琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA_百度文库
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琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA
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DNA电泳图为什么拖尾现象的原因是什么？
提取真菌DNA的浓度稀释到100ng/ul，其纯度即OD260/280为1.98，跑DNA的多态性PCR之后用2.5%的琼脂糖凝胶电泳，染料为Goldview，电泳的电压为80V，50分钟。在紫外成像仪上拍照观察，可是条带不太清楚，而且拖尾现象很严重，请大师们帮我看一下这幅电泳图，为什么条带不清楚而且拖尾现象这么严重呢？
优化一下体系，提高退火温度再扩。 : Originally posted by daniel1112 at
优化一下体系，提高退火温度再扩。 有可能是酶加多了 你这个DNA样品里面确定没有蛋白污染吗？同意二楼说的提高退火温度。同时，你的Mark也有模糊的背景，考虑一下琼脂糖胶的问题吧…… 要优化一下程序，把模板浓度稀释一下，不要浓度太大， 稀释一个梯度来做，10倍，20倍，50倍，100倍等。
你把pcr体系发出来看看，估计酶也加多了。琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳
天坛医院检验科 董一红
高效毛细管电泳(HPCE)
是经典电泳技术和现代微柱分离相结合的产物。
&&&&以琼脂糖凝胶作为支持介质的电泳称为琼脂糖凝胶电泳
(agarose gel electrophoresis, AGE) 。
&&&&一、琼脂糖凝胶电泳的优点
1 ）琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大（约占 98 %～ 99
%），近似自由电泳，样品扩散度较自由电泳小，对样品吸收吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好。
）琼脂糖呈透明状，无紫外吸收，电泳后的样品可直接用紫外检测；电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。
）操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可进行电泳。
&&&&二、琼脂糖凝胶电泳的准备和操作方法
、制备琼脂糖凝胶时注意避免产生气泡
凝胶电泳分为垂直型和水平型，一般垂直型分离效果好于水平型。但水平型可制备低浓度琼脂糖，制胶和加样比较方便，且电泳槽制作简单、价格低廉。
　　用缓冲液配制所需浓度的琼脂糖凝胶，水浴或微波炉中加热使琼脂糖完全融化，将溶液冷至
55 ℃
，用少量琼脂糖凝胶将玻璃板或有机玻璃板封边，放置样品梳（梳齿下端离玻璃板
0.5 -1.0mm
）。接着将融化的琼脂糖凝胶溶液不间断地倒在玻璃板上或有机玻璃板模子中（厚度依样品浓度而定，须注意避免气泡混入）
室温下自然凝固。待完全凝固后小心取出加样器，在电泳槽中加入适量电泳缓冲液，使胶板浸没在电泳缓冲液下约
、样品制备与加样
&&&&所加样品应有适当浓度与较小体积，用微量注射器缓慢加入样品，点样时电源必须处于关闭状态。为了指示电泳的距离，避免样品在电泳槽缓冲液中飘浮，常在制备好的样品中加入含有蔗糖或甘油以及指示剂（溴酚蓝、二甲苯青等）的上样缓冲液。另外，样品中含盐量不能太高，否则电泳中会出现区带消失、前沿不齐等现象。样品中
DNA 含量以每条区带的 DNA 不少于 0.1 μ g 为宜， DNA
浓度过高会使电泳区带变宽，泳动距离异常。
样品的用量由加样孔的体积决定，通常为
10-50 μ g 。
&&&&电泳温度视需要而定。对于大分子的分离，宜低温，电压应低（一般不超过
5V/cm ）。普通电泳可在室温进行，电泳的电压为
5-15V/cm 。
、染色－以 DNA 电泳为例
&&&&常用荧光染料溴化乙锭（
EB ）进行染色以观察在琼脂糖凝胶中的 DNA 条带。
EB 能插入 DNA 分子中碱基对之间，使 EB 与 DNA
结合（超螺旋 DNA 与 EB
结合能力小于双链闭环，而双链闭环的 DNA 与 EB
结合能力小于线状双链 DNA
）。将以染色的凝胶浸泡在 1mmol/lMgSO 4 溶液中 1
小时，可以降低未结合的 EB
所引起的背景荧光，以提高检测的灵敏度。
染料染色有很多优点：
&&&&操作简便
&&&&多余的 EB
不干扰紫外线灯下的检测（因为只有结合了核酸的
EB 才能显示荧光）
&&&&不会使核酸断裂（其他染料不易做到这一点）
&&&&灵敏度高，且对 DNA 或 RNA 均可显色
可以加到样品中，并可随时用紫外线吸收追踪检查，染色之后还可用正丁醇提取除去
　　　　但必须注意，EB染料具有潜在的致癌性，应避免直接接触，使用时必须带手套。
、样品回收
&&&&电泳结束后在紫外线下观察样品的分离情况，对需要的
分子或特殊片段可从电泳后的凝胶中以不同方法进行回收。
