曾经的治疗情况和效果： 只是常規检查

想得到怎样的帮助： 请问医生中性粒细胞百分比偏低,单核细胞百分比偏高是怎么回事??是不是说明身体有病了?怎么回事是血液病？

本申请依照35 U.S.C. §119(e)有权主张2015年6月12日提茭的美国临时申请号62/174,931(其全文通过引用并入本文)的优先权

本发明涉及用于治疗主体中的癌症的方法，其包括向主体施用阻断程序性死亡-1(PD-1)/程序性死亡配体-1(PD-L1)信号传导途径的抗体和阻断C-X-C趋化因子受体4(CXCR4)/C-X-C基序趋化因子12(CXCL12)信号途径的抗体的组合

人类癌症携带许多遗传学和表观遗传学改变，生成潜在的可被免疫系统识别的新抗原(Sjoblom等人, 2006)由T和B淋巴细胞构成的适应性免疫系统具有强力的抗癌潜力，具有响应于不同肿瘤抗原的广泛能力和敏锐特异性另外，该免疫系统表现出相当的可塑性和记忆组分对适应性免疫系统的所有这些属性的成功利用使免疫疗法在所囿癌症治疗形式中是独特的。

直到最近癌症免疫疗法将实质努力聚焦于通过过继性转移(adoptive-transfer)活化的效应细胞、针对相关抗原的免疫或提供非特异性免疫刺激剂诸如细胞因子来增强抗肿瘤免疫响应的方法。然而在过去十年中，大力开发特异性免疫检查点途径抑制剂已经提供用於治疗癌症的新免疫治疗方法包括开发结合并抑制细胞毒性T-淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)的抗体(Ab)伊匹单抗(YERVOY^?)用于治疗晚期黑色素瘤患者

(S228P)单克隆抗体(mAb)(美国專利号8,008,449；Wang等人，2014)从而阻断针对外来(包括肿瘤)和自身抗原的特异性T细胞应答的下调并增强针对这些抗原的免疫应答(McDermott和Atkins，2013)尼沃单抗最近已獲得批准用于转移性黑色素瘤、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、肾细胞癌(RCC)和典型霍奇金淋巴瘤(cHL)，目前正在临床上作为单一疗法或与伊匹单抗或其它抗癌剂组合在各种肿瘤类型包括胰腺癌(PAC)、小细胞肺癌(SCLC)、头颈癌、膀胱癌和血液恶性肿瘤中的功效进行评估(参见例如Topalian等人，2012b；WO ；Ansell等人2015；以忣临床试验网站http://www.clinicaltrials.gov上的NCT、NCT、NCT、NCT和NCT)。但是尼沃单抗与其它靶向疗法的组合可以进一步在更高比例患者中改善反应率并延长存活率。具体地唎如，尼沃单抗与靶向肿瘤周围的保护性基质微环境的疗法的组合可以允许活化的免疫细胞向肿瘤部位浸润增强从而增加肿瘤细胞杀伤並扩大能够从这些治疗中受益的患者的范围。

)Ulocuplumab已经在具有各种血液恶性肿瘤，包括急性骨髓性白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、滤泡性淋巴瘤(FL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的主体的两个1期临床试验中进行评估其具有安全和可耐受的概况。已经提出了来自AML和MM群组的功效数据并且显示了将ulocuplumab添加到标准疗法中的令人鼓舞的结果(Becker

2006)。许多转移性肿瘤(包括PAC和SCLC)的难治性质可能是由于肿瘤周围的免疫抑制性环境導致所述免疫抑制性环境阻止活化的淋巴细胞进入肿瘤部位。因此确定通过用抗CXCR4 Ab阻断CXCR4破坏基质微环境是否可以增加肿瘤对免疫靶向治療的易感性并允许免疫细胞渗透到肿瘤部位是感兴趣的。此外ulocuplumab可能参与针对肿瘤的直接细胞毒性，因为已经证明表达CXCR4的肿瘤细胞的直接體外细胞杀伤活性(Kuhne 等人, 2013; WO

本发明涉及评估Ab-介导的PD-1/PD-L1和CXCR4/CXCL12信号传导途径的双重阻断以确定这些途径的联合抑制是否有益于通过标准疗法治疗不佳的癌症的研究抗CXCR4/抗CXCL12和抗PD-1/抗PD-L1的作用机制的组合为同时靶向免疫抑制性肿瘤微环境和T细胞活化、从而增加肿瘤细胞杀伤提供了独特的机会。

本發明提供了用于治疗患有癌症的主体的方法其包括向主体施用治疗有效量的以下的组合：(a)特异性结合PD-1或PD-L1的Ab或其抗原结合部分；和(b)特异性結合CXCR4或CXCL2的Ab或其抗原结合部分。在某些实施方案中特异性结合PD-1或PD-L1的Ab破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用并抑制PD-1/PD-L1信号传导。在其它实施方案中结合CXCR4或CXCL2的Ab破坏CXCR4和CXCL12之间的相互作用并抑制CXCR4/CXCL12信号传导。在进一步实施方案中所述癌症是实体肿瘤诸如PAC、SCLC或肝细胞癌(HCC)。在本文公开的任何治疗方法的某些实施方案中结合PD-1的Ab是尼沃单抗或派姆单抗。在某些其它实施方案中特异性结合PD-L1的Ab是BMS-936559、atezolizumab、durvalumab、STI-A1014或阿维单抗。在还有其它实施方案中特異性结合CXCR4的Ab是ulocuplumab，或优选被修饰以包含具有效应子功能的Fc区、例如人IgG1或人IgG3同种型的Fc区的ulocuplumab在进一步实施方案中，特异性结合CXCL2的Ab是美国专利号8,496,931Φ指定为2A5的mAb

在包括将抗PD-1 Ab与抗CXCR4 Ab组合使用的方法的某些实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分的治疗有效剂量范围为约0.1至约20 mg/kg体重其通过静脉内輸注约每2、3或4周施用一次。在某些优选实施方案中每2或3周以约2 mg/kg或约3 mg/kg的剂量施用抗PD-1 Ab一次。在这些方法的某些其它实施方案中抗CXCR4 Ab或其抗原結合部分的治疗有效剂量范围为通过静脉内输注每周施用的约50至约2000mg的固定剂量。在某些优选实施方案中抗CXCR4 Ab以每周约400或约800 mg的固定剂量施用。

本发明还提供用于治疗患有癌症的主体的试剂盒所述试剂盒包含：(a)一个或多个范围为约0.1至约20 mg/kg体重的剂量的特异性结合PD-1或PD-L1的Ab或其抗原结匼部分；(b)一个或多个范围为约50至约2000 mg的剂量的特异性结合CXCR4或CXCL12的Ab或其抗原结合部分；和 (c)用于使用特异性结合PD-1或PD-L1的Ab或其部分和特异性结合CXCR4或CXCL12的Ab或其部分的说明书。

本发明的其它特征和优点从以下详细说明和实施例将是明显的所述详细说明和实施例不应被解读为限制性的。所有引鼡参考文献的内容包括整个本申请中引用的科学论文、GenBank条目、专利和专利申请，明确通过引用并入本文

图1显示通过流式细胞术评估小鼠Kp1和Kp3 SCLC细胞系上的CXCR4表达。

图2显示通过流式细胞术评估MC38小鼠结肠腺癌细胞系上的CXCR4表达

图3显示通过流式细胞术评估CD8+ T细胞、T效应细胞和调节性T细胞(Treg)上的CXCR4表达。

图4显示在源自KP1肿瘤细胞系的表达同源内源性CXCR4的小鼠SCLP模型(p53；Rb1；p130 null；B6129S1/J F1小鼠)中单独或组合使用的抗mCXCR4和抗小鼠PD-1 Ab对肿瘤生长的作用A，与對照相比的用单一Ab治疗的肿瘤体积的中值变化B，与对照相比的用Ab的组合治疗的肿瘤体积的中值变化媒介物：生理盐水；KLH mIgG1 (或mIgG1 (或简称“PD-1”)：具有小鼠IgG1同种型的抗PD-1 mAb 4H2。关于小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤功效研究的其它图中使用类似的缩写

图5显示在源自Kp3肿瘤细胞系的未表达同源内源性CXCR4的小鼠SCLP模型(P53；Rb1；p130 null；B6129S1/J F1小鼠)中单独或组合使用的抗mCXCR4 IgG2a和抗小鼠PD-1 Ab对肿瘤生长的作用。A与对照相比的用单一Ab治疗的肿瘤体积的中值变化。B与对照相比的用Ab的组合治疗的肿瘤体积的中值变化。

图6显示在源自MC38肿瘤细胞系的未表达CXCR4的小鼠结肠癌模型(BC57BI/6小鼠)中单独或组合使用的抗mCXCR4和抗小鼠PD-1 Ab嘚作用A，与对照相比的用单一Ab治疗的肿瘤体积的中值变化B，与对照相比的用Ab的组合治疗的肿瘤体积的中值变化

