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不同倍性泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系的建立及特性分析--《大连海洋大学》2014年硕士论文
不同倍性泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)鳍细胞系的建立及特性分析
【摘要】:采用组织块培养法启动二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍组织细胞原代培养,胰蛋白酶消化法传代,目前二倍体、三倍体和四倍体细胞已经分别传至84代、75代和68代。三种细胞均为成纤维细胞样细胞。鳍组织无菌处理方法是:先用质量浓度为10%的碘伏浸泡15min;后用青霉素和链霉素的混合液(500IU/mL青霉素,500μg/mL链霉素)浸泡30min;原代培养和早期传代培养所用的培养基为DMEM/F12,添加体积分数为20%的胎牛血清、10ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、20ng/mLI型胰岛素样生长因子(IGF-I)以及10μg/mL硫酸软骨素。30代以后所用培养基为20%FBS-DMEM/F12。细胞培养在25℃、5%CO2培养箱中。对培养的二倍体、三倍体和四倍体细胞进行染色体分析,特征染色体数目分别为50、75和100,同时进行了微卫星实验确定培养的细胞系为二倍体、三倍体和四倍体泥鳅鳍细胞系,分别命名为:DIMF、TRMF和TEMF。
在以上培养条件下,二倍体、三倍体和四倍体的倍增时间分别为48.43h、36.01h和41.45h;测定的二倍体、三倍体和四倍体细胞及核的体积比分别为1:1.37:2.37和1:1.53:1.97;细胞经液氮冷冻保存60d后,解冻复苏后测定存活率分别为(80.88±1.38)%,(84.48±1.13)%,(81.57±1.28)%。培养至60代以后的二倍体和三倍体细胞染色体未出现变异,特征染色体数目仍为50和75,而四倍体细胞染色体出现变异,特征染色体数目变为96。不同倍性的泥鳅细胞系的建立丰富了鱼类细胞系的种类,为揭示多倍体鱼类生长、遗传等机制打下基础。
【关键词】:
【学位授予单位】:大连海洋大学【学位级别】:硕士【学位授予年份】:2014【分类号】:S966.4【目录】:
摘要3-4Abstract4-5目录5-7第一章 文献综述7-13 1.鱼类细胞培养方法7-8
1.1 鱼类原代培养方法7
1.2 鱼类细胞培养常用培养基及添加物7-8
1.3 鱼类细胞体外培养条件的优化与建系方法8 2.鱼类细胞系建系意义及其应用8-11
2.1 鱼类细胞系在病毒学中的应用9
2.2 鱼类细胞系在遗传学中的应用9-10
2.3 鱼类细胞系在环境毒理学中的应用10
2.4 鱼类细胞系在鱼类肿瘤研究中的应用10
2.5 鱼类细胞系在种质资源中的应用10-11 3.鱼类细胞系建立的研究进展及展望11-12
3.1 国外鱼类细胞系建立状况11
3.2 国内鱼类细胞系建立状况11
3.3 展望11-12 4.本论文的研究目的及意义12-13第二章 不同倍性泥鳅鳍细胞系的建立及鉴定13-23 1.材料与方法13-16
1.1 材料13-14
1.1.1 实验材料13
1.1.2 实验仪器13
1.1.3 实验试剂13-14
1.2 方法14-16
1.2.1 原代培养14
1.2.2 传代培养14
1.2.3 细胞保存14-15
1.2.4 染色体分析15
1.2.5 微卫星试验15-16 2.结果16-20
2.1 原代培养16
2.2 传代培养及细胞系的建立16-17
2.3 细胞保存17
2.4 染色体分析17-19
2.5 微卫星试验19-20 3.讨论20-21
3.1 泥鳅鳍细胞系建立方法20-21
