCGAG，酶切后也在5’侧产生4个碱基突出。如果将SalⅠ酶切后的插入片段与XhoⅠ酶切过的质粒载体混合，在进行连接反应，那么产生的连接产物所具有的性质是：
A．使用XhoⅠ或SalⅠ处理，插入物都会释放出来
B．SalⅠ处理可以使插入物释放出来，但XhoⅠ不行
C．XhoⅠ处理可以使插入物释放出来，但SalⅠ不行
D．无论使用SalⅠ或XhoⅠ处理，插入物都不会释放出来
解析 此处用同尾酶切割，能产生相同的粘性末端—TCGA，因此能连接，但重组后的序列是CTCGAC
&因此没有上述两种酶的切割位点。
1.3&&&&&&&&单酶切的优点与缺点
优点是操作简单。但它的缺点主要有两个：①用单酶切切割后的目的基因两侧各有一个粘性末端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目的基因首位相连，形成自身连接体，成环状；同样的道理，切割后的质粒在DNA连接酶的作用下也会首尾连接，又恢复成没有切割前的样子。②容易形成2种重组DNA分子，其中一种重组DNA分子是我们所需要的，这样就加大了筛选工作量（图解形成2种重组质粒：其中B表示某种限制酶切割后产生的粘性末端)
割后产生的粘性末端)
注：箭头方向表示原目的基因表达的方向
注:第一种情况下获得的重组质粒目的基因表达的方向与原目的基因表达方向一致,都能产
生目的蛋白.第二种情况下将目的基因翻转180度,构建的重组质粒中目的基因表达的方向与原目的基因表达方向恰好相反,则不会产生我们需要的目的蛋白。由此可见，将同一种限制酶切割目的基因与质粒可以获得2种重组质粒，不能使质粒与目的基因发生定向连接。
2&&&&&&&&&双酶切
2.1&&&&&&&用两种限制酶分别同时切割含目的基因的DNA片段和质粒
例4&&（2009福建理综）
转基因抗病香蕉的培育过程如图所示。质粒上有PstⅠ、SmaⅠ、EcoRⅠ、ApaⅠ等四种限制酶切割位点。请回答：
（1）构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶&&&&&&&，对&&&&&&&进行切割。
题中在抗病基因的两侧分别是PstⅠ和EcoRⅠ的酶切位点，因此只能用这两种酶去切割，目的基因两侧的粘性末端是P和E，为了让目的基因与运载体结合，运载体两侧的粘性末端也只能是P和E，因此也只能用PstⅠ和EcoRⅠ酶去切割质粒。
2.2&&&&&&双酶切的优点与缺点
双酶切可以克服单酶切的两大缺点，由于目的基因与运载体的两侧的粘性末端不相同，因此可以防止目的基因与质粒自身连接体的发生；同时只能产生1种重组质粒（图解只能形成1种重组质粒：限制酶A产生的粘性末端用A表示，限制酶B产生的粘性末端用B表示)
注：双酶切只能产生1种重组质粒，如果把目的基因翻转180度，则由于粘性末端不同，则不能发生碱基互补配对而连接。
（2008海南高考题）图为某种质粒表达载体简图，小箭头所指分别为限制性内切酶EcoRI、BamHI的酶切位点，ampR为青霉素抗性基因，tctR为四环素抗性基因，P为启动因子，T为终止子，ori为复制原点。已知目的基因的两端分别有包括EcoRI、BamHI在内的多种酶的酶切位点。
（1）将含有目的基因的DNA与质粒表达载体分别用EcoRI酶切，酶切产物用DNA连接酶进行连接后，其中由两个DNA片段之间连接形成的产物有&&&&&&&&&&、&&&&&&&&&&、&&&&&&&&&三种。若要从这些连接产物中分离出重组质粒，需要对这些连接产物进行&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
（2）用上述3种连接产物与无任何抗药性的原核宿主细胞接种到含四环的培养基中，能生长的原核宿主细胞所含有的连接产物是&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
（3）目的基因表达时，RNA聚合酶识别和结合的位点是&&&&&&&&&&&&&&，其合成的产物是&&&&&&&&&。
（4）在上述实验中，为了防止目的基因和质粒表达载体在酶切后产生的末端发生任意连接，酶切时应选用的酶时&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
解析 本题是对单酶切和双酶切优缺点的考查（具体对应关系不做详述）。
参考答案（1）目的基因—载体连接物&&载体--载体连接物&&目的基因--目的基因连接物&&分离纯化&&&（2）载体--载体连接物；目的基因--载体连接物、载体--载体连接物
（3）启动子&&mRNA&&（4）EcoRI和BamHI
&&&双酶切的缺点是要用两种酶切割，由于每种限制酶作用的条件不同，一般不能两种酶不能同时使用，而是用完一种就要更换作用的外界条件，以保证酶的高效性。因此双酶切操作较复杂。
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以上网友发言只代表其个人观点，不代表新浪网的观点或立场。（1）不能，&& 皮肤细胞中的胰岛素基因未表达（或未转录），不能形成胰岛素mRNA
。
（2）15（a－b）。（3）不能，会将两个标记基因都破坏&
（4）CaCl2&&&&&
因为大肠杆菌中不含内质网和高尔基体，不能对核糖体合成的蛋白质加工。
（5）所有生物公用一套遗传密码
（6）不受时间和性别的限制
请选择年级高一高二高三请输入相应的习题集名称(选填)：
科目：高中生物
下图一是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。
（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？&&&&&&&&&& 并说明理由：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
（2）若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则③④⑤过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶&&&&& 个。