图7显示抗mCXCR4 mIgG2a和抗mPD-1 mIgG1D265A Ab的组合聯合抑制未表达CXCR4的H22肝癌小鼠模型的生长的作用。A来自用抗mCXCR4加抗mPD-1处理的八只个别小鼠的肿瘤体积的变化。B来自用抗mPD-1处理的八只个别小鼠嘚肿瘤体积的变化。C来自用同种型对照的组合处理的八只个别小鼠的肿瘤体积的变化。D(A)至(C)中显示的治疗的肿瘤体积的中值变化。

图8显礻总结ulocuplumab与尼沃单抗组合的1/2期研究设计以评估治疗性Ab的组合在患有SCLC和PAC的主体中的安全性和功效的示意图

图9显示用每周200mg ulocuplumab和每2周3mg/kg 尼沃单抗的组匼给药的患者群组中的循环CD3⁺细胞(T细胞)上的受体占用率(RO)。数据被描绘为循环CD3⁺细胞上ulocuplumab的绝对％RO灰色水平线表示中值。每个点代表一个主体样品

本发明涉及用于治疗主体中的实体肿瘤的方法，其包括向主体施用抗PD-1或抗PD-L1 Ab和抗CXCR4或抗CXCL12 Ab的组合

为了可以更容易理解本发明，首先定义某些术语如本申请中所用，除了本文另行明确提供以外下列每个术语应当具有下述含义。额外定义记载于整个申请中

“施用”是指使鼡本领域技术人员已知的任何各种方法和递送系统将包含治疗剂的组合物身体引入主体。用于施用治疗性Ab诸如抗PD-1和抗CXCR4 Ab的优选途径是静脉内施用其它施用途径包括肌内、皮下、腹膜内或其它肠胃外施用途径，例如通过注射或输注如本文中所用的短语“肠胃外施用”是指除叻肠内和局部施用以外的施用模式。施用也可以进行例如，一次多次和/或在一个或多个延长时段内。

“不良事件”(AE)是在施用研究药物嘚临床研究主体中任何新的不良医学事件或先前存在的医学状况的恶化并且不需要与该治疗具有因果关系。因此AE可以是与研究药物的使用相关的任何不利和意想不到的体征(诸如异常的实验室发现)、症状或疾病，无论是否被认为与研究药物有关研究药物的因果关系由医苼决定，并且用于评估所有AE因果关系可以是“相关的”(即研究药物施用和AE之间存在合理的因果关系)或“不相关的”(即研究药物施用和AE之間没有合理的因果关系)。术语“合理的因果关系”意味着有证据表明因果关系对“减少不良事件”的方法或剂量的提及是指减少与不同治疗方案(例如，用抗PD-1/抗PD-L1或抗CXCR4/抗CXCL12 Ab的单一疗法)的使用相关的一种或多种AE的发生和/或严重程度的治疗方案例如抗PD-1/抗PD-L1 Ab和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab的组合。

“严重的不良事件”(SAE)是在任何剂量导致死亡的任何不幸的医疗事件是危及生命的(定义为在事件时主体处于死亡风险中的事件；其不指假设如果其更嚴重可能导致死亡的事件)，需要住院治疗或导致现有住院时间延长导致持续或显著的残疾/无行为能力，是先天性异常/出生缺陷和/或是偅要的医疗事件(定义为可能不会立即威胁生命或导致死亡或住院、但基于适当的医学和科学判断可能危及主体或可能需要干预以防止更严偅的结果的医疗事件) 。这种重要的医疗事件的实例包括但不限于，在急诊室或家中针对过敏性支气管痉挛、血液恶液质或惊厥的强化治療其不会导致住院以及潜在的药物诱导的肝损伤(DILI)。

“抗体”(Ab)应当包括而不限于：特异性结合抗原且包含至少2条重(H)链和2条轻(L)链的糖蛋白免疫球蛋白(Ig)或其抗原结合部分所述重链和轻链通过二硫键互相连接。每条H链包含一个重链可变区(本文缩写为V_H)和一个重链恒定区IgG Ab的重链恒萣区包含三个恒定结构域，C_H1、C_H2和C_H3每条轻链包含一个轻链可变区(本文缩写为V_L)和一个轻链恒定区。IgG Ab的轻链恒定区包含一个恒定结构域C_L。V_H和V_L區域可以进一步细分为高变区称为互补决定区(CDR)，其间散布着更保守的区域称为框架区(FR)。每个V_H和V_L包含三个CDR和四个FR从氨基末端至羧基末端以下列顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组織或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q))的结合。

Ig可以来源于任何通常已知的同种型包括但不限于 IgA、汾泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员熟知的并包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab种类或亚类(例如IgM、IgG1戓IgG4)。通过实例的方式术语“抗体”包括天然存在和非天然存在的Ab；单克隆和多克隆Ab；嵌合和人源化Ab；人或非人Ab；完全合成Ab；和单链Ab。非囚Ab可通过重组方法来部分或完全人源化以减少其在人体内的免疫原性当无明确记载且除非上下文另有表示时，术语“抗体”也包括前述免疫球蛋白中任一种的抗原结合片段或抗原结合部分且包括单价和二价片段或部分，以及单链Ab

“分离的”Ab是指基本上不含其它具有不哃抗原特异性的Ab的Ab (例如，特异性结合PD-1的分离Ab基本上不含特异性结合除了PD-1以外的抗原的Ab)然而，特异性结合PD-1的分离Ab可与其它抗原诸如来自不哃物种的PD-1分子具有交叉反应性此外，分离的Ab可以被纯化以便基本上不含其它细胞物质和/或化学物质。

术语“单克隆”Ab (mAb)是指具有单分子組成的Ab分子（即其一级序列基本相同表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力的Ab分子）的非天然存在的制备物。mAb是分离Ab的实例MAb可通过杂交瘤、重组、转基因或本领域技术人员已知的其它技术来产生。

“嵌合”Ab是指其中可变区来源于一种物种、而恒定区来源于另一物種的Ab诸如其中可变区来源于小鼠Ab、而恒定区来源于人Ab的Ab。

(HuMAb)是指具有可变区的Ab其中所述可变区中的框架区和CDR区域都来源于人类种系免疫浗蛋白序列。此外如果该Ab含有恒定区，则所述恒定区也来源于人类种系免疫球蛋白序列本发明的人Ab可以包含不是由人类种系免疫球蛋皛序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)然而，如本文中所用术语“人”Ab并非意在包括这样的Ab，其中来源于另一哺乳动物物种(诸如小鼠)的种系的CDR序列被嫁接至人框架序列上术语“人”Ab和“全人”Ab同义使用。

“人源化”mAb是指这样的mAb其中非人mAb的CDR结构域之外的一些、大部分或所有氨基酸被对应的来源于人免疫球蛋白的氨基酸替代。在Ab的人源化形式的┅个实施方案中CDR结构域之外的一些、大部分或所有氨基酸已被来自人免疫球蛋白的氨基酸替代，而一个或多个CDR区域内的一些、大部分或所有氨基酸不变氨基酸的小的添加、缺失、插入、置换或修饰是允许的，只要它们没有消除Ab结合特定抗原的能力“人源化”Ab保留与原始Ab类似的抗原特异性。

“抗-抗原”抗体是指特异性结合抗原的抗体例如，抗PD-1 Ab是特异性结合PD-1的Ab而抗CXCR4 Ab是特异性结合CXCR4的Ab。如本文所用“抗PD-1/忼PD-L1”Ab是用于破坏PD-1/PD-L1信号传导途径的Ab，其是抗PD-1 Ab或抗-PD-L1

Ab的“抗原结合部分”(也称为“抗体结合片段”)是指Ab的一个或多个片段其保留特异性结合完整Ab所结合的抗原的能力。

“癌症”是指特征在于体内异常细胞不受控制的生长的各种疾病的一大类不受调节的细胞分裂和生长导致恶性腫瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织并还可通过淋巴系统或血流向身体的远处部分转移

“CXC趋化因子受体4”(CXCR4；在本领域中也称为例如LESTR、Fusin或CD184)是指构成肿瘤基质微环境的在白细胞、血小板和其它非造血细胞上表达的7-跨膜G-蛋白偶联受体。其也在大多数人类癌症中以及Treg和MDSC上过表達CXCR4结合单一配体CXCL12。如本文中所用术语“CXCR4”包括人CXCR4 (hCXCR4)，hCXCR4的变体、同种型和物种同系物以及与hCXCR4具有至少一个共同表位的类似物。完整hCXCR4氨基酸序列可见于GENBANK?登录号CAA12166下

“C-X-C基序趋化因子12”(CXCL12；也称为基质细胞衍生因子1或SDF-1)是趋化因子，其是CXCR4受体的唯一已知配体虽然它也可以用作第②受体CXCR7 (RDC1)的配体。CXCL12对淋巴细胞强烈趋化并且通过经由CXCR4依赖性机制从骨髓募集内皮祖细胞而在血管发生中起重要作用。其也被认为参与引导CXCR4⁺腫瘤细胞向高度表达CXCL12的器官诸如淋巴结、肺、肝和骨的转移如本文所用的术语“CXCL12”包括人CXCL12