3.2 泥鳅鳍细胞染色体分析21
3.3 微卫星实验21 4.本章小结21-23第三章 不同倍性泥鳅鳍细胞系生物学特性分析23-34 1.材料与方法23-25
1.1 材料23-24
1.1.1 实验材料23
1.1.2 实验仪器23
1.1.3 实验试剂23-24
1.2 方法24-25
1.2.1 生长曲线测定24
1.2.2 细胞大小及细胞核大小测定24
1.2.3 细胞系的遗传稳定性24
1.2.4 病毒感染实验24-25
1.2.5 数据处理25 2.结果25-31
2.1 生长曲线测定25-26
2.2 细胞大小及细胞核大小26-27
2.2.1 细胞大小26
2.2.2 细胞核大小26-27
2.3 细胞系的遗传稳定性27-29
2.4 病毒感染实验29-31
2.4.1 两种病毒对三种细胞系的感染实验29-30
2.4.2 SVCV 在三种细胞系上的滴度测定30-31
2.4.3 对细胞系繁殖的 SVCV 的收获、滴度测定31 3.讨论31-32
3.1 细胞大小及增殖情况比较31
3.2 细胞系的遗传稳定性31-32
3.3 病毒敏感性32 4.本章小结32-34结论34-35参考文献35-40攻读硕士期间发表的学术论文目录40-43致谢43
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  娃娃鱼小苗不宜使用青霉素
  在许多情况下,人们觉得所有的养殖娃娃鱼,所有的医生,只要蝾螈有缺陷,就是用青霉素类,头孢菌素类药物,我不知道他们学到了什么?去年,一些大鲵养殖户合子走出舱门在房子里,过多的青霉素类和头孢菌素类药物的使用,每天消毒宝贝蛋,以防止霉菌产生炎症。 。 。从技术不当造成的后果是:在2011年买了广大苗孵化彻底农民无所适从。
  以自2011年6月,国内主要生产蝾螈的疾病,特别是苗病是最水肿病,我觉得人买苗回家与过量青霉素的部分原因,头孢等药物造成的后果,有我说的是在养殖户孵化苗进行这样的操作,由于过量的时候,一点点学医的都知道,青霉素类,头孢菌素使用,用量是有讲究的,蝾螈与这些药物,真是前无古人,后无来者!水产养殖教训的人都知道,鸡蛋如何科学的杀菌和防止霉变产生的水,对不对?
  2011年,蝾螈苗等许多省市在全国水肿病,应引起高度关注养殖户,也奉劝那些创新性的技术,不要,如果蝾螈苗在2012年使用,然后是大量的浮肿病,购苗良好的责骂就这些不负责任的家伙,青霉素,庆大霉素,头孢菌素类药物,使用不当和剂量,导致肾脏损害是非常严重的,也没有人告诉。
  水产养殖,注重平时的日常管理科学,运作,尤其是细节,这要讲究科学的重视,预防定期消毒杀菌是举手之劳杀死的小事,很多农民,不重视对这些问题,很多时候在操作,很多养殖户,病种鱼类的极端情况下,过多的人都不是很严重的疾病,但随着使用药物,导致娃娃鱼死亡。
  2011我已经帮助一些农民解剖一些断了气娃娃鱼,分析死亡原因,占大多数的肝脏或肿大血管黑色,紫色,当我看到他们,我觉得这些家伙骂采用大剂量用药。
  蝾螈价格昂贵,担心生病的鱼,你想更害怕服药的病人治好,物极必反的越多,这个深刻的道理需要付出高昂的代价,一年又一年,我仍然不认为农民养殖户使用用药物以防止娃娃鱼,苗买回家,或不听某些人的饮食应该说这种方法组合青霉素,水产养殖必须按照养殖技术来执行,娃娃鱼是不是一个人,所以,再次提醒广大养殖户,农民再不敢滥用药物娃娃鱼。泥鳅养殖问与答-博泰典藏网
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泥鳅养殖问与答
