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【求助/交流】乙炔还原法测固氮酶活性怪异事件
最近实验室在做芽孢菌固氮酶活性测定，重复试验数次，皆出现以下怪异问题：
1. 不接菌，不注乙炔气的隐性对照，一半的实验依然能检测到乙烯和乙炔的峰，虽然峰面积不是特别大，但不能忽略；
2. 接菌，不注乙炔气的隐性对照，全部实验均能检测到乙烯和乙炔的峰，峰面积不能忽略；
3. 阳性对照中，乙炔峰和乙烯峰前都有一个杂峰，是什么？
请高手指教：
A:为什么隐性对照出现这种情况，怎么解释，我们已经排出了色谱柱残留，进样器残留，实验室空气残留等因素。
B:菌株是胶质芽孢杆菌
C:培养基两种，
1. ACCC55(成分为蔗糖10 g、K2HPO4·3H2O 0.5 g、NaCl 0.2 g、CaCO3 1 g、
MgSO4·7H2O 0.2 g、蒸馏水1 000 mL、pH 7.0~7.2)
2. Hino's medium . It was prepared by mixing the following 2 solutions aseptically after autoclaving: Solution 1: sucrose, 10g; MgSO4.7H20, 0.25 NaCI, 5 FeC13.6H20, 7.5 Na2MoO4.2H20, 2.5 CaCO3, 5 washed agar (1.875% final concentration) in 400 ml distilled water. Solution 2:K2HPO4 (8.7%), 81 KH2POa (6.75~), 19 para-aminobenzoic acid, 5 ~ biotin, 2.5 ~ pH 7.0.
Originally posted by jndxmmc at
最近实验室在做芽孢菌固氮酶活性测定，重复试验数次，皆出现以下怪异问题：
1. 不接菌，不注乙炔气的隐性对照，一半的实验依然能检测到乙烯和乙炔的峰，虽然峰面积不是特别大，但不能忽略；
2. 接菌，不注乙炔气 ... 1. 不接菌，不注乙炔气的隐性对照，一半的实验依然能检测到乙烯和乙炔的峰，虽然峰面积不是特别大，但不能忽略；
请注意气相色谱的灵敏度很不错的，所以你需要至少99.9999% 也就是通常说的六九纯图的乙炔。否则需要通过标准99.9999%乙烯进行校正
2. 接菌，不注乙炔气的隐性对照，全部实验均能检测到乙烯和乙炔的峰，峰面积不能忽略；
这个应该是你的实验误差，千万不要觉得你会有什么新发现，还是回头看看你那个操作错了。
3. 阳性对照中，乙炔峰和乙烯峰前都有一个杂峰，是什么？
看来很有可能你是自己制备一炔了，不过通常前面都会出现一个峰的。这要回头看看色谱学原理：首先你要用标准样品确定你的乙炔， 乙炔出峰时间，千万不要说以前是0.3秒，现在还是。因为色谱柱每次重新换柱要进行截短一段或者其他氧化，都会影响，他的出峰时间。.
我给研究生上过这个实验。新手可能出现这些情况。另外 建议制作标准曲线，单独乙炔/乙烯峰比或者面积比没有多大意义。 Originally posted by reasonspare at
1. 不接菌，不注乙炔气的隐性对照，一半的实验依然能检测到乙烯和乙炔的峰，虽然峰面积不是特别大，但不能忽略；
请注意气相色谱的灵敏度很不错的，所以你需要至少99.9999% 也就是通常说的六九纯图的 ... .