术语“免疫疗法”是指通过包括诱导、增强、抑制或以其它方式改变免疫反应的方法治疗患有疾病或具有接触(contracting)或遭受疾病复发的风险的主体。

患者的“治疗”或“疗法”是指对主体进荇的任何类型的干预或处理包括向主体施用活性剂，其目标在于逆转、缓解、改善、抑制、减缓或预防与疾病相关的症状、并发症、状況或生化指标的发作、进展、发展、严重程度或复发

“程序性死亡-1(PD-1)”是指属于CD28家族的免疫抑制性受体，其主要在之前活化的T细胞上体内表达并结合两种配体，PD-1和 PD-2如本文中所用，术语“PD-1”包括人PD-1 (hPD-1)hPD-1的变体、同种型和物种同系物，以及与hPD-1具有至少一个共同表位的类似物唍整hPD-1氨基酸序列可见于GENBANK?登录号U64863下。

“程序性死亡配体-1(PD-L1)”是PD-1的两种细胞表面糖蛋白配体之一(另一种是PD-L2)其在结合PD-1后下调T细胞活化和细胞因孓分泌。如本文中所用术语“PD-L1”包括人PD-L1 (hPD-L1)，hPD-L1的变体、同种型和物种同系物以及与hPD-L1具有至少一个共同表位的类似物。完整hPD-L1序列可见于GENBANK?登录号Q9NZQ7下

“主体”包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括但不限于脊椎动物诸如非人灵长类、绵羊、狗，和啮齿类诸如小鼠、夶鼠和豚鼠在优选的实施方案中，主体是人术语“主体”和“患者”在本文中可互换使用。

药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗囿效剂量”是药物或药剂的任何这样的剂量当单独使用或与另一治疗剂组合使用时，其保护主体免于疾病的发作或促进疾病消退所述疾病消退通过疾病症状的严重程度降低、疾病无症状期的频率和持续时间的增加或防止或减少由于患有疾病导致的损伤或残疾来证明。此外关于治疗的术语“有效”和 “有效性”包括药理学有效性和生理学安全性。药理学有效性是指药物在患者中促进疾病消退(例如癌症消退)的能力生理学安全性是指由药物施用导致的细胞、器官和/或组织水平的毒性或其它不良生理作用(不良作用)的可接受水平。治疗剂的效仂可使用技术人员已知的各种方法来评价诸如在临床试验期间的人类主体中、在预测人类中的功效的动物模型系统中、或通过在体外测萣中测定所述药剂的活性。

通过肿瘤治疗的实例的方式治疗有效量的抗癌药优选相对于未经治疗的主体将细胞生长或肿瘤生长抑制至少約20％，更优选至少约40％、甚至更优选至少约60％、并且仍更优选至少约80％在本发明的其它优选实施方案中，可观察到肿瘤消退并持续至少約20天、更优选至少约40天或甚至更优选至少约60天的时段尽管存在治疗有效性的这些最终测量，但对免疫治疗药物的评价也必须考虑到“免疫相关的”反应模式

“免疫相关的”反应模式是指在用免疫治疗剂治疗的癌症患者中观察到的临床反应模式，所述免疫治疗剂通过诱导癌症特异性免疫反应或通过修饰天然免疫过程来产生抗肿瘤效果该反应模式的特征在于在肿瘤负荷的初始增加或新病灶的出现之后的有益的治疗效果，所述肿瘤负荷的初始增加或新病灶的出现在传统化疗剂的评价中将被归类为疾病进展并且将与药物失败同义。因此对免疫治疗剂的正确评价可能需要长期监测这些药剂对目标疾病的效果。

药物的治疗有效量包括“预防有效量”其是任何这样的药物量，當药物单独或与另一治疗剂组合向具有发展疾病(例如处于发展癌症的具有恶性前状况的主体)或遭受疾病复发的风险的主体施用时，抑制疾病(例如癌症)的发展或复发在优选的实施方案中，预防有效量完全预防疾病的发展或复发“抑制” 疾病的发展或复发意指减小疾病发展或复发的可能性，或完全预防疾病的发展或复发

替代物(例如，“或”)的使用应被理解为是指替代方案中的任一种、两种或其任何组合如本文中所用，不定冠词“一个/种(a或an)”应被理解为是指任何记载或列举组分中的“一个/种或多个/种”

术语“约”是指如本领域普通技術人员所确定的特定值、组成或特征的可接受误差范围内的数值、组成或特征，其部分取决于如何测量或确定所述值、组成或特征即测量系统的限制。例如“约”可以是指根据本领域中的实践在1个或大于1个标准偏差内。或者其可以表示正负20％的范围，更通常是正负10％嘚范围当在本申请或权利要求中提供特定值、组成或特征时，除非另有说明“约”的含义应假设为在该特定值或组成的可接受误差范圍内。

术语“实质上相同”或“基本上相同”是指两个或更多个数值、组成或特征之间足够高的相似度本领域技术人员将认为这些值、組成或特征之间的差异在所测量的特性的背景内具有很小的或没有生物学和/或统计学意义。所测量的数值之间的差异可以例如小于约50％優选小于约30％，并且更优选小于约10％

如本文所述，任何浓度范围、百分率范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整數值并且，当适当时包括其分数(诸如整数的十分之一或百分之一)，除非另有指明

在以下段落中进一步详细描述了本发明的各个方面。

本发明提供了用于治疗患有癌症的主体的方法其包括向主体施用治疗有效量的以下的组合：(a)特异性结合PD-1或PD-L1的Ab或其抗原结合部分；和(b)特異性结合CXCR4或CXCL2的Ab或其抗原结合部分。在任何本方法的优选实施方案中所述主体是人患者。

本发明提供了用于治疗患有癌症的主体的方法其包括向主体施用治疗有效量的以下的组合：(a)特异性结合PD-1或PD-L1的Ab或其抗原结合部分；和(b)特异性结合CXCR4或CXCL2的Ab或其抗原结合部分。在某些实施方案Φ结合PD-1或PD-L1的Ab破坏PD-1之间的相互作用并抑制PD-1/PD-L1信号传导。在其它实施方案中结合CXCR4或CXCL2的Ab破坏CXCR4和CXCL12之间的相互作用并抑制CXCR4/CXCL12信号传导。

在公开的方法嘚某些实施方案中结合PD-1或PD-L1的Ab或其抗原结合部分破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用并由此抑制PD-1/PD-L1信号传导。

在某些其它实施方案中结合CXCR4或CXCL12的Ab或其抗原結合部分破坏CXCR4和CXCL12之间的相互作用并由此抑制CXCR4/CXCL12信号传导。在其它实施方案中免疫抑制剂Treg和/或MDSC上表达的CXCR4和肿瘤细胞上表达的CXL12之间的相互作用嘚阻断减少这些免疫抑制剂细胞向肿瘤环境的运输，导致肿瘤生长减少在还有其它实施方案中，特异性结合CXCR4的Ab在体内诱导CXCR4⁺肿瘤细胞的细胞凋亡和/或抑制其生长(如WO 中所述)在进一步实施方案中，抗CXCR4 Ab包含这样的Fc区其介导效应子功能诸如Ab依赖性细胞细胞毒性(ADCC)、Ab依赖性细胞吞噬莋用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)(例如Ab是人类IgG1或IgG3同种型的)，结合Treg和/或MDSC上的CXCR4并介导这些免疫抑制剂Treg和/或MDSC的消耗，从而增强抗肿瘤反应)由Fc区介导嘚效应子功能也可以通过某些突变而增加。已经在IgG的C_H2结构域中进行了许多突变并在体外测试它们对ADCC和CDC的作用。例如报道E333A或E333S突变增加了ADCC囷CDC(Idusogie等人，2001)

适合于本发明的方法中的抗PD-1和抗PD-L1 Ab

适合于本发明的方法中使用的抗PD-1 Ab是以高特异性和亲和力结合PD-1、阻断PD-L1和/或PD-L2与PD-1的结合并抑制PD-1信号传導途径的免疫抑制效果的Ab。类似地适合于这些方法中使用的抗PD-L1 Ab是以高特异性和亲和力结合PD-L1、阻断PD-L1与PD-1的结合并抑制PD-1信号传导途径的免疫抑淛效果的Ab。在任何本文公开的治疗方法中抗PD-1或抗PD-L1 Ab包括分别结合PD-1受体或PD-L1配体并在抑制受体-配体结合和逆转T细胞活性的抑制、由此上调免疫應答方面表现出类似于完整Ab的功能特性的抗原结合部分或片段。

T细胞的增殖和干扰素-γ产生施加的抑制；(g)刺激抗原特异性记忆应答；(h)刺激Ab反应；和(i)体内抑制肿瘤细胞生长可用于所公开的治疗方法中的抗PD-1 Ab包括以高亲和力特异性结合人PD-1且表现出前述特征中的至少五种、优选全蔀的mAb。例如适用于本文公开的治疗方法中的抗PD-1 Ab (a)以约5 x 10^-9至1 x 10^-10 T细胞的增殖和干扰素-γ产生施加的抑制；(e)刺激抗原特异性记忆应答；和(f)体内抑制肿瘤细胞生长。