导读:121泥鳅成鱼养殖有哪些养殖方法?,商品泥鳅养殖,一般养殖期为1年,主要的养殖方式有池塘养殖、专用池养殖、稻田养殖、箱式养殖、庭院式养殖、工厂化养殖,112与养殖相关的泥鳅的特性有哪些?,泥鳅适于高密度养殖,养殖成本低,113哪些水域可以养殖泥鳅?,泥鳅养殖可利用土质较肥、有水源保证的连片稻田,小规模养殖可利用低产鱼池、藕塘、育珠塘、小沟渠、低洼地,庭院式养殖可利用房前屋后宅基地、废旧坑凼等,姿势,又可在水箱中加冰,使大容器内的水温低于氧气袋内水温5~8℃,并在运输中继续用冰块保持低温。以降低鱼种的代谢强度,减少其二氧化碳等的排泄量,从而达到提高运输成活率的目的。119怎样进行运输管理?生产生产实践显示:运输鳅鱼死亡的原因主要是水中二氧化碳(包括氨氮)过高,溶氧量降低,引起鱼类麻痹、中毒死亡。根据上述原因,生产中可采取相应措施:⑴ 选择体质健壮的鱼种,做好鱼体锻炼工作 鱼体拖带污泥,游泳不活泼,或多畸形的鱼种,以及身体瘦弱有病受伤的鱼种均不能运输,否则成活率很低。夏花和一龄鱼种在运输前必须做好鱼体的拉网锻炼或暂养吐食,以减少排泄物和提高对缺氧的忍耐力。⑵ 选取良好的运输用水 运输用水应水质清新,溶氧高,含有机质少,无毒无臭的水。同时,在运输重量允许的前提下,适当增加运输用水量,相对降低水体中二氧化碳的浓度,封闭式运输时,氧气袋内加水量不能低于袋总容积的2/5,尽量多加一些,但加水量不要超过袋总容量的1/2。⑶ 保持合适的运输密度 鳅鱼鱼种的运输,因运输时间、温度、鱼体大小和运输工具不一,其装运密度差异很大。通常气温低、运输时间短,运输密度可适当大些。反之,运输密度则减少。⑷ 运输途中的管理 用水箱、鱼桶运输鳅鱼种,必须有专业人员在车上,并配备适量增氧剂备用,管理员随时注意观察鱼的活动情况,及时调节充氧阀门,除去水面漂浮的粪便、残渣及死鱼。途中如发现鱼种浮头需换水时,水质一定要清新,防止污染或太肥的水换入,水温相差5℃以上的水不能大量换入,换水量一般为1/2~1/3。换水操作应仔细,防止鱼体受伤。在途中因换水、增氧不便鱼种出现异常时,可在水中加入一定的药物,以抑制水中的细菌活动,减轻污物的腐败分解。常用的有硫酸铜(浓度0.7毫克/升)、氯化钠(浓度3%)和青霉素(每篓10 000国际单位)。为避免长时间停车或预防意外,可施用增氧剂应急,或通过拍打帆布篓增加溶氧,提高成活率。120 怎样进行鳅种运输后的技术处理?⑴ 温差调节。无论采用哪种运输方法 鳅种到达目的地后,应做好温度调节和降低鱼体血液内的二氧化碳浓度后才能放养。这对长途运输的鳅种尤为重要,否则将前功尽弃。封闭式运输时,先将氧气袋放入待放养的池内,应尽可能使运输泥鳅的水温与准备放养的环境水温相近(两者最大温差不能超过3℃,否则会造成泥鳅死亡),再将袋口打开,把鳅种放入网箱内,并保持箱内水流通畅,待鳅种体恢复正常后迅速下塘。⑵ 鳅种消毒。泥鳅为无鳞鱼,经过长途运输,或多或少都会受一点损伤,尤其是体表粘液脱落较多,且鱼体受伤后易继发水霉病,所以在放养前应对所有鳅种进行消毒,可用浓度3%~4%的食盐水浸洗5~10分钟,能有效防治泥鳅继发感染。121 泥鳅成鱼养殖有哪些养殖方法?商品泥鳅养殖,是将泥鳅种养成每千克约80~100尾,每尾体重10克以上的商品泥鳅,一般养殖期为1年。主要的养殖方式有池塘养殖、专用池养殖、稻田养殖、箱式养殖、庭院式养殖、工厂化养殖等。112 与养殖相关的泥鳅的特性有哪些?泥鳅个体小,有钻泥本能,善逃跑,既可钻孔逃跑,又能越埂、跳跃、附壁攀越。其生长速度不很快,故商品泥鳅食用规格较小。泥鳅抗病力强,食性杂,适应多种水域单养、混养,特别是在浅小水域中照样摄食生长。泥鳅适于高密度养殖,养殖成本低。泥鳅繁殖力较强,其本身又是其他一些特种水产动物的优良活饵料。113 哪些水域可以养殖泥鳅?泥鳅养殖可利用土质较肥、有水源保证的连片稻田,也可利用浅水湖、库、沼泽、滩地等大型水域,小规模养殖可利用低产鱼池、藕塘、育珠塘、小沟渠、低洼地。庭院式养殖可利用房前屋后宅基地、废旧坑凼等。在条件较好的地方也可建造一批专用养鳅池。为减少土方量,节约基建投资,可利用低洼地作埂蓄水后进行养殖。如若进行规模化、工厂化生产,选址应考虑水源有充分保证,给排水系统良好,无涝淹,无工业、农业废水、城市生活污水排放,温度低的地下水不直接进入的地方,同时要交通便利,电力供应、对外联系有保障。