谢谢你的解释，我还不是完全明白
1 我单独进了空气的样品 没有任何杂峰，唯有螺口管中不接菌不注乙炔气的隐性对照出现了峰，这和“六九纯图的乙炔”解释有什么直接关系么？
2 这个实验我让学生重复了3次，我自己还做了1次，然后又去别人的实验室做了一次，都是同样的结果，我觉得应该不是试验误差了吧，你有没有遇见同样的问题？
3 乙炔不是自己制备的，买的高压瓶中的，使用前也测试过，乙炔样品只能检测到乙炔峰；至于出峰时间，我们也考虑了，杂峰确实在乙烯峰之前，不知道怎么产生的这个杂质？
我在中国农科院 qq 方便的话 希望能与你进一步探讨
本文来自: 小木虫论坛 http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=2330850&pid=1853886&page=1#pid1853886 Originally posted by jndxmmc at
谢谢你的解释，我还不是完全明白
1 我单独进了空气的样品 没有任何杂峰，唯有螺口管中不接菌不注乙炔气的隐性对照出现了峰，这和“六九纯图的乙炔”解释有什么直接关系么？
2 这个实验我让学生重复了3次， ... 1 我单独进了空气的样品 没有任何杂峰，唯有螺口管中不接菌不注乙炔气的隐性对照出现了峰，这和“六九纯图的乙炔”解释有什么直接关系么？
鉴于你得非常肯定你的操作，也就是绝无可能是乙炔残留的。那我我怀疑你所谓的峰，可能不是乙炔峰
2 这个实验我让学生重复了3次，我自己还做了1次，然后又去别人的实验室做了一次，都是同样的结果，我觉得应该不是试验误差了吧，你有没有遇见同样的问题？
还是卖两个标准气体，跑一下吧，乙炔乙烯，出峰时间和位置 就立马搞定了，一劳永逸
3 乙炔不是自己制备的，买的高压瓶中的，使用前也测试过，乙炔样品只能检测到乙炔峰；至于出峰时间，我们也考虑了，杂峰确实在乙烯峰之前，不知道怎么产生的这个杂质？
据我所知高压纯乙炔（工业乙炔，通常为99%，即使再高纯度的都会出现两个峰。），你这个问题，使我注意到了前面你提到“不可忽略的峰”，建议看看你的参数设置。
我曾经探讨过前面杂峰的产生（没有确切结论），但是可以从以下几个方面，
上一次样品分析的残留；
气体本身的杂志；
水蒸气，FID，离子化过程中很多H2O也可能离子化，从而被检测及检测到。
此外进样技术很关键。
QQ已经5，6年不用了，所以还有疑问请倒 http://emuch.net/bbs/viewthread.php?tid=2281755&fpage=0&view=&highlight=&page=1&& 查看话题
【求助/交流】pNPG测酶活
我用pNPG测酶活，我的酶促反应液在反应过程中没有颜色变化，加了碳酸钠马上变成黄色溶液，不知道怎么回事啊，应该是在没有加入碳酸钠之前就应该有水解产物对硝基苯酚生成啊，期望知道的说说谢谢了
你的反应体系的pH是不是<7??
对硝基酚在碱性条件下才会形成可见的黄色，加入1M碳酸钠的目的就是将反应体系中的pH调整到碱性，让其显色，同时又可以终止酶反应。 Originally posted by zemin_fang at
你的反应体系的pH是不是<7??