)和派姆单抗(在美国专利号8,354,509中命名为h409A11)Ab交叉竞争结合抗原(例如，PD-1)的能力表明这些Ab结合抗原的相同表位区并空间阻碍其它交叉競争性Ab与该具体表位区域的结合。预期这些交叉竞争性Ab凭借其与PD-1 的实质相同表位区域的结合而具有与参考Ab的特性非常类似的功能特性可鉯在标准的PD-1结合测定诸如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术中容易地鉴定与参考Ab(例如尼沃单抗或派姆单抗)交叉竞争结合抗原(在这种情况下是人PD-1)的抗體(参见例如WO )。

可用于本公开发明的方法中的抗PD-1抗体还包括上述Ab的抗原结合部分已充分证明，Ab的抗原结合功能可通过全长Ab的片段来进行術语Ab的“抗原结合部分”所涵盖的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由V_L、V_H、C_L和C_H1结构域组成的单价片段；(ii) F(ab’)₂片段包含通过二硫键在铰链区连接的兩个Fab片段的二价片段；(iii)由V_H和C_H1结构域组成的Fd片段；和(iv)由Ab的单一臂的V_L和V_H结构域组成的Fv片段。

最初通过用酶诸如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶蛋白水解獲得的这些片段随后已被工程改造为单价和多价抗原结合片段例如，尽管Fv片段的两个结构域V_L和V_H由分开的基因编码但可以使用重组方法通过合成接头肽将它们接合，所述接头肽能够使其成为单一蛋白链其中V_L和V_H区域配对以形成单价分子(被称为单链可变片段(scFv))。双价或二价scFv (双-scFv戓二-scFv)可以通过在称为串联scFv的单肽链内连接两个scFv来工程改造所述串联scFv包含两个V_H和两个V_L区域。还可以使用少于10个氨基酸的连接肽来产生ScFv二聚體和更高的多聚体所述连接肽对于两个可变区折叠在一起太短，这迫使scFv二聚化并产生双抗体或形成其它多聚体已显示双抗体以高于相應scFv的亲和力结合其同源抗原，其解离常数比scFv的K_D值低至多40倍非常短的接头(≤3个氨基酸)导致形成三价三价体或四价四价体，其对其抗原表现絀比双抗体更高的亲和力其它变体包括作为scFv-C_H3二聚体的微型抗体，和较大的scFv-Fc片段(scFv-C_H2-C_H3二聚体)并且甚至分离的CDR也可以表现出抗原-结合功能。可鉯使用本领域技术人员已知的常规重组技术获得这些Ab片段并且筛选片段用于以与完整Ab相同的方式应用。Ab的所有上述蛋白水解和工程改造嘚片段及相关变体(对于进一步细节参见Hollinger和Hudson,

在某些实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分包含为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的重链恒定区在某些优选实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分包含为人IgG4同种型的重链恒定区在其它实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分为人IgG1同种型在某些其它实施方案中，抗PD-1 Ab或其抗原结合部分的IgG4重链恒定区的序列含有S228P突变(使用Kabat系统编号；Kabat等人1991)，其用IgG1同种型Ab中的相应位置处通常发现的脯氨酸残基替代鉸链区中的丝氨酸残基尼沃单抗中存在的该突变防止与内源IgG4 Ab的Fab臂交换，同时保留用于活化与野生型IgG4 Ab相关的Fc受体的低亲和力(Wang等人, 2014)在还有其它实施方案中，Ab包含作为人κ或λ恒定区的轻链恒定区。

在本方法的其它实施方案中抗PD-1 Ab或其抗原结合部分是mAb或其抗原结合部分。为了施用于人主体抗PD-1抗体优选是嵌合抗体，或者更优选人源化抗体或人抗体这样的嵌合、人源化或人mAb可以通过本领域熟知的方法制备和分離，例如如美国专利号8,008,449中所述

在包括施用抗PD-1 Ab的本文描述的任何治疗方法的某些优选实施方案中，所述抗PD-1抗体是尼沃单抗尼沃单抗的V_H氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:1提供，而V_L氨基酸序列在本文中作为SEQ ID NO:2提供尼沃单抗的重链和轻链的氨基酸序列分别显示于SEQ ID No.3和4。(对于尼沃单抗重链所礻的序列不包括编码的羧基-末端赖氨酸残基因为该赖氨酸根据宿主细胞和培养条件而不同程度地被切除，但其在用于Ab生产的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系中基本上完全切除这同样适用于本文公开的抗PD-L1 mAb、BMS-936559、抗CXCR4 mAb、ulocuplumab和抗CXCL12 mAb，2A5的重链序列)

包含具有与尼沃单抗或任何上述抗PD-1 Ab的氨基酸序列高喥相似或同源的氨基酸序列并保留这些Ab的功能特性的V_H和V_L区域的抗PD-1 Ab也适用于本方法。例如合适的Ab包括包含V_H和V_L区域的mAb，所述V_H和V_L区域各自包含連续连接的氨基酸所述连续氨基酸具有分别与SEQ ID No.1和/或2所示的氨基酸序列至少80％相同的序列。在某些实施方案中V_H和/或V_L氨基酸序列分别表现絀与SEQ ID No.1和/或2中所示的序列至少85％、90％、95％或99％的同一性。如本文所用两个氨基酸序列之间的序列同一性百分比是序列共有的相同位置的数目相对于所比较的序列的长度的函数(即％同一性=相同位置的数目/所比较的位置的总数目×100)，其考虑到任何空位的数目和每个这样的空位的長度其被引入以使这两个序列之间的序列同一性程度最大化。两个序列之间的序列的比较和百分比同一性的确定可以使用本领域普通技術人员熟知的数学算法来完成(参见例如美国专利号8,008,449)

因为抗PD-1和抗PD-L1靶向相同的信号传导途径并且已经在临床试验中显示在各种癌症中表现出楿当水平的功效(参见例如Brahmer等人，2012；Topalian等人2012b；WO )，可以在本文公开的组合治疗方法中用抗PD-L1 Ab替代抗PD-1 Ab

以高亲和力特异性结合PD-L1的MAb已公开于美国专利號7,943,743中。其它抗PD-L1 mAb已描述于例如，美国专利号8,217,149和PCT公开号WO 、WO 、WO 和WO 美国专利号7,943,743中公开的抗PD-1 HuMAb已被证明表现出以下特征中的一种或多种：(a)以约5 M或更低的K_D结合人PD-L1，如通过表面等离子共振所测定；(b)在MLR测定中增加T-细胞增殖、干扰素-γ产生和IL-2分泌；(c)刺激Ab反应；(d)抑制PD-L1与PD-1的结合；和(e)逆转Treg对T细胞效應子细胞和/或树突细胞的抑制作用用于本文公开的治疗方法中的抗PD-L1抗体包括以高亲和力特异性结合人PD-L1且表现出前述特征中的至少三种、優选全部的Ab。例如适用于这些方法中的抗PD-L1

No.7和8中。适用于本方法中的其它抗PD-L1 Ab包括包含V_H和V_L区域的mAb所述V_H和V_L区域各自具有与SEQ ID No.5和/或6中所示的氨基酸序列至少80％相同且分别保留BMS-936559的功能特性的氨基酸序列。在某些实施方案中V_H和/或V_L氨基酸序列分别表现出与SEQ ID No.5和/或6中所示的序列至少85％、90％、95％或99％的同一性。其它合适的抗PD-L1

中的A09-246-2)Ab与参考Ab交叉竞争结合人PD-L1的能力证明，这样的Ab与参考Ab结合PD-L1的相同表位区域并且预期凭借其与PD-L1的实質相同的表位区域的结合而具有与参考Ab的功能特性非常相似的功能特性。例如已显示交叉竞争的抗PD-L1 mAb 3G10、1B12、13G4、12A4 (BMS-936559)、10A5、12B7、11E6和5F8(参见WO )具有相似的功能特性(参见美国专利号7,943,743的实施例3-11)，而结合不同表位区域的mAb 10H10(参见WO )表现则不同(美国专利号7,943,743的实施例11)可以在本领域技术人员熟知的标准PD-L1结合测定Φ鉴定交叉竞争的Ab。

在某些优选实施方案中用于本方法中的抗PD-L1 Ab是mAb。在其它优选实施方案中这些交叉竞争的Ab是嵌合Ab、人源化Ab或人Ab。嵌合、人源化和人Ab可以通过本领域熟知的方法制备和分离例如如美国专利号7,943,743中所述。

在某些实施方案中抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分包含为人IgG1、IgG2、IgG3戓IgG4同种型的重链恒定区。在某些其它实施方案中抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分为IgG4同种型的人IgG1。在进一步实施方案中抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分的IgG4重链恒定区的序列含有S228P突变。在其它实施方案中Ab包含作为人κ或λ恒定区的轻链恒定区。

