第九章目的基因导入受体细胞第九章目
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第九章目的基因导入受体细胞
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第六章 分子克隆常用的载体
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第三节 SV40病毒载体
　　实验证明，一些具有DNA基因组或其生活史中出现有DNA阶段的真核生物的病毒，经过改建之后，都可以发展成为用于转移动物基因的分子载体。这主要是由于动物病毒具有如下的特点：
　　①动物病毒含有能够被真核细胞识别的有效的启动子。
　　②有许多种动物病毒，在其感染周期中都能够持续地复制，使其基因组拷贝数达到相当高的水平。
　　③有些动物病毒具有控制自己复制的顺式元件和反式作用因子。
　　④有些动物病毒，在它们的复制过程中能高效稳定地整合到寄主核基因组上。
　　⑤病毒的外壳蛋白质能够识别细胞接受器(acceptor)。用病毒外壳蛋白质包装重组质粒DNA形成的假病毒颗粒(pseudovirions)，即构成了一种高效的转化体系。
　一 .SV40病毒的基本生物学特性
　　猿猴空泡病毒40(Simian vacuolating virus 40, SV40)是迄今为止研究得最为详尽的乳多空病毒(Papova
viruses)之一。SV40病毒的基因组是一种环形双链的DNA，其大小仅有5243bp，很适于基因操作。
　　(l)SV40病毒的生命周期
　　根据SV40病毒感染作用的不同效应，可将其寄主细胞分成三种不同的类型。SV40病毒在感染了CV-1和AGMK猿猴细胞之后，便产生感染性的病毒颗粒，并使寄主细胞裂解。我们称这种感染效应为裂解感染(lytic
infection)，而猿猴细胞则叫做受纳细胞(permissive cell)。但如果感染的是啮齿动物(通常是仓鼠和小鼠)的细胞，就不会产生感染性颗粒，此时病毒基因组整合到寄生细胞的染色体上，于是细胞便被转化，也就是说发生了癌变。我们称这种啮齿动物细胞为SV40病毒的非受纳细胞(non-permissive
cell) 。人体细胞是SV40的半受纳细胞(semi-permissive
cell)，因为同SV40病毒接触的人体细胞中，只有1%～2%会产生出感染性的病毒。
　　SV40病毒对猿猴细胞的裂解感染可分成三个不同的时相。在感染了寄主细胞之后，有一段长达8～12小时的潜伏期，在这个期间，病毒颗粒脱去蛋白质外壳，同时DNA逐渐地转移到寄主细胞核内；紧接着4小时为早期时相，此时发生早期mRNA和早期蛋白质的合成，并出现病毒诱导寄主细胞DNA合成的激发作用；在这以后的36小时称为晚期时相。进行病毒DNA、晚期mRNA和晚期蛋白质的合成，并在高潮时发生病毒颗粒组装。大约在感染的第三天，细胞裂解，平均每个细胞可释放出105个的病毒颗粒。
　　(2)SV40病毒的基础分子生物学
　　SV40病毒是一种小型的20面体的蛋白质颗粒，由三种病毒外壳蛋白质Vp1、Vp2和Vp3构成，中间包装着一条环形的病毒基因组DNA。同其它病毒不同，SV40
DNA是同除了H1之外的所有寄主细胞组蛋白(H4、H2a、H2b和H3)相结合。这些组蛋白使病毒DNA分子紧缩成真核染色质所特有的念珠状核小体，这种结构特称为微型染色体(minichromosome)。感染之后的SV40基因组，输送到细胞核内进行转录和复制。SV40病毒基因组表达的时间顺序是相当严格的,据此可将其区分为早期表达区和晚期表达区()。围绕在SV40
DNA复制起点周围约 400bp的 DNA区段，是十分引人注意的。例如，现在已经弄清紧挨这个起点的DNA序列，是调节早期和晚期初级转录本合成的控制信号。早期转录本的合成，就是由位于这个区段内的由一对72核苷酸序列串联而成的强化因子序列激活的。