对硝基酚在碱性条件下才会形成可见的黄色，加入1M碳酸钠的目的就是将反应体系中的pH调整到碱性，让其显色，同时又可以终止酶反应。 嗯，我的反应条是酸性（pH4.5）下进行的，我加入2ml,0.5M的碳酸钠。不过，我用pH6.0的缓冲液也试过，这个在碳酸钠加入之前就能够看到溶液逐渐变黄色。这是为什么呢。谢谢! 路过，学习学习， Originally posted by your2007 at
嗯，我的反应条是酸性（pH4.5）下进行的，我加入2ml,0.5M的碳酸钠。不过，我用pH6.0的缓冲液也试过，这个在碳酸钠加入之前就能够看到溶液逐渐变黄色。这是为什么呢。谢谢! 并不是非要求pH>7才会显色的，没有那么苛刻。但是你加入碳酸钠以后pH都会在11左右，这样可以保证不同pH条件下最终pH一致 学习学习。。 学习了，谢谢4楼分享经验 对硝基酚在碱性条件下显黄色， 学习学习~~~ 想知道楼主的PNPG是在哪买的？多少钱？十分感激 学习了学习了 难怪我在做PH稳定性是 酸性环境 一加碳酸钠就变黄 而碱性环境一加PNPP就变黄
原来是这样:victory: 为什么我加入碳酸钠后也不立刻变色，而是很长时间（2h）才逐渐变色,请问你的反应条件是什么？能说一下吗？谢谢了~ 我加入碳酸钠以后酶活是被终止了，但是测不出酶活了，用的是商品酶。之前用国标都能测出来的。想请教下你最终采用的方法具体是怎样的呢？葡萄酸腐菌sf-19菌株致病性及其相关酶活性的测定--《公共植保与绿色防控》2010年
葡萄酸腐菌sf-19菌株致病性及其相关酶活性的测定
【摘要】：葡萄酸腐病(grape sour rot)是一个特殊的病害,病因复杂,病害发生与酵母菌、醋酸菌和果蝇等密切相关。近年来该病害发生严重,生长季节引起大量烂果,已成为我国葡萄上的重要病害之一,严重地限制了葡萄产业的发展。本实验采用组织分离法从北京房山区采集到西拉葡萄病果上分离纯化得到的一株酵母菌sf-19。采用室内离体葡萄果实接种法,对三个食用葡萄品种红提、京蜜和京香玉进行了有伤接种试验,观察并计算果实发病率和病情指数(病害分级标准:0级:全果无症状,1级:果实腐烂面积1/4以下,2级:果实腐烂面积1/4～1/2,3级:果实腐烂面积1/2～3/4,4级:果实腐烂面积3/4以上),以明确sf29菌株的致病性。另外,利用紫外-可见分光光度计测定了sf19菌株代谢过程中产生的致病相关酶的活性。采用DNS(3,5-二硝基水杨酸)法测定纤维素酶(Cx)、多聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶甲基半乳糖醛酸酶(PMG)的活性。按Hoffman(1982)方法测定多聚半乳糖醛酸转移消除酶(]PGTE)和果胶甲基转移消除酶(PMTE)的活性。结果发现:sf-19能够侵染京蜜、红提和京香玉,引起典型的酸腐症状,3种葡萄品种的发病率均为100%,病情指数分别为96.4,61.1和59.4,说明酵母菌sf19具有较强的致病性,是引起葡萄酸腐病的病原菌之一。sf19在YEPD培养液中培养后,培养液中检测不到Cx、PG、PMG、PGTE和PMTE的活性,但在诱导培养基(YEPD液体培养基中加入葡萄皮研磨液)中培养,培养液中检测到Cx、PG、PMG、PGTE和PMTE的活性。其中,Cx活性最高,达到189.6 U/μg;PMG次之,为102.45 U/μg;PG活性为76.5 U/μg;与Cx、PMG、PG活性相比,PGTE和PMTE活性相对较小,只有10.87 U/μg和12.28 U/μg。说明sf19只有在有寄主浸渍液诱导时,才能产生引起出现典型的酸腐病症状的致病相关酶Cx、PMG、PG、PGTE和PMTE,推断这些酶可能在引起葡萄出现果粒腐烂,组织破裂解体的症状时起重要作用。
【作者单位】：
【关键词】：
【分类号】：S436.631【正文快照】：
葡萄酸腐菌sf-19菌株致病性及其相关酶活性的测定@蔡建波$北京农学院植物科学技术学院!北京 102206
@张夏兰$北京农学院植物科学技术学院!北京 102206