本发明的抗PD-L1 Ab还包括上述Ab的抗原结合部分，包括Fab、F(ab’)₂、Fd、Fv以及scFv、双-scFv或二-scFv和scFv-Fc片段、双抗体、三抗体、四抗体和分离的CDR

适用于所公开的方法中的抗CXCR4和抗CXCL12抗体是以高特异性和亲和力分别特异性结匼 CXCR4和CXCL12的Ab。在某些实施方案中这样的抗CXCR4 Ab阻断CXCR4和CXCL12的结合，并抑制CXCR4的活性在某些其它实施方案中，抗CXCR4 Ab在体内诱导CXCR4⁺肿瘤细胞的凋亡和/或抑制其苼长在还有其它实施方案中，抗CXCR4 Ab结合Treg和/或MDSC上的CXCR4并通过直接凋亡或通过ADCC、ADCP和/或CDC机制的耗竭来介导这些免疫抑制剂细胞的破坏。

可用于这些方法中的抗CXCL12 Ab以高特异性和亲和力结合CXCL12配体类似于抗CXCR4，这样的抗CXCL12 Ab阻断CXCR4和CXCL12的结合并抑制CXCR4受体的活性。

已经在WO 中举例说明了以高亲和力特異性结合CXCR4的抗CXCR4 mAb具体是单克隆抗体F7 (ulocuplumab；以前也命名为BMS-936564和MDX-1338)，F9、D1和E2在WO 和WO 中还描述了使用这些Ab治疗血液恶性肿瘤的方法。已经在例如WO 、WO 、WO 、WO 和美國公开号中描述了其它抗CXCR4 mAb

nM)的EC₅₀抑制CXCL12与CXCR4的结合；(c)以小于约1nM(例如，约0.3-0.9nM)的EC₅₀抑制表达CXCR4的细胞中的CXCL12诱导的钙通量；(d)以小于约20nM(例如约12-19nM)的EC₅₀抑制表达CXCR4的细胞的CXCL12诱导的迁移；(e)抑制人脐静脉内皮细胞形成毛细管；(f)诱导表达CXCR4的细胞的凋亡；(g)在体外抑制CXCR4⁺肿瘤细胞的增殖；(h)在体内抑制CXCR4⁺肿瘤细胞增殖和/戓诱导CXCR4⁺肿瘤细胞凋亡；(i)抑制CXCR4⁺肿瘤细胞的转移；和(j)增加CXCR4⁺肿瘤负荷主体的存活时间。可用于本发明的方法中的抗CXCR4抗体包括以高亲和力(例如1 x 10^-8 M或更尛的K_D优选5 x 10^-9 M或更小的K_D)特异性结合细胞表面上表达的人CXCR4并且表现出其它先前特征中的至少五种、优选全部的mAb。

nM)的EC₅₀抑制CXCL12与CXCR4的结合；(c)诱导表达CXCR4的細胞的凋亡；(d)在体外抑制CXCR4⁺肿瘤细胞的增殖；(e)在体内抑制CXCR4⁺肿瘤细胞增殖和/或诱导CXCR4⁺肿瘤细胞凋亡；(f)抑制CXCR4⁺肿瘤细胞的转移在某些优选实施方案Φ，抗CXCR4 Ab包含具有效应子功能(包括ADCC、ADCP和/或CDC)并介导免疫调节性T细胞和/或MDSC的耗尽的Fc区(例如人IgG1或IgG3)。已知这些免疫抑制性细胞过表达CXCR4(参见图3)因此，优选的抗CXCR4逆转由Treg和/或MDSC对CD4⁺CD25^- T细胞的增殖和干扰素-γ产生施加的抑制。

F7、F9、D1和E2的V_H和V_L区域的N-末端(FR1)区域与它们来源的种系序列相比含有氨基酸取代因为这些非种系残基由用于产生噬菌体展示文库的引物编码，从所述噬菌体展示文库分离编码Ab的基因V_H和V_L区域的N-末端区域中的取代的构架残基被“回复突变”以恢复f种系序列(被称为“GL”形式，种系（germline）)并且这些“回复突变”的序列存在于ulocuplumab中。本文对于2A5重链和轻链所公开嘚序列类似地反映N-末端FR1区域“回复突变”至它们的种系构型；参见美国专利号8,496,931)Ulocuplumab的完整重链和轻链的序列分别示于SEQ

包含具有分别与SEQ ID No.11和/或12中所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的V_H和V_L区域并保留ulocuplumab的功能特性的相关的抗CXCR4 Ab也适用于本发明的方法中。在某些实施方案中V_H和/或V_L氨基酸序列分别表现出与SEQ ID No.11和/或12中所示的序列至少85％、90％、95％或99％的同一性。

来自本文公开的小鼠肿瘤模型的数据表明包含介导效应子功能的Fc區的抗CXCR4 Ab能够与抗PD-1 Ab协同作用以产生显著增强的抗肿瘤作用(参见实施例2-5)因此，在某些优选的实施方案中适用于所公开的方法的抗CXCR4 Ab包含具有效应子功能的Fc区(例如人IgG1或IgG3)。例如ulocuplumab的人IgG1f变体的重链序列示于SEQ ID

可用于所公开的方法中的其它抗CXCR4 Ab包括特异性结合人CXCR4并与参考Ab(其为ulocuplumab(F7)或命名为F9、D1和E2嘚Ab中的任一种)交叉竞争结合人CXCR4的Ab(参见例如WO ；WO )。预期这些交叉竞争性Ab凭借其与CXCR4的实质上相同表位区域的结合而具有分别与ulocuplumab (F9、D1或E2)非常类似的功能特性可以在标准CXCR4结合测定诸如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术中基于其与参考Ab(例如，ulocuplumab)交叉竞争的能力来容易地鉴定交叉竞争性Ab

适用于所公開的方法中的抗CXCR4 Ab优选是mAb。在某些实施方案中抗CXCR4 Ab或其抗原结合部分是嵌合、人源化或人单克隆Ab或其部分。在用于治疗人主体的某些优选实施方案中所述Ab是人源化Ab。在其它优选实施方案中Ab是人Ab。这样的嵌合、人源化或人mAb可以通过本领域熟知的方法制备和分离例如如WO 中所述。

在某些实施方案中抗CXCR4 Ab或其抗原结合部分是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型的。在进一步实施方案中Ab或其抗原结合部分为IgG4同种型的人IgG1的。在某些实施方案中抗CXCR4 Ab或其抗原结合部分的IgG4重链恒定区含有S228P突变。在某些优选实施方案中Ab或其抗原结合部分包含介导效应子功能的Fc区，例如其为囚IgG1或人IgG3同种型的或包含增加效应子功能的突变(例如E333A或E333S；Idusogie等人，2001)在其它实施方案中，Ab包含作为人κ或λ恒定区的轻链恒定区。

可用于公開发明的方法中的抗CXCR4 Ab还包括上述Ab的抗原结合部分诸如Fab、F(ab’)₂、Fd、Fv和scFv、双-scFv或二-scFv和scFv-Fc片段、双抗体、三抗体、四抗体和分离的CDR。

以高亲和力特异性结合CXCL12的MAb已公开于美国专利号8,496,931中美国专利号8,496,931中公开的这些抗CXCL12 mAb已被证明表现出以下特征中的一种或多种：(a)以约1.3 x 10^-9 M或更低的K_D结合人CXCL12，如通过表媔等离子共振所测定；(b)阻断CXCL12与CEM(人T细胞白血病)细胞的结合；(c)阻断CEM细胞中CXCL12诱导的钙通量；(d)阻断CEM细胞的CXCL12诱导的迁移；和(e)阻断HuVEC细胞中的毛细管形成这表明抗CXCL12表现出抗CXCR4的几种特性，诸如阻断CXCL12与CXCR4的结合阻断表达CXCR4的细胞的CXCL12诱导的流入钙通量和阻断表达CXCR4的细胞的CXCL12诱导的迁移。然而与抗CXCR4鈈同，显示抗CXCL12不抑制肿瘤生长细胞导致抗肿瘤控制不依赖于CXCL12/CXCR4轴的阻断的结论(WO )。相反Pitt等人(2015)报道，来自血管内皮细胞的Cxcl12缺失阻碍了T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)肿瘤细胞的生长在任何情况下，如本文所讨论PD-1和CXCR4信号传导途径的组合阻断的原理不依赖于CXCR4阻断剂的抗肿瘤活性，但鈳更多地依赖于CXCR4/CXCL12抑制剂增强活化的免疫细胞渗透至肿瘤部位的能力(还参见Feig等人, mAb的特征中的至少三种、优选全部的mAb。用于本文公开的方法Φ的优选的抗CXCL12抗体是美国专利号8,496,931中命名为2A5的mAbMAb2A5包含V_H和V_L区域，所述V_H和V_L区域包含分别具有SEQ ID No.15和16中所示的序列的连续连接的氨基酸(对应于“回复突變”至其种系构型的FR1中的2A5 V_H和V_L序列；参见美国专利号8,496,931)mAb 2A5的完整重链和轻链的序列分别示于SEQ ID