（3）如下图二是运载体和胰岛素基因的某个片段，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。GeneI和 GeneII为标记基因，根据图示,判断下列操作正确的是&&&&&&&& 。
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
（4）为使过程⑧更易进行，可用&&&&&&&&&&&& （药剂）处理D。通过图一方法生产的胰岛素可能不具备生物活性，为什么？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
（5）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
（6）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可能直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&& 。
科目：高中生物
来源：学年辽宁省瓦房店市高级中学高二上学期期末考试生物试卷
题型：综合题
（10分）下图一是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程并说明理由。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（2）为使过程⑧更易进行，可用&&&&&&&&&&&&（药剂）处理D。通过图一方法生产的胰岛素可能不具备生物活性，为什么？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（3）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（4）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可能直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（5）如下图二是运载体和胰岛素基因的某个片段，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。GeneI和 GeneII为标记基因，根据图示,判断下列操作正确的是&&&&&&&&。A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
科目：高中生物
来源：2011届江苏省盐城中学高三上学期期中考试生物试卷
题型：综合题
下图一是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程？&&&&&&&&&&并说明理由：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（2）若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则③④⑤过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶&&&&&个。（3）如下图二是运载体和胰岛素基因的某个片段，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。GeneI和 GeneII为标记基因，根据图示,判断下列操作正确的是&&&&&&&&。A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割（4）为使过程⑧更易进行，可用&&&&&&&&&&&&（药剂）处理D。通过图一方法生产的胰岛素可能不具备生物活性，为什么？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（5）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。（6）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可能直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
科目：高中生物
来源：学年江苏省高三期初（暑期）检测生物试卷（解析版）
题型：综合题
（9分）下图一是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。
（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程并说明理由。&&&&&&&&&&&&&&&&&
。理由是
&&&&&&&&&&&&&&&&&
&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
（2）②步骤名称为&&&&&&&&&&&&&&&&&
，若A中共有a个碱基对，其中鸟嘌呤有b个，则③④⑤过程连续进行4次，至少需要提供胸腺嘧啶&&&&& 个。
（3）如下图二是运载体和胰岛素基因的某个片段，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。GeneI和 GeneII为标记基因，根据图示,判断下列操作正确的是&&&&&&&& 。
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割
（4）为使过程⑧更易进行，可用&&&&&&&&&&&&
（药剂）处理D。通过图一方法生产的胰岛素可能不具备生物活性，为什么？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（5）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（6）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可能直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
科目：高中生物
来源：学年辽宁省瓦房店市高二上学期期末考试生物试卷