SV40病毒基因组表达的一个重要特点是，它的RNA剪辑模式非常复杂。通过不同的剪辑途径，早期初级转录本加工成2种不同的早期mRNA(多瘤病毒的早期初级转录本加工成3种不同的早期mRNA)；而晚期的初级转录本加工成3种不同的晚期mRNA。
　　这2种早期mRNA分别编码大T抗原的小t抗原(即肿瘤蛋白质或抗原)。晚期转录本按照其特定的沉降系数，可区分为16S、18S和19S三种mRNA，它们分别编码Vp1、Vp3和Vp2病毒蛋白质。Vp1编码区同Vp2和Vp3的编码区是以不同的转译结构形式彼此交叠的()。
　　(3)SV40病毒的增强子序列
　　在SV40病毒基因组中存在着一个增强子序列。其长度为72bp，以串联重复的形式位于基因组DNA复制起点的附近，它的主要功能是促进病毒DNA发生有效的早期转录，而且具有一般增强子所共有的基本特性。
　　外源的基因可以融合在SV40 DNA的早期转录区段内，而SV40的增强子又能够有效地激活SV40早期转录单位的转录活性。因此显而易见，SV40增强子在哺乳动物的基因操作中是相当有用的。此外，SV40增强子还可以增强由细胞启动子启动的基因转录作用。
　二.取代型重组病毒载体
　　野生型的SV40病毒颗粒的包装范围相当严格，超过其基因组大小(5.2kb)的重组DNA就不能够被包装为成熟的病毒颗粒。而且，SV40还存在着寄主细胞的局限性，它只能在受纳细胞中增殖，并最终导致寄主细胞的死亡，这样就不能作长期的培养使用。因此，野生型的SV40病毒必须经过改造之后，才能发展成为基因克隆的有用载体。
　　针对这种情况，目前设计的以SV40为基础的基因克隆载体，主要有两种不同的类型。第一种是取代型的重组病毒载体(recombinant
virus vector)。在这种类型的载体中，外源DNA是直接插入在缺陷性的病毒基因组上。由于插入的外源DNA片段，在大小上同被取代的病毒基因组区段是等同的，因此形成的重组体DNA能够在哺乳动物的受纳细胞中增殖，并被包装成病毒颗粒。但为了补充这段被取代的病毒基因组DNA的功能，必须使用一种与之互补的辅助病毒。第二种是重组的病毒-质粒载体(recombinant
viral plasmid vector)。在这类载体中，病毒基因组部分只保留下维持在哺乳动物细胞中进行复制所必须的有关序列，但它融合上了一个细菌质粒，因而还能够在大肠杆菌细胞中进行复制和增殖。不过这种重组体分子没有被包装成病毒颗粒，不会出现裂解感染的情况，它实际上是一种类似于质粒的DNA分子载体。
　　这两种类型的载体，都只能短时间地保留在寄主细胞中，供作瞬时研究(transient studies)之用，因为无论是病毒的感染或是复制子复制的失控，最终都会导致寄主细胞的裂解死亡。
　　(1)晚期区段取代载体
　　实验中已经观察到，缺失了整个晚期区段功能的SV40病毒，同可互补这段功能的一种温度敏感(ts)的辅助病毒混合感染时，仍然能够增殖。因此，可以通过取代晚期区段的途径构建SV40病毒载体。最常用的辅助病毒是tsA突变体，它合成一种温度敏感的T抗原。
　　(i)在猿猴细胞中表达大鼠前胰岛素原基因的晚期区段取代载体
　　概述了按照上述这种事实设计的一种晚期区段被取代的重组病毒载体的构建，及其将大鼠的前胰岛素原基因导入猿猴细胞的实验过程。
　　(ii)在猴肾细胞中表达兔β-珠蛋白基因的晚期区段取代载体
　　一种理想的SV40派生载体，它应该具有如下三个组成部分：DNA的复制起点；控制mRNA剪辑和多聚腺苷化作用的区段；完整的早期区段，因此能够同tsA58突变体发生互补作用。已经构建出来的SVGT-5，就是符合上述这些条件的一种SV40派生载体，它已成功地在猴肾细胞中表达兔β-珠蛋白的cDNA。
　　(iii)晚期取代载体的应用