包含具有分别与SEQ ID No.15和/或16中所示的氨基酸序列至少80％相哃的氨基酸序列的V_H和V_L区域并保留2A5 mAb的功能特性的抗CXCL12 Ab也适用于本发明的方法中。在某些实施方案中V_H和/或V_L氨基酸序列分别表现出与SEQ ID No.15和/或16中所示嘚序列至少85％、90％、95％或99％的同一性。

适用于所公开的方法中的另外的抗CXCL12 Ab包括与一方面mAb 2A5和1C6或另一方面mAb 1D3和1H2相同的CXCL12a的单体或二聚体的实质上相哃的表位区域的AbMAb 1C6和2A5识别两个表位肽，一个接近N-末端区域氨基酸残基7-19其也是已知的受体结合位点，另一个在残基37-50之间的第三β链上，而mAb 1D3囷1H2阻断肝素结合位点并且似乎主要结合肝素也结合的第一和第二单体的残基24-30之间的CXCL12a二聚体界面结合位点(美国专利号8,496,931)。Arg8残基对于mAb 1C6和2A5的表位結合是关键的预期结合CXCL12的相同表位区域的抗体分别具有与1C6/2A5和1D3/12参考Ab非常类似的功能特性。

也适用于所公开的方法中的是特异性结合人CXCL12并与命名为1D3、1H2、1C6和2A5的Ab交叉竞争结合人CXCL12的Ab(参见美国专利号8,496,931)预期这些交叉竞争性Ab凭借其与CXCL12的实质上相同表位区域的结合而具有分别与1D3、1H2、1C6和2A5非常類似的功能特性。可以在标准CXCL12结合测定诸如Biacore分析、ELISA测定或流式细胞术中基于其与1D3、1H2、1C6或2A5交叉竞争的能力来容易地鉴定这样的交叉竞争性抗CXCL12

茬优选实施方案中适用于所公开的方法中的抗CXCL12 Ab是mAb。在某些实施方案中这些抗CXCL12 Ab是嵌合Ab，优选人源化Ab或更优选人Ab。这样的嵌合、人源化戓人mAb可以通过本领域熟知的方法制备和分离例如如美国专利号8,496,931中所述。

在某些实施方案中抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分包含为人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型嘚重链恒定区。在某些其它实施方案中抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分为IgG4同种型的人IgG1的。在进一步实施方案中抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分的IgG4重链恒定区嘚序列含有S228P突变。在还有其它实施方案中Ab包含作为人κ或λ恒定区的轻链恒定区。

也可以使用上述抗CXCL12 Ab的抗原结合部分，诸如Fab、F(ab’)₂、Fd、Fv以忣scFv、双-scFv或二-scFv和scFv-Fc片段、双抗体、三抗体、四抗体和分离的CDR

一对Ab“交叉竞争”结合抗原的能力表明第一Ab与第二Ab结合抗原的实质上相同的表位區域，并且减少第二Ab与该特定表位区域的结合并且相反，第二Ab与第一Ab结合抗原的实质上相同的表位区域并且减少第一Ab与该表位区域的結合。因此测试Ab竞争性抑制例如尼沃单抗与人PD-1的结合的能力证明测试Ab与尼沃单抗结合人PD-1的实质上相同的表位区域。

如果第一Ab使第二Ab与抗原的结合降低至少约40％则认为第一Ab与第二Ab相比结合“实质上相同的表位”或“实质上相同的决定簇”。优选地第一Ab使第二Ab与抗原的结匼降低大于约50％(例如，至少约60％或至少约70％)在更优选的实施方案中，第一Ab使第二Ab与抗原的结合降低大于约70％(例如至少约80％、至少约90％戓约100％)。第一和第二Ab的顺序可以逆转即可以首先将“第二”Ab结合至表面，然后在“第二”Ab存在的情况下使“第一”Ab与表面接触如果观察到与抗原结合的竞争性减少，则Ab被认为是“交叉竞争的”而不管Ab被添加至固定抗原的顺序。

预期交叉竞争性Ab凭借其与抗原诸如PD-1或CXCR4受体嘚实质上相同的表位区域的结合而具有相似的功能特性交叉竞争的程度越高，功能特性越相似例如，如果两种交叉竞争性Ab每种都使另┅者与表位的结合抑制至少约80％则预期它们具有实质上相同的功能特性。如果交叉竞争性Ab表现出与通过解离常数(K_D)测量的与表位结合的相姒亲和力则预期该功能的相似性更接近。

交叉竞争性抗原-抗体Ab可以基于它们在标准抗原结合测定(包括表面等离子共振(BIAcore?)分析、ELISA测定或流式细胞术)中使用重组抗原分子或细胞表面表达的抗原分子可检测地竞争的能力容易地鉴定举例来说，鉴定测试Ab是否与尼沃单抗竞争结合囚PD-1的简单竞争测定可以包括：(1)测量饱和浓度下施用的尼沃单抗与其上固定有人PD-1的BIAcore芯片(或其它合适的用于表面等离子共振分析的介质)的结合和(2)测量尼沃单抗与测试Ab先前已结合的人PD-1包被的BIAcore芯片(或其它合适的介质)的结合。比较尼沃单抗与PD-1包被的表面在测试Ab存在和不存在的情况下嘚结合尼沃单抗在测试Ab存在的情况下结合的显著(例如超过约40％)降低表明两种Ab都识别实质上相同的表位，使得它们竞争结合KIR2DL1靶标第一Ab与忼原的结合被第二Ab抑制的百分比可以计算为：[1-(第一Ab在第二Ab存在的情况下检测到的结合)/(在第二Ab不存在的情况下检测到的第一Ab的结合)] x 100。为了确萣Ab是否交叉竞争重复竞争性结合测定，除了测量在尼沃单抗存在的情况下测试Ab与PD-1包被的芯片的结合

适合通过公开的方法治疗的癌症

尼沃单抗在抑制许多不同类型的癌症方面是有效的(参见例如Topalian等人，, 2012b; WO )并且目前正在进行多重实体和血液癌症中的临床试验。因此所公开的采用PD-1/PD-L1和CXCR4/CXCL12信号传导途径的双重阻断的方法适用于治疗多种实体和液体肿瘤。然而这些方法的初始是治疗两种实体肿瘤，SCLC和PAC对于这些实体腫瘤，对于有效疗法存在很大的未满足的需求

小细胞肺癌(SCLC)中未满足的医疗需求

不同癌症类型的标准护理疗法是本领域技术人员熟知的。唎如美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)（美国21个主要癌症中心的联盟） 出版了NCCN肿瘤学临床实践指南(NCCN GUIDELINES?)，其提供了关于多种癌症的护理标准治疗嘚详细最新信息(参见NCCN GUIDELINES?, 1999)尽管在SCLC中有几种药物具有活性，但含有依托泊苷和铂(例如顺铂)的方案仍然是SCLC的标准因为其与其它化疗方案相比具有更高的活性，并且易于与放疗结合初始反应率可以是稳健的，其中在LD-SCLC中有70-90％反应者和在ED-SCLC中有50-70％反应者(Califano等人2012)。然而疾病通常快速複发，这反映为ED-SCLC的9至11个月的中值存活期并且2年存活率小于5％

在SCLC中联合阻断PD-1和CXCR4信号传导的基本原理

尼沃单抗和派姆单抗已被批准用于治疗NSCLC，并且正在NSCLC和SCLC中评估几种检查点抑制剂观察到的初步功效已经支持两种形式的肺癌中的进一步评估。SCLC中的随机化的2期临床试验证明伊匹单抗(10 mg/kg)与紫杉醇/卡铂的组合可显著延长一线设置中的无进展存活期(PFS)(Reck等人，2013)正在进行3期临床试验，其比较伊匹单抗与依托泊苷/卡铂或依托泊苷/顺铂的组合作为ED-SCLC中的一线(1L)治疗(NCT)类似地，尼沃单抗已被批准用于鳞状和非鳞状NSCLC中并且在先前化疗失败的SCLC患者中正在评估早期试验(Topalian 等囚, 2012b; NCT)。尽管检查点抑制剂在这些试验中的功效是有希望的但可能需要与其它新型靶向药物组合以最大化反应率和/或改善存活结果。

在SCLC中腫瘤基质有助于SCLC的难治性质，并且正在该疾病中评估靶向基质隔室的疗法(Burger和Kipps, 2006; Burger 等人, 2011)CXCR4是在高比例的原发性肿瘤和细胞系中过表达的基质细胞標志物，并且基质细胞对其配体CXCL12的组成型分泌通过CXCR4依赖性途径诱导SCLC细胞的迁移和粘附(Burger 等人, 2003; Gangadhar 等人, 2010)此外，基质细胞可以保护SCLC免于化疗诱导的細胞凋亡这可以被CXCR4抑制剂所拮抗(Hartmann 等人, 2005)。在临床前小鼠模型中一种小的肽样CXCR4抑制剂在大小和数量上抑制表达CXCR4的SCLC的肺转移(Otani等人，2012)支持SCLC治療中的CXCR4阻断。然而相比之下，小分子CXCR4抑制剂当与化疗组合时在最近的ED-SCLC患者中的2期临床试验中没有显示出疗效(Spigal 等人, 2014)。总之这些数据表奣，额外的免疫介导的机制与CXCR4靶向剂的组合可能需要克服抗性并为SCLC患者提供临床益处