题型：选择题
（10分）下图一是利用基因工程技术生产人胰岛素的操作过程示意图，请据图作答。
（1）能否利用人的皮肤细胞来完成①过程并说明理由。&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（2）为使过程⑧更易进行，可用&&&&&&&&&&&&
（药剂）处理D。通过图一方法生产的胰岛素可能不具备生物活性，为什么？&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（3）人的基因能和异种生物的基因拼接在一起，是因为& &&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&。
（4）利用转基因牛、羊乳汁提取药物工艺简单，甚至可能直接饮用治病。如果将药物蛋白基因移到动物如牛、羊的膀胱上皮细胞中，利用转基因牛羊尿液生产提取药物比乳汁提取药物的更大优越性在于：&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&
。
（5）如下图二是运载体和胰岛素基因的某个片段，已知限制酶I的识别序列和切点是—G↓GATCC－，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是－↓GATC－。GeneI和 GeneII为标记基因，根
据图示,判断下列操作正确的是&&&&&&&& 。
A．质粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割
B．质粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割
C．目的基因和质粒均用限制酶Ⅰ切割
D．目的基因和质粒均用限制酶Ⅱ切割如图是一个DNA分子片段，其中一条链中含15N，另一条链中含14N．下列有关说法正确的是（　　）A．限制酶作用于①部位，解旋酶作用于③部位B．2处碱基的缺失会导致染色体结构变异，并且_百度作业帮
拍照搜题，秒出答案
如图是一个DNA分子片段，其中一条链中含15N，另一条链中含14N．下列有关说法正确的是（　　）A．限制酶作用于①部位，解旋酶作用于③部位B．2处碱基的缺失会导致染色体结构变异，并且
如图是一个DNA分子片段，其中一条链中含15N，另一条链中含14N．下列有关说法正确的是（　　）A．限制酶作用于①部位，解旋酶作用于③部位B．2处碱基的缺失会导致染色体结构变异，并且可以遗传C．该DNA的特异性表现在碱基种类和的比例上D．把该DNA放在含15N的培养液中复制两代，子代DNA中只含有15N的DNA占
A、限制酶作用于①磷酸二酯键，而解旋酶作用于③氢键，A正确；B、②处碱基对的缺失将导致基因突变，B错误；C、任何双链DNA分子都含有A、C、G、T四种碱基，因此碱基的种类不体现特异性，DNA的特异性表现在（A+T）：（G+C）的比例上，C错误；D、把此DNA放在含15N的培养液中复制两代得到4个DNA分子，根据DNA的半保留复制特点，其中有一个DNA分子的一条链含有14N，另一条链含有15N，其他3个DNA分子只含15N，因此子代DNA分子均含15N，D错误；故选：A．
本题考点：
DNA分子结构的主要特点；DNA分子的多样性和特异性；DNA分子的复制．
问题解析：
分析题图：图示表示DNA分子片段，部位①为磷酸二酯键，是限制酶、DNA聚合酶和DNA连接酶的作用部位；②处是碱基对，碱基对的增添、缺失或替换会导致基因结构发生改变，引起基因突变；部位③为氢键，是解旋酶的作用部位．下列有关基因工程中操
下列有关基因工程中操作工具的叙述,不正确的是
A．限制酶的作用部位是磷酸与脱氧核糖间的键 B．DNA连接酶的作用部位是碱基间的氢键 C．一种限制酶只能_百度作业帮
拍照搜题，秒出答案
下列有关基因工程中操
下列有关基因工程中操作工具的叙述,不正确的是
A．限制酶的作用部位是磷酸与脱氧核糖间的键 B．DNA连接酶的作用部位是碱基间的氢键 C．一种限制酶只能
下列有关基因工程中操
下列有关基因工程中操作工具的叙述,不正确的是
A．限制酶的作用部位是磷酸与脱氧核糖间的键 B．DNA连接酶的作用部位是碱基间的氢键 C．一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 D．载体必须具备某些标记基因（2013o闸北区一模）假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，_百度作业帮
拍照搜题，秒出答案
（2013o闸北区一模）假设有以下一项实验：用限制酶 HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA 分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，
（2013o闸北区一模）假设有以下一项实验：用限制酶&HindⅢ，BamHⅠ和二者的混合物分别降解一个4kb（1kb即1千个碱基对）大小的线性DNA&分子，降解产物分别进行凝胶电泳，在电场的作用下，降解产物分开，如图所示．据此分析，这两种限制性内切酶在该DNA&分子上的限制位点数目是以下哪一组（　　）A．HindⅢ1个，BamHⅠ2个B．HindⅢ2个，BamHⅠ3个C．HindⅢ2个，BamHⅠ1个D．HindⅢ和BamHⅠ各有2个
用限制酶HindⅢ单独切割DNA，能形成2.8kb和1.2kb两种长度的DNA分子，说明该DNA分子含有一个限制酶HindⅢ的切割位点；用限制酶BamHⅠ单独切割DNA，能形成1.8kb、1.3kb和0.9kb三种长度的DNA分子，说明该DNA分子含有两个限制酶BamHⅠ的切割位点．故选：A．
本题考点：
基因工程的原理及技术．
问题解析：
分析题图：用限制酶HindⅢ单独切割DNA，能形成2.8kb和1.2kb两种长度的DNA分子；用限制酶BamHⅠ单独切割DNA，能形成1.8kb、1.3kb和0.9kb三种长度的DNA分子；用限制酶HindⅢ，BamHⅠ同时切割时，能形成1.8kb、1.0kb、0.9kb和0.3kb四种长度的DNA分子．