泥鳅对水质要求不高,井水、河水、湖水、地下水、自来水都能适应。然而被农药污染或化学药物浓度过高的水对泥鳅生存和生长不利,所以用水、用药、使用肥料都应达到无公害水产品养殖要求。除水质外,土质对泥鳅质量也有较大的影响,在符合无公害养殖场地要求的前提下,选择适宜底质。在底质为沙土的水域中养出来的泥鳅,体乌黑、脂肪少、骨骼硬、肉质较差;而在黏土中养出来的泥鳅则体黄色、脂肪多、骨骼软、味鲜美。所以最好应选含丰富腐殖质的黏土底质地方进行泥鳅养殖。114 泥鳅养殖需有哪些基础设施和准备工作?无论进行何种形式养殖,都应具备一些基本设施和做好前期的准备工作。基本设施以及必要的准备工作主要包括如下几方面。⑴ 整修池埂、田埂,加设防逃设施。通常要求池埂高出水面30厘米,并沿埂坡(水面边缘)加设罩向池中央部位的盖网,防止泥鳅越埂逃窜。⑵ 进、排水口设置防逃栅。在注水管上紧缚一尼龙网袋,可有效地防止污物和敌害进入。出水口防逃栅设计成凸向池塘,分内外两层,内层栅径小,拦泥鳅,也可防敌害进入,外层栅径可大些,即可防水草、污物等。⑶ 平水缺 (溢洪口)建造。平水缺可防止水大、雨暴时漫埂逃鱼。在排水口一侧埂上开设1~2个深5~11厘米,宽1~2 米的平水缺。平水缺口内侧要安装防逃网栅。⑷ 集鱼道 (凼)。为在水量不足、水温过高、稻田施肥施药时泥鳅有躲藏之处,以及捕捞时便于集中收捕,可在养鳅稻田中设环沟、“井”字型沟或按对角线挖30厘米深,长约80~100厘米的集鱼道 (凼)。在养泥鳅的池中央或排水口附近,挖1~5个深40厘米集鱼坑凼。坑凼占全池面积的2%~5%。在设计专用泥鳅池时,事先应设计布局集鱼凼。在集鱼凼底部铺一层厚约10~15厘米的泥土。⑸ 池底坡。主养池在开挖或清整时,池底应向排水口方向倾斜,其倾斜度视塘口面积而定,目的是方便排水和集鱼。125 怎样进行养殖水域清整消毒养殖泥鳅的水域预先应用生石灰、漂白粉等进行清整消毒,除野灭害。一般预先晒塘到塘底有裂缝后再在塘周挖小坑,将块状生石灰放入,浇水化灰并趁热全池泼洒。第二天用耙将石灰与泥拌和。用量一般为每100平方米用生石灰10~15千克。126 怎样采集野生泥鳅种?泥鳅苗种采捕比较容易,从春季到秋季任何时候都可从稻田、河、沟等水域里捕到幼鳅,作为苗种进行成鳅养殖。往往在夏季雨后幼鳅比较集中,如河沟的跌水坑、稻田注水口等处。幼鳅的捕捞方法与成鳅捕捞大致相似。日本有人曾设计了一种在稻田中诱捕幼鳅的装置,捕捉效果很好。方法是采用一段直径约10米水泥短管,直立埋在稻田中。管的上口露出水面30厘米,并用铁皮设置成朝向内面的卷边倒槽,以防泥鳅从上逃出。在管壁与泥相接触的地方设置数个直径约10厘米的圆孔,在这些圆孔上设置向内部伸人的金属网漏斗,成倒须状,网目为3毫米。水泥管内放堆肥、豆饼、米糠、螺肉等饵料引诱幼鳅迸人。据报道,用该装置在7~8月的1个月期间,投诱饵30余千克,从不到1400平方米的稻田内诱捕到幼鳅30~40千克。127 怎样进行鳅种消毒?鳅种放养前应先用2~3%的食盐水浸浴5~10分钟或用10毫克/千克漂白粉溶液浸浴10~20分钟。具体应根据水温和鳅种耐受情况控制浸浴时间。128 如何驯养野生泥鳅?野外捕捉来的鳅种规格不整齐,预先用泥鳅筛按规格分选,做到同一池子放养规格基本一致。另外,野生鳅长期栖息在水田、河湖、沼泽及溪坑等水域中,白天极少到水面活动,夜间才到岸边分散摄食。为了让其适应人工饲养,使它们由分散觅食变为集中到食台摄食,由夜间觅食变为白天定时摄食,由习惯吃天然饵料变为吃人工配合饲料,必须加以驯化。具体做法是,在下塘的第三天晚上(20时左右),分几个食台投放少量人工饲料。以后每天逐步推迟2小时投喂,并逐步减少食台数目。约经10天驯养,使野生鳅适应池塘环境,并从夜间分散觅食转变为白天集中到食台摄食人工配合饲料。如果一个驯化周期效果不佳,可在第一周期获得的成果的基础上,重复上述措施,直至达到目的。