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16SrRNA_23SrRNA及16S_23SrRNA基因在细菌分离与鉴定中的应
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汉赛巴尔通体17kDa蛋白的表达及间接ELISA方法的建立
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汉赛巴尔通体17kDa蛋白的表达及间接ELISA方法的建立
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一种新型IIa类细菌素的克隆表达和活性鉴定
来源:本站原创
　　0 引言
　　细菌素(bacteriocin)是某些细菌产生的具有抗菌活性的多肽、蛋白质或蛋白质复合物，一般只对亲缘关系较近的细菌有毒害作用。产生菌对其产生的细菌素具自身免疫性[1]。能产细菌素的微生物很多，其中对乳酸菌细菌素的研究最多最深入。IIa 类细菌素是乳酸菌细菌素的一个亚类，为抗李斯特氏菌的多肽。随着近年来世界范围内发生的多起李斯特氏菌引起的中毒事件以及由此而带来的危害，预防和控制食品中的李斯特氏菌成为了人们关注的热点，而IIa 类细菌素对李斯特氏菌具有特异的抗菌活性，并且还具有安全性、酶稳定性、热稳定性、免疫性等优点[2]，因此在食品领域具有很好的应用前景。但目前仅有几个细菌素在食品和生物药物领域中得到应用，因此从乳酸菌天然资源中挖掘更多高效的细菌素已成为研究热点。
　　在采用传统的菌种筛选法寻找新的细菌素过程中，存在乳酸菌出发菌株细菌素产量低，分离纯化困难等问题[3]。我国有丰富的乳酸菌资源，随着越来越多的乳酸菌基因组序列被报道，利用基因搜索工具寻找新的细菌素已成为一条快速有效的途径。目前已有多种细菌素基因陆续从乳酸菌基因组中被鉴定出来[4-6]。Dzung B. Diep 等[7]从一株戊糖片球菌中得到一条新的类片球菌素基因，并在沙克乳杆菌中进行异源表达，得到了较高的产量和活性。国外已有关于细菌素异源表达的研究[8-10]，其重组表达宿主以大肠杆菌居多，其中不乏理想的研究成果[11-14]。
　　本研究中的NB-C1 基因是通过基因搜索比对从已测序的乳酸菌基因组中筛选得到的一条潜在的IIa 类细菌素基因。其序列具有IIa 类细菌素的重要特征，即具有N 端保守序列YGNGVXaaC，且含有两个半胱氨酸，可形成一个二硫键，研究表明此二硫键对抑制李斯特氏菌是必需的[15]。很多研究在表达抗菌肽时，为避免抗菌肽对宿主的毒性作用，大多进行融合表达[11-14,16,17]。我们曾将NB-C1 基因进行直接表达，但未能检测到目的蛋白及其活性，推测该细菌素对宿主可能具有一定的毒性作用，另外目的蛋白为约5 kD 的小肽，不稳定，易被内源蛋白酶降解[18,19]，故本文尝试融合表达。本文以绿色荧光蛋白（GFP）作为融合载体蛋白，将GFP 和NB-C1 的融合基因在大肠杆菌中进行表达，获得足够的活性重组蛋白，这将为NB-C1 生物学性质的进一步研究提供物质基础，以及为新型IIa 类细菌素的发掘和研究提供一种新的路径和方法。
　　1 材料和方法
　　1.1 菌株和质粒
　　T 载体pGM-T 购自天根生化有限科技（北京）公司；表达载体pIVEX 2.4d 购自Roche公司；质粒pEGFP-C1 由本实验室提供；表达菌株Escherichia coli BL21(DE3)pLysS 购自Stratagene 公司；抑菌试验的指示菌单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）由江南大学食品学院姚卫蓉老师实验室提供。
　　1.2 主要试剂和仪器