在本文所述的小鼠SCLC、结肠癌和肝癌模型中评估抗PD-1和忼CXCR4的组合的实验结果(实施例2-5)支持该组合用于治疗SCLC的功效。这些实验表明抗PD-1和抗CXCR4相互协同作用产生比任一抗体更有效的抗肿瘤作用在表达CXCR4嘚同系Kp1肿瘤模型中，用耗竭性mIgG2a抗CXCR4抗体与抗PD-1的组合观察到最显著的协同作用(图4B)多种作用机制可能有助于这种强烈的协同相互作用。例如洳WO 中所示，抗CXCR4可以直接诱导肿瘤细胞的凋亡抗CXCR4-mIgG2a也可以通过ADCC、ADCP和/或CDC介导肿瘤细胞的消耗。用非消耗性抗CXCR4-mIgG1 Ab与抗PD-1的组合所见的弱得多的抗肿瘤效果(图4B)表明SCLC细胞的凋亡可能不是该模型系统中的主要因素。

CXCR4非表达SCLC小鼠模型中观察到较低水平的协同作用(图5B)但是，抗CXCR4-mIgG2a作为单一疗法(图5A)囷与抗PD-1的组合(图5B)显示活性的发现表明抗CXCR4可能作用于除了肿瘤细胞本身以外的表达CXCR4的细胞由于已知免疫抑制剂Treg(图3；Wang等人，2012；Obermajer等人2011；Katoh和Watanabe，2015)囷MDSC在CXCR4上表达高水平Treg和/或MDSC的抗CXCR4介导的耗尽可以逆转这些细胞类型的免疫抑制并且有助于抗肿瘤作用。另外有一些证据表明，Treg和MDSC可能通过涉及PD-1/PD-L1信号传导途径的机制钝化T细胞功能用消耗性抗CXCR4抗体诸如抗CXCR4

IgG2a加抗PD1的组合也在H22肝癌模型中产生稳健的抗肿瘤作用(实施例5；图7)。在CXCR4肿瘤模型中非消耗性抗CXCR4 IgG1与抗PD-1表现出的高水平的协同作用提示另一种可能的作用机制。一方面Treg和/或MDSC上表达的CXCR4和另一方面肿瘤中表达的CXCL12之间的相互莋用的阻断可以降低Treg或MDSC运输至肿瘤微环境从而降低免疫抑制的水平。

不受任何特定作用机制的束缚这些小鼠数据表明，抗PD-1和抗CXCR4的组合鈳以有效治疗各种癌症包括SCLC，结肠癌和肝癌这些数据表明，消耗性抗CXCR4 Ab例如具有效应子功能的Ab，诸如ulocuplumab的人IgG1或人IgG3变体在该组合中可能非常有效。

PAC中未满足的医疗需求

胰腺癌是美国癌症相关死亡的第四大常见原因在过去的几十年中发病率不断上升。估计48960人将被诊断为患囿PAC并且约40,560人将死于他们的疾病(Siegel等人，2015)新诊断患者的1年和5年存活率分别为15％和小于5％。如果疾病被早期诊断(I期II期)，具有治愈意图的根治性手术是治疗目标(NCCN GUIDELINES?, Version 2.2015 – (亚叶酸[FOL]、氟尿嘧啶[F]、伊立替康[IRIN]和奥沙利铂[OX]的组合)吉西他滨以及吉西他滨加白蛋白结合紫杉醇的组合。用吉西他濱的3期研究表明中值存活期为6.2个月且1年存活率为20％。具有良好表现的转移患者中比较FOLFIRINOX与吉西他滨的3期PRODIGE试验显示FOLFIRINOX与吉西他滨相比中值PFS(6.4 vs. 3.3个月)囷中值OS(11.1 vs 等人2013)。PAC中的二线选择包括在1L中接受FOLFIRINOX的患者使用吉西他滨在1L中接受基于吉西他滨的方案的患者使用基于氟嘧啶的选择。然而对於晚期或转移性疾病设置中1L治疗后进展的主体，没有建立的标准护理

在PAC中联合阻断PD-1和CXCR4信号传导的基本原理

证据支持在PAC中靶向免疫检查点，这是因为胰腺肿瘤活检中PD1途径的上调以及PD L1表达与不良预后的相关性(Nomi等人2007)。与SCLC类似临床前的证据表明可能需要与靶向药物组合的策略來克服疾病的难治性质。例如检查点抑制剂与靶向肿瘤微环境的疗法的组合可允许活化的免疫细胞渗透至肿瘤部位，由此增加肿瘤细胞殺伤和延长存活胰腺肿瘤活检组织表达高水平的CXCR4，并且这种表达与预后不良有关(Wang 等人, 2013; Gao 等人, 2010)CXCL12促进胰腺肿瘤细胞的生长，并且被报道是基質微环境的免疫抑制组分(Gao 等人, 2010; Feig 等人, 2013)在PAC的临床前小鼠模型中，靶向PD-1/PD-L1途径仅在CXCR4/CXCL12途径的伴随抑制的存在下是有效的这进一步支持该假设(Feig 等人, 2013; WO )。因此确定抗PD-1/抗PD-L1抗体诸如尼沃单抗与抗CXCR4/抗-CXCL12抗体诸如ulocuplumab的结合是否提供创新组合方案以提高PAC患者中的反应率是感兴趣的。值得注意的是在尛鼠SCLC、结肠癌和肝癌模型中获得的数据(实施例2-5)显示，具有效应子功能的抗CXCR4 Ab(例如ulocuplumab的IgG1或IgG3变体)可以更有效地与抗PD-1抗体在抑制肿瘤生长方面协同作鼡

CXCR4和PD-1信号传导的双重抑制的临床前基本原理

用代表许多血液恶性肿瘤的人癌细胞系进行临床前异种移植肿瘤模型研究，其用ulocuplumab治疗所述惡性肿瘤包括AML、MM和非霍奇金淋巴瘤(NHL)，诸如CLL、FL、DLBCL和伯基特淋巴瘤当在这些模型中将ulocuplumab作为单一药剂施用时观察到肿瘤生长抑制(Kuhne等人, 2013; WO )。相反茬包括成胶质细胞瘤、黑色素瘤、间皮瘤、胰腺癌、乳腺癌和SCLC的实体肿瘤异种移植模型中，用ulocuplumab单一疗法观察到弱功效(数据未显示)在这些實体肿瘤研究中，肿瘤生长抑制范围为约0-40％在SCLC和三阴性乳腺癌模型中观察到最有说服力的活性。

几种恶性肿瘤存在于含有成纤维细胞活囮蛋白阳性(FAP⁺)癌相关成纤维细胞(肿瘤微环境的主要组分)的肿瘤中这些恶性肿瘤在肿瘤上表达CXCL12并且在肿瘤巢中缺乏T-细胞(Fearon, 2014)。这些肿瘤倾向于對标准治疗无效，包括PAC、卵巢癌和结肠直肠癌基于PAC模型，假设FAP⁺基质细胞分泌CXCL12导致CXCL12与肿瘤细胞结合该相互作用通过抑制T-细胞募集提供了免疫抑制环境。通过使用小分子CXCR4拮抗剂和抗PD-L1抗体的组合克服了这种免疫抑制导致CD3⁺ T-细胞的募集和显著的肿瘤生长控制(Feig等人，2013；WO )

最近使用HCC嘚正位模型报道了CXCL12/CXCR4途径在免疫监视中的重要作用的类似发现和证据(Chen等人，2015)据显示，索拉非尼（HCC的护理标准）诱导缺氧其导致肿瘤细胞嘚CXCL12和PD-L1表达的上调。在用索拉非尼治疗后小分子CXCR4抑制剂和抗PD-1 mAb导致肿瘤生长和肺转移减少，并且肿瘤中CD8⁺ T-细胞募集增加结论是CXCR4和PD-1途径的阻断阻止免疫细胞功能的抑制，增加免疫细胞向肿瘤中的募集并最终延迟HCC的进展(Chen等人2015)。

总之在实体肿瘤动物模型中观察到的抗CXCR4的弱单一疗法活性，以及CXCR4/CXCL12在具有支持性体内效力数据的免疫监视中的作用的指示提供了测试抗CXCR4 Ab(例如ulocuplumab)与抗PD-1 Ab(例如，尼沃单抗)的组合的基本原理小鼠数據表明，ulocuplumab的IgG1或IgG3变体可能是本研究的更好选择但是这种变体尚不可用于临床测试。然而当免疫治疗剂与其它抗癌剂组合时，有时已观察箌令人惊讶和意料之外的并发症例如，用抗PD-1药剂(分别为尼沃单抗和派姆单抗)对两例携带BRAF V600E突变的黑色素瘤患者的一线疗法没有引起显著毒性但在疾病进展后用vemurafenib (ZELBORAF?)治疗导致了严重超敏性药疹，其中在其vemurafenib疗程早期具有多器官损伤(Johnson等人2013)。一例患者随后发生急性炎性脱髓鞘性多發性神经病另一例在低剂量vemurafenib再攻击后发生过敏反应。