129 泥鳅养殖对池塘有哪些要求?池塘养殖泥鳅可以是土池、水泥池。可根据生产目的,放养不同规格的鳅种和稀放鳅苗。收获不同规格要求的商品泥鳅。⑴ 面积。养殖泥鳅池塘的面积一般来说不宜过大,以利于管理。可以根据实际情况,如资金、人力、土地面积、水量、饲料肥料来源、技术、市场等进行规模设计。可单池建造,连片建造和苗池、种地、成品池配套建造。初期上马应尽量利用原有塘、坑、洼地等略加改造成池,以减少基建投入,有赢利后再安排扩大或改造。泥鳅鱼苗池 (兼为产卵、孵化池)每口8~12平方米,鱼种培育池每口20~50平方米。成鳅池每口200~1000平方米,也可根据生产规模、地理环境灵活安排。⑵ 土池。选择保水性能好的黏土或壤土地进行挖方建池,池壁有一定的倾斜。有条件的可用砖、石护坡,水泥勾缝。池底及四壁必须夯实。池深0.6~1米,保水深度30~50厘米。⑶ 水泥池。可建成地下式、地上式或半地上式。池壁多用砖、石砌成,水泥光面,壁顶设约12厘米的防逃倒槽 (约半块砖)。水泥池池底处理非常关键,必要时应先打一层 “三合土”,其上铺垫一层油毛毡或加厚的塑料膜,以防渗漏,然后再在上面浇一层厚5厘米的混凝土。池深根据饲养方式而不同,有土饲养时为0.7~0.8米,无土流水饲养时为0.5米。回填到池底的泥土最好用壤土而不能用黏土。工厂化养殖时应进行专门设计和建造。⑷ 进排水装置。每口土池或水泥池均应设独立的进排水口、溢水口。池底应有1%~2%的比降,以使水能排尽。进水口高于池水水面,排水口设在池底集鱼坑的底面。集鱼坑大小根据池子大小建造。有土饲养时在集鱼坑四周应设挡泥壁,并在泥面水平处增设一个排水口,以便于换水。进排水口及溢水口均应设防逃栅罩。130 池塘养殖泥鳅的放养密度应怎样掌握?一般在每平方米养殖池中可放养水花鳅苗(孵出约2~4天苗)800~7000尾,放养体长1厘米 (约10日龄)小苗500~1000尾,放养体长3~4厘米夏花100~150尾,体长为5厘米以上则可放养50~80尾。有微流水条件的可增加放养量,条件差的则减量。131 成鳅养殖过程中如何施肥投饲?⑴ 施足基肥。放种前按常规要求清塘消毒后施足基肥,每100平方米可施10~20千克干鸡粪或50千克猪、牛粪,2周后放种。⑵ 巧施追肥。泥鳅是杂食性鱼类,喜食水蚤、丝蚯蚓及其他浮游生物。在商品鳅养殖期间抓好水质培育是降低养殖成本的有效措施,同时合乎泥鳅生理生态要求,可弥补人工饲料营养不全和摄食不均匀的缺点,还可减少病害发生,提高产量。放养后根据水质施用追肥,保持水质一定肥度,使水体始终处于活爽状态。也可在池的四周堆放发酵腐熟后的有机肥或泼洒肥汁。⑶ 饲料准备。在人工养殖条件下,为了达到预期产量,在充分培养天然饵料的基础上还必须人工投喂。因此,在规划养殖的同时,就应准则充足的饲料,进行规模化、工厂化养殖时更为重要。泥鳅食性广泛,饮料来源广,除了麦类、豆粕外,也可广泛收集农副产品加工下脚料,也可专门培养泥鳅喜食的活饵料。⑷ 人工投饲。在投喂中应注意饵料质量,做到适口、新鲜。主要投喂当地数量充足、较便宜的饲料,这样不致使饲料经常变化,而造成泥鳅阶段性摄食量降低。饲料要新鲜,不投变质饲料。在离池底约10~15厘米处建食台,做到投饲上台。要按“四定”原则投喂。即定时:每天2次 (9:00和16:00 ~17:00)。定量:根据泥鳅生长不同阶段和水温变化,在一段时间内投喂量相对恒定。定位:在每100平方米的池中设直径30~50厘米固定的圆形食台。定质:做到不喂变质饲料,饲料组成科学,营养全面平衡。每天投喂量应根据天气、温度、水质等情况随时调整。当水温高于30℃时和低于12℃时少喂,甚至停喂。要抓紧开春后水温上升时期的喂食及秋后水温下降时期的喂食,做到早开食,晚停食。包含总结汇报、自然科学、表格模板、外语学习、高中教育、高等教育、农林牧渔以及泥鳅养殖问与答等内容。本文共32页
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