　　DNA 聚合酶和T4 DNA 连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶购自NEB 公司；GeneRuler DNA Leader Mix Maker 购自Fermentas 公司；低分子量标准蛋白Marker购自国药集团化学试剂有限公司；三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)、N-[三(羟甲基)甲基]甘氨酸(Tricine)、质粒抽提试剂盒、氨苄青霉素以及氯霉素均购自上海生工生物科技有限公司；胶回收试剂盒购自北京索来宝科技有限公司；PCR 仪购自Gene Technologies 有限公司；电泳仪和凝胶成像系统购自BIO-RAD 公司；引物由上海博尚公司合成；DNA 测序由北京华大基因有限公司完成。
　　1.3 方法
　　常规分子生物学操作参照分子克隆手册进行[20] 。　
　　1.3.1 NB-C1 的全基因合成
　　由中科院遗传所和本研究室合作通过生物信息学方法筛选得到与IIa 类乳酸菌细菌素同源性较高的一条核苷酸序列，并人工合成其成熟肽的全基因序列，命名为NB-C1（GenBankAccession No. bankit1378688 HQ015716）。并将此片段连接入pGM-T 载体，构建为pGMTNB-C1。
　　1.3.2 融合表达载体的构建
　　引物：P1：F 5-CAT GCC ATG GTA AAG TAT TAC GGT AAC-3，P2：R 5-TCC CCCGGG TTA TCT ATG TGC CCA A-3，下划线部分依次为Nco I，Xma I 酶切位点；P3：F 5-ATAAGA ATG CGG CCG CGT GAG CAA GGG CGA G-3，P4：R 5-CAT GCC ATG GCC ATCTTG TAC AGC TCG TCC AT-3，下划线部分依次为Not I，Nco I 酶切位点。
　　以测序正确的pGMT-NB-C1 为模板，利用引物P1 和P2 进行PCR 扩增，产物经胶回收纯化后用Nco I 和Xma I 进行双酶切，酶切产物再次经胶回收纯化与经Nco I 和Xma I 酶切的pIVEX 2.4d 载体连接，构建重组质粒pIVEX 2.4d-NB-C1。同样，以pEGFP-C1 为模板，利用P3 和P4 引物扩增GFP 片段，经过Not I /Nco I 酶切和连接构建重组载体pIVEX2.4d-GFP-NB-C1，然后转化E.coli DH5& 感受态细胞，筛选阳性克隆，进行PCR 鉴定和酶切鉴定。经测序正确后将重组表达载体pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1 转化表达宿主E.coliBL21(DE3)pLysS，得到重组菌BL21(DE3)pLysS/2.4d-GFP-NB-C1。
　　1.3.3 重组蛋白的诱导表达和SDS-PAGE 检测
　　将重组菌株BL21(DE3)pLsS/2.4d-GFP-NB-C1 划线培养并挑取单菌落接种于LB(Luria-Bertani) 培养基中（含100 &g/ml 氨苄青霉素和34 &g/ml 氯霉素），37&C 振荡培养至OD600 值0.6，加入IPTG 至终浓0.8 mmol/L，于20&C，200 r/min 诱导培养20 h。离心收集菌体并重悬于PBS 缓冲液（0.1 mol/L，pH 8.0），在冰浴下超声破碎，离心得上清和沉淀。将全细胞，上清和沉淀进行SDS-PAGE检测，同时以空质粒转化得到的BL21(DE3)pLysS/2.4d作为空白对照。
　　1.3.4 融合蛋白 GFP-NB-C1 的纯化和鉴定
　　收集破碎上清液通过0.45 &m 滤膜，上样于5 mL 的Ni-NTA 亲和柱，用10 倍柱体积的清洗缓冲液（20 mmol/L PBS，500 mmol/L NaCl，20 mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗涤亲和柱，再用洗脱缓冲液（20 mmol/L PBS，500 mmol/L NaCl，150~300 mmol/L 咪唑，pH 8.0）梯度洗脱并收集，然后用SDS-PAGE 检测，并以Bradford 法测定蛋白质浓度。
　　1.3.5 融合蛋白 GFP-NB-C1 的抑菌活性