@李兴红$北京市农林科学院植保环保所!北京 100081
@刘正坪$北京农学院植物科学技术学院!北京 102206
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2-C16的不同的对硝基苯酚底物，但是令我困惑的是，C10以下的底物，很容易在缓冲液中自发水解，这样就干扰酶活测定。而大于C10的底物又都很难溶解。很是困惑！请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助，不甚感激！答：30毫克的对棕榈酸硝基苯酯（p-NPP）可以溶于10毫升的异丙醇中，稍微水浴加热就可以完全溶解。我是以（p-NPP）为底物，溶液A：30毫克的对棕榈酸硝基苯酯（p-NPP）可以溶于10毫升的异丙醇中。溶液B：含1%triton的磷酸缓冲溶液。溶液A与溶液B1：9混合（现配）。我现在实验中遇到的问题是：测酶活的底物溶液是无色的，但一加发酵液溶液立刻变为黄色，测量的吸收光值特别大，但把发酵液煮沸20分钟后作对照底物溶液不变色，用碱地定测得脂肪酶活力不高。用标准脂肪酶没有这个现象。实验很郁闷！不知是什么引起底物的变化。请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助，不甚感激！答：我认为用对硝基苯酚脂肪酸酯底物测定脂肪酶活力是非常灵敏的，我不太明白二楼的困惑，从你的描述来看，你的发酵液里应该有酶活才对。用碱滴定测得脂肪酶活力不高。正常啊，因
问：我正在做这个试验，买了从2-C16的不同的对硝基苯酚底物，但是令我困惑的是，C10以下的底物，很容易在缓冲液中自发水解，这样就干扰酶活测定。而大于C10的底物又都很难溶解。很是困惑！请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助，不甚感激！答：30毫克的对棕榈酸硝基苯酯（p-NPP）可以溶于10毫升的异丙醇中，稍微水浴加热就可以完全溶解。我是以（p-NPP）为底物，溶液A：30毫克的对棕榈酸硝基苯酯（p-NPP）可以溶于10毫升的异丙醇中。溶液B：含1%triton的磷酸缓冲溶液。溶液A与溶液B1：9混合（现配）。我现在实验中遇到的问题是：测酶活的底物溶液是无色的，但一加发酵液溶液立刻变为黄色，测量的吸收光值特别大，但把发酵液煮沸20分钟后作对照底物溶液不变色，用碱地定测得脂肪酶活力不高。用标准脂肪酶没有这个现象。实验很郁闷！不知是什么引起底物的变化。请问各位做过这项试验的大虾给予我一定的帮助，不甚感激！答：我认为用对硝基苯酚脂肪酸酯底物测定脂肪酶活力是非常灵敏的，我不太明白二楼的困惑，从你的描述来看，你的发酵液里应该有酶活才对。用碱滴定测得脂肪酶活力不高。正常啊，因为PNPP法是比较灵敏的，所以即使你用PNPP法发现颜色反应非常的黄，其用碱滴定可能酶活也比较低。这是我的实验结论，不知道是不是符合大家的经验。谢谢。，
您的举报已经提交成功，我们将尽快处理，谢谢！
酶的特性主要四点：
1、酶具有高效率的催化能力；其效率是一般无机催化剂的10的7次幂~~10的13次幂。
2、酶具有专一性；（每一种酶只能催化一种或一类化学反应...
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酶活定义。。。
菜，不会自己定义。。。
用高效液相法测得在特定条件下反应前后底物和产物的量，蛋白浓度也已知。
怎么定义酶活呢?还有比酶活。不要板书，我想知道具体怎么定义和计算。
补充：不是常规反应，在文献中没有看到相关的定义，反应机理我自己也不甚清楚，底物并没有完全转化为产物，所以我是以产物的生成量还是底物的消耗量来定义呢？头疼得很。 觉得以产物的生成量比较好。可以根据具体底物来定义，比如单位时间内生成1微mol产物为1个单位酶活。 举个例子，NK酶活单位定义为：在37℃，1min内分解1nmol溶解于0.1mol/L（pH7.4）H3PO4缓冲液中的H-D-Val–Leu-Lys-pNA（浓度为5×10-4mol/L）的NK量为1U。