　　由SV40病毒派生而来的晚期区段取代载体，在哺乳动物基因工程中的用处，主要有如下两个方面。首先，人们可以利用这类载体在猿猴细胞中表达外源克隆的基因，制备蛋白质产物；其次，人们还可应用此类载体研究mRNA分子的转录后加工及其稳定性的分子机理。
　　(2)早期区段取代载体
　　(i)早期区段取代载体
　　按照同样的道理，也可以构建出早期区段取代载体(early region replacement vector)。
　　当SV40病毒的早期区段被取代后，就失去了T抗原的功能，因此，早期区段取代载体必须使用具有互补功能的辅助病毒。这自然显得比较麻烦。1981年Y.Gluzman发现了一种特殊的COS细胞系，能够有效地互补T抗原，从而大大地方便了早期区段取代载体的使用，被认为是SV40载体发展历程中的一个重要的突破。
　　但由于晚期启动子在感染周期中能较长时间地保持活性，又具有较强的表达能力，因此相比之下，早期区段取代载体具有更为广泛的用途。鉴于病毒基因组的复制拷贝数可高达数十万份，因此晚期启动子十分有效。这类载体可用来生产大量的蛋白质。
　　晚期区段取代载体和早期区段取代载体共同的优点是能够产生出重组的病毒颗粒，把外源基因导入受体细胞，而无需经过以
DNA为媒介的转化步骤。此外，这类载体还能够把克隆的基因复制成高拷贝数，使基因的表达效率明显提高。
　　(ii)COS细胞和HFS细胞
　　通过构建能持久表达病毒T抗原的特殊细胞系，能够互补早期区段取代载体丧失的合成T抗原的功能。现已有两种这样的细胞系。
　　COS细胞系，是用克隆在大肠杆菌质粒载体上其复制起点失活的
SV40早期区段DNA，转化正常的猿猴受纳细胞CV-1而得到的。故特称为COS(CV-l，origin, SV40)细胞系(请注意，不要把 COS细胞系同
cos粘性末端位点混淆！)。由于在 COS细胞系的基因组中，整合有SV40早期区段DNA，故能够组成地表达T抗原。
　　应用这种复制功能缺陷的SV40病毒突变株转化人的成纤维细胞。同样也获得了一种其功能与COS细胞类似的新型的细胞系HFS(human
fibroblasts，SV40)。在这种细胞的基因组DNA上，也整合有SV40病毒的早期DNA区段，所以能够组成地表达T抗原，为SV40早期区段取代载体的感染提供有效的辅助作用。COS细胞和HFS细胞产生的T抗原蛋白质，是通过与早期区段取代载体上的病毒复制起点DNA序列之间的结合作用，而扳动载体DNA进行复制的。
　三.重组的病毒-质粒载体
　　(1)含有完整早期区段和复制起点的病毒-质粒载体
　　SV40和多瘤病毒(polyoma virus)的基因组能够在寄主细胞中快速地复制，并达到相当高的拷贝数。利用这种能力，现在已经发展出了一类特殊的病毒载体。这类病毒载体，实质上是由病毒的早期区段和复制起点同大肠杆菌的质粒分子重组而成的，所以又叫做病毒-质粒载体(viral-plasmid
vector)。由于它们既可在大肠杆菌细胞中复制，也能在哺乳动物细胞中复制，根据这种特性，在有的文献中有时也称之为穿梭载体。例如，的病毒-质粒载体pαC10就是一种典型的穿梭载体，其中的早期区段和复制起点来自多瘤病毒，质粒是大肠杆菌的pBR322，克隆的外源DNA是小鼠免疫珠蛋白重链基因。
　　(2)微型病毒复制子-质粒载体
　　实验发现，在COS或HFS细胞中，含有SV40 DNA复制起点的任何大小的环形DNA，都能够像质粒一样进行独立的复制。根据这种原理，许多实验室都把只含有SV40复制起点的DNA片段，即所谓的微型病毒复制子(mini-viral
replicon)，插入在大肠杆菌的质粒载体上，构成了一种新型的病毒-质粒载体，称为微型病毒复制子-质粒载体。所示的
pTBC-1就是一种典型的 SV40微型病毒复制子-质粒载体，如果将这种载体导入COS或HFS细胞，它们就能利用细胞提供的T抗原复制出非常大量的拷贝数。所以可以用来高水平地表达外源蛋白质。