　　采用固体平板扩散法测定融合蛋白GFP-NB-C1 对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌活性。向培养皿中倒入约15 mL 含有1.5%琼脂的FB（Fraser Broth Base）培养基（加有1% 50mg/mL 柠檬酸铁铵溶液），将在FB 液体培养基生长至对数中期的敏感菌按1%转接至5 mL0.5%琼脂溶液中，迅速混匀，均匀铺在凝固好的平板培养基上，制备双层固体培养基，凝固好后小心放置五个牛津杯，然后分别加入100 &L PBS（pH 8.0）（阴性对照），以及不同浓度的GFP-NBC1（40 &g/mL、60 &g/mL、80 &g/mL、100 &g/mL）。平板于4℃放置6 h 后转移至37&C 培养箱，培养12 h。李斯特氏菌可以水解FB 培养基中的七叶灵，进而与铁离子反应，使培养基变黑，便于直接观察抑菌圈。
　　2 结果
　　2.1 融合表达载体的构建和表达
　　重组质粒 pIVEX 2.4d-GFP-NB-C1，分别用Nco I /Xma I 和Not I /Nco I 双酶切鉴定，得到150 bp 和750 bp 的目的条带，与预期结果一致。DNA 测序结果证明融合的目标片段序列正确。将重组表达载体转化BL21(DE3)pLysS，经IPTG 诱导表达后，SDS-PAGE分析表达产物，与空白对照相比，在约32 kD 处有一条明显的重组蛋白条带。分析破碎上清和沉淀，表明GFP-NB-C1 融合蛋白主要以可溶形式存在。
　　2.2 重组融合蛋白 GFP-NB-C1 的纯化和鉴定
　　蛋白样品经 Ni-NTA 亲和柱纯化后，SDS-PAGE 结果显示，在分子量32 kD 处有一明显目的条带。Quantity one 软件分析表明纯化后重组蛋白GFP-NB-C1 的纯度大于95%。以BSA 为标准样品，Bradford 法测定蛋白质浓度，结果表明经过一步纯化后，每升工程菌发酵液最终可获得36.1 mg 纯的GFP-NB-C1 融合蛋白。
　　2.3 重组融合蛋白 GFP-NB-C1 的抑菌活性
　　使用固体平板扩散法测定融合蛋白GFP-NB-C1 对单核细胞增生李斯特氏菌的抑菌活性，结果所示，平板上出现明显的抑菌圈，表明GFP-NB-C1 对敏感菌L. monocytogenes具有明显的抑制作用，并且抑菌圈直径与融合蛋白浓度具有一定的线性关系。
　　3 讨论
　　近年来虽然诸多学者通过融合的方式表达了抗菌肽蛋白，但由于大多以包涵体形式存在[13, 21]，不利于后续的活性检测等工作。本文中以GFP 为融合载体蛋白，在大肠杆菌中实现了重组蛋白的高效可溶表达，并且GFP 的使用有助于对重组蛋白表达和纯化过程的实时监测。为了使融合蛋白以可溶的形式表达，对表达条件进行了优化（略），最终确定表达条件为诱导前OD600 0.6，IPTG 终浓为0.8 mmol/L，20&C 低温诱导20 h，目的蛋白以可溶形式表达，避免了包涵体形成。
　　表达载体pIVEX 2.4d 本身具有6 个组氨酸组成的标签，所以表达的目的蛋白可以通过Ni-NTA 亲和层析柱纯化，为得到较纯的目的蛋白，洗脱时采用150~300 mmol/L 咪唑梯度洗脱，SDS-PAGE 检测表明杂蛋白被陆续洗下，目的蛋白在250 mmol/L 和300 mmol/L 咪唑中被洗脱出，得纯的单带。本研究中的纯化条件温和，纯化步骤简单，这均有利于蛋白活性的保持，并大大简化了纯化过程和降低了纯化难度，纯化后样品可直接用于活性检测。抑菌试验表明融合蛋白GFP-NB-C1 对单核细胞增生李斯特氏菌具有较好的抑菌活性，说明经GFP 融合后，NB-C1 保留了生物活性。
　　本文成功构建并表达了可溶性融合蛋白GFP-NB-C1，经一步纯化，每升发酵液得到36.1mg 纯度大于95%的融合蛋白，为其生物学性质进行进一步的探讨奠定了基础。另外本研究建立了一条IIa 类细菌素从基因搜索、重组表达到获得活性蛋白的通路，这对新型细菌素的挖掘和研究提供了新的思路和借鉴。
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　　[参考文献] (References)
　　[1] JACK R W, TAGG J R, RAY B. Bacteriocins of Gram-Positive Bacteria[J]. Microbiological Reviews, ): 171~200.