&&&&常用有下列方法
&&&&（1）透析袋电洗脱法－本法适用于分子量较小的
片段的回收。&&&&电泳完毕后，于紫外线下切下需回收的
区带，将凝胶条置于含有适量缓冲液的透析袋中，再放入电泳槽电泳
30-60 分钟，使 DNA
分子泳动到透析袋靠正极一侧的壁上，然后反向电泳
30-60 秒，使贴在透析模上的 DNA 分子泳动到袋 PH 为
的缓冲液中。吸出袋内的缓冲液并用正丁醇抽提或乙醇沉淀所需的
DNA 分子。
&&&&（2）低融点琼脂糖法
&&&&采用低融点琼脂糖制备的电泳凝胶，电泳完毕后可在紫外灯下切下拟回收的
DNA 区带，于 65 ℃ 保温 10-20
分钟。胶条融化后，再用酚 - 氯仿抽提，最后用 95%
的冷乙醇沉淀抽提 DNA 片段，此法回收率可达 80%
。优点是可直接在融化的凝胶中进行各种酶反应。但操作时应严格控制融胶和电泳温度。
&&&&（3）DEAE
纤维素膜法－本法适宜小于 5kb 的双链 DNA
分子的回收&&&&用琼脂糖凝胶电泳将
DNA 片段分离后，于紫外灯下在紧靠待回收 DNA
片段前方切一裂隙，将条状 DEAE
纤维素膜插入裂隙中，继续电泳直至带中所有的 DNA
均转移至膜上。再用低粒子强度的缓冲液洗掉膜中杂质，然后在高离子强度的缓冲液中将
DNA 洗脱下来，最后用酚 - 氯仿抽提，乙醇沉淀 DNA
分子。本法回收的 DNA 纯度很高。
　　此外，还有醋酸铵溶液浸出法、冷冻挤压法等。
琼脂糖凝胶电泳样品回收的方法很多，但是目前尚无一种方法完全令人满意。
&&&&目前琼脂糖凝胶电泳样品回收存在的问题主要有以下几方面：
绝大多数的琼脂糖混杂有硫酸盐多糖，它能与 DNA
一起从凝胶中被抽提出来，这些物质是许多酶的强抑制物；可将回收的
沉淀数次或采用超纯琼脂糖的方法解决这一问题。
&&&&（2）从琼脂糖凝胶抽提出
的效率与其分子量有关。琼脂糖凝胶电泳可以十分有效地回收小于
1kb 长度的 DNA 片段。随着 DNA
分子量增大，回收量则显著降低，片段大于 20kb
时，回收率很难超过 20% 。
&&&&三 、在医学中的应用
&&&&琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定、纯化
片段的主要方法，目前主要用于重组基因的分离、鉴定、限制性酶切图谱分析、
Southern 、 Northern 、 Western 杂交分析，以及 PCR
产物的分离鉴定等。
CK 和 CK-MB
是目前用于证实心肌损伤和心肌梗死早期诊断的指标之一。使用免疫抑制法测定
CK-MB 易受 CK-BB 和异常 CK 的干扰，导致 CK-MB
测定假性升高。采用琼脂糖凝胶电泳可分离出三种
CK 同功酶，分别为 CK-MM 、 CK-MB 、 CK-BB
。当出现异常同功酶如巨分子 CK
时，在电泳图谱上很易被发现，从而避免误诊。
&&&&血清经琼脂糖凝胶电泳后，用胆固醇基质试剂均匀铺在凝胶表面，孵育一段时间，即可见清晰的蓝色条带，依次是高密度脂蛋白胆固醇、快前β脂蛋白胆固醇、极低密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇。凝胶片用冰醋酸固定、水洗、烤干后，
570nm 波长扫描 ,
即可确定各组分的百分率含量。根据血清总胆固醇值可求得这四种脂蛋白胆固醇值。
&&&&脂蛋白可在不同的支持介质中进行电泳分离，但最常用的是琼脂糖电泳。电泳后用脂溶性染料使脂质部分着色，用光密度计扫描得出各部分脂蛋白的相对比例。异常脂蛋白血症分型时应参考血脂及载脂蛋白测定结果。
琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，其结构单元是
D 半乳糖 3 ， 6- 脱水 -L
半乳糖。许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。在
pH4 ． 0 － 9 ． 0
的缓冲液中是稳定的。由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于
时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如
分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状
（球形）不能进入胶中，相对迁移率为零，而同等大小的直线
（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于零。
责任编辑：秦颖然
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用来鉴定DNA片段（单位是kDa）的大小的.maker是预制的含有标准片段长度DNA的混合物,在琼脂胶中不同的长度的片段跑的距离不同,通过比较用以初步确定样品中DNA片段的大小.如下图,最左边的是Maker,其他的是样品.具体操作、原理可以参考《分子克隆操作指南》,或者百度“琼脂糖凝胶电泳”.
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