　　[2] ENNAHAR S, SASHIHARA T, SONOMOTO K, et a1. Class IIa bacteriocins: biosynthesis, structure andactivity[J]. FEMS Microbiology Reviews, ~106.
　　[3] MURIANA PM, KLAENHAMMER TR. Purification and partial characterization of lactacin F, a bacteriocinproduced by Lacobacillus acidophilus 11088[J]. Appl Environ Mcrobiol, ): 114~121.
　　[4] HOSKINS J, BURGETT S, FULLER W, et a1. Genome of the baeterium Streptococcus pneumoniaestrainR6[J]. Bacteriol, : .
　　[5] GARDES C, FLINT N, LANGE, et a1. Mieroarray-based identification of a novel Streptococcuspneumoniaeregulon controlled by an autoinduced peptide[J]. Bacteriol, : .
　　[6] INGOLF N, OLA J. Exploration of antimicrobial potential in LAB by genomics[J]. Current Opinion inBiotechnology, 0~104.
　　[7] DZUNG B D, LINDA G, DAG B, et al. Data mining and characterization of a novel pediocin-like bacteriocinsystem from the genome of Pediococcus pentosaceus ATCC 25745[J]. Microbiology, : .
　　[8] AXELSSON I K T B M . A system for heterologous expression of bacteriocins in Lactobacillus sake[J]. FEMSMicrobiology Letters, 1998, l68(1): 137~143.
　　[9] BIET F, BERJEAUD J M, WOROBO R W, et a1. Heterologous expression of the baeteriocin mesentericinY105 using the dedicated transport system and the general secretion pathway[J]. Microbiology, ):.
　　[10] KAWAI Y, ARAKAWA K, ITOH A, et a1. Heterologous expression of gasserlcin A, a bacteriocin producedby Lactobacillus gasseri LA39[J]. Animal Science Journal, ): 45~51.
　　[11] MOON G, PYUN Y, KIM W J. Expression and purification of a fusion-typed pediocin PA-1 in Escherichiacoli and recovery of biologically active pediocin PA-1[J]. International Journal of Food Microbiology, ): 136~140.
　　[12] BEAULIEU I, TOLKATCHEV D, JETTE J F, et a1.Production of active pediocin PA-1 in Escherichia coliusing a thioredoxin gene fusion expression approach：cloning，expression, purification, and characterization[J].Canadian Journal of Microbiology, ): .
　　[13] LU H R, LI G D, WU H Y, et al. Fusion expression of antimicrobial peptide GK1 in Escherichia coli[J]. ChinJ Biotech, ): 21~26.陆海荣, 李国栋, 吴宏宇, 等. 抗菌肽GK1 在大肠杆菌中的融合表达[J]. 生物工程学报, ): 21~26.
　　[14] CHEN H Q, FAN L M, XU Z N, et al. Efficient production of soluble human beta-defensin-3-4 fusionproteins in Escherichia coli cell-free system[J]. Process Biochemistry , 3~428.
　　[15] DRIDET D, FIMLAND G, HECHERD Y, et al. The continuing story of class IIa bacteriocins[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews, ): 564~582.
　　[16] KLOCKE M, MUNDT K, IDLER F, et a1. Heterologous expression of enterocin A, a bacteriocin fromEnterococcus faecium, fused to a cellulose-binding domain in Escherichia coli results in a functional protein withinhibitory activity against Listeria[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, ): 532~538.
　　[17] CHEN H Q, XU Z, XU N, et a1, Eficient production of a soluble fusion protein containing humanbeta-defensin-2 in E. coli cell-free system[J]. Jounal of Biotechnology, : 307~31.
　　[18] VALORE E V, GANZ T. Laboratory production of antimicrobial peptides in native conformation[J]. MethodsMol Biol, 5~131.
　　[19] PIERS K L, BROWN M H. HANCOCK E W. Recombinant DNA procedures for producing smallantimicrobial cationic peptides in bacteria[J]. Gene, : 7~13.
　　[20] SAMBROOK J, RUSSELL D W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3nd ed[M]. Beijing: Cold SpringHarbor Laboratory Press, 2002.
　　[21] BARRELL P J, LIEW O W, CONNER A J. Expreasing an antibacterial prorein in bacteria for raisingantibodies[J]. Protein Expr Purif, ): 153~159.
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