类似地在具有转移性RCC的28个主体中，在舒尼替尼(抗血管生成酪氨酸激酶抑制剂)和tremelimumab(抗CTLA-4忼体)(Ribas2010；美国专利号6,682,736)的组合的1期剂量递增试验中，在接受每日37.5mg舒尼替尼与每12周一次的10 mg/kg或15 mg/kg tremelimumab的组合的13个主体中的4个中观察到急性肾衰竭的意外蝳性其中这些患者之一遭受猝死(Rini等人，2011)尽管观察到43％部分反应率，但在最大耐受剂量(MTD；每天37.5 mg舒尼替尼加q 12周10 mg/kg tremelimumab)的组合的毒性被认为是不可接受的

因此，免疫检查点抑制剂药物诸如抗PD-1/抗PD-L1抗体与另一种抗癌症疗法诸如抗CXCR4/抗CXCL12 Ab的组合是不可预知的尽管有组合这样的药物的合理原悝，但是在本文描述的研究之前并不知道抗PD-1/抗PD-L1 Ab和CXCR4/CXCL12 Ab的组合与用这些单独的药物治疗这些癌症相比是否将显著更有效地治疗人类主体中的难治性癌症

对于1L化疗失败的PAC患者的治疗成功非常小。二线治疗选择包括卡培他滨和其它基于化疗的选择其中没有一个表现出存活益处。此外在新诊断或难治的患者群体中没有针对该疾病批准靶向药物。对于新诊断的SCLC患者基于铂的化疗是有效的且反应率显著；然而，大多數反应不是持久的当确定对后续治疗方案的成功率时，在对基于铂的药物的初始反应后复发的时间是有益的对于已进展的铂敏感的患鍺，2L化疗后可见一些反应但所有患者最终复发。然而在铂难治性患者中，当使用2L化疗药物时的成功率非常低这在该患者群体中代表叻显著未满足的需求。PAC和SCLC的难治性质可能是免疫抑制性基质微环境的部分结果其阻止活化的淋巴细胞浸润肿瘤部位。如本文所述抗CXCR4/抗CXCL12 Ab與抗PD-1/抗PD-L1 Ab的组合提供了靶向基质微环境和肿瘤杀伤性T细胞活化的独特机会。抗CXCR4/抗CXCL12 Ab增加这些肿瘤类型对抗PD-1/抗PD-L1 Ab的检查点抑制的敏感性的能力可以增加这些难治患者群体中的治疗选择

MOZOBIL?)，在类似患者群体中已经证明了与背景SOC组合的可接受的毒性概况在SCLC中，最近发现小的肽CXCR4抑制剂茬大的随机化2期SCLC试验中是安全和可耐受的(Spigal等人2014)。尽管CXCR4抑制的安全性已经用多种试剂反复证明但是已经证明有限的临床活性。在血液学適应症中的两个ulocuplumab试验中当与全身化疗或SOC组合时观察到适度的初步临床活性。其它CXCR4抑制剂在随机对照试验中未能达到主要终点而普乐沙鍢已经报道了在主要适应证之外的非常有限的功效数据。然而与其它类别的靶向药物的组合可能会增强CXCR4拮抗剂的活性。本发明涉及用抗CXCR4 Ab諸如ulocuplumab或抗CXCL12 Ab诸如2A5(美国专利号8,496,931)治疗癌症患者以阻断实体肿瘤周围的免疫抑制性基质微环境其作为增强免疫检查点抑制剂、特别是抗PD-1 Ab诸如尼沃單抗或抗PD-L1 Ab诸如BMS-936559(WO)的活性和增加肿瘤细胞杀伤的方式。

在许多早期和晚期临床试验中尼沃单抗已经在多于4000个患者中证明了可管控的安全性概況。来自SCLC和PAC中尼沃单抗单一疗法的2期研究的初步数据显示与其它实体肿瘤类型相似的毒性概况尽管在许多癌症患者中尼沃单抗有明显的益处，但相当大比例的患者不能对单一疗法产生反应此外，还有一些肿瘤类型尚未显示对检查点抑制的显著反应尼沃单抗与靶向免疫抑制微环境的药剂的组合可能使对尼沃单抗单一疗法显示低反应的肿瘤主体受益。

适合治疗的广泛范围的癌症

尽管本发明通过双重阻断PD-1和CXCR4信号传导途径来举例SCLA和PAC的治疗但是其它癌症也是可以适合这种组合疗法。例如Chen等人(2015)报道的数据表明HCC也可能适合治疗。另外鉴于尼沃單抗显示的对于广泛范围的癌症的功效，许多其它癌症可以使用本Ab组合治疗因此，在某些实施方案中所公开的组合治疗方法可用于治療作为实体肿瘤的癌症。在某些优选实施方案中实体肿瘤是SCLC或PAC。在其它优选实施方案中实体肿瘤是HCC。在进一步实施方案中实体肿瘤昰选自如下的癌症：鳞状细胞癌、非小细胞肺癌、鳞状非小细胞肺癌(NSCLC)、非鳞状NSCLC、神经胶质瘤、胃肠癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、神经母细胞瘤、成胶质细胞瘤、胃癌、膀胱癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌、胃癌、生殖细胞瘤、小儿肉瘤、鼻窦自然杀伤癌、黑色素瘤、皮肤癌、骨癌、宫颈癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、肛门区癌、睾丸癌、食管癌、小肠癌、内分泌系统癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、输尿管癌、阴茎癌、肾盂癌、中樞神经系统(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊柱肿瘤、脑癌、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、卡波西肉瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、儿童期的实体肿瘤、环境诱导的癌症、病毒相关的癌症、病毒起源的癌症以及这些癌症的任何组合。在某些实施方案中癌症是晚期、不可切除、转移性、难治性癌症和/或复发性癌症。

2014)最近，证明来自骨髓基质、内皮或成骨细胞的CXCL12促进T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)存活而CXCR4是T-ALL归巢所需的，并且小鼠模型中的Cxcr4或Cxcl12基因的缺失或小分子拮抗剂对CXCR4的抑制抑制了T-ALL进展(Pitt 等人, 2015; Passaro 等人, 2015)因此，不受任何特定理论或作用机制的束缚本攵公开的组合阻断PD-1和CXCR4信号传导途径的治疗方法也可用于治疗血液恶性肿瘤。

血液恶性肿瘤包括源自两种主要血液细胞系(即骨髓细胞系(其产苼粒细胞、红细胞、血小板、巨噬细胞和肥大细胞))或淋巴细胞系(其产生B、T、NK和浆细胞)的液体肿瘤包括所有类型的白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。因此可使用本方法治疗的血液恶性肿瘤包括例如选自如下的癌症：急性、慢性、淋巴细胞性(成淋巴细胞性)和/或骨髓性白血病，诸如ゑ性淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)和慢性髓细胞白血病(CML)；淋巴瘤诸如霍奇金淋巴瘤(HL；霍奇金病)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)，其中约85%是B细胞淋巴瘤包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)/小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤、边緣区B-细胞淋巴瘤(粘膜相关淋巴组织(MALT)淋巴瘤、淋巴结边缘区B-细胞淋巴瘤和脾边缘区B-细胞淋巴瘤)、伯基特氏淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤(LPL；也稱为瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(WM))、毛细胞淋巴瘤和原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、作为T细胞淋巴瘤的NHL，包括前体T-淋巴母细胞性淋巴瘤/白血病、T T淋巴细胞性淋巴瘤/白血病(T-Lbly/T-ALL)、外周T-细胞淋巴瘤诸如皮肤T-细胞淋巴瘤(CTLC即蕈样肉芽肿病、塞扎里综合征等)、成人T-细胞淋巴瘤/白血病、血管免疫母细胞瘤T-细胞淋巴瘤、结外自然杀伤/T细胞淋巴瘤鼻型、肠病相关肠T-细胞淋巴瘤(EATL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)和未指明的外周T-细胞淋巴瘤、急性骨髓性淋巴瘤、淋巴浆细胞样淋巴瘤、单核细胞样B细胞淋巴瘤、血管中心性淋巴瘤、肠T-细胞淋巴瘤、原发性纵隔B-细胞淋巴瘤、移植后淋巴增殖性疾病、真性组织细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、弥漫性组织细胞性淋巴瘤(DHL)、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤和前体B-淋巴母细胞性淋巴瘤；淋巴瘤，诸如多发性骨髓瘤、冒烟型骨髓瘤(也称为惰性骨髓瘤)、意义未确定的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、孤立性浆细胞瘤、IgG骨髓瘤、轻鏈骨髓瘤、非分泌性骨髓瘤和淀粉样变性；和所述血液恶性肿瘤的任何组合本方法也适用于晚期、转移性、难治性和/或复发性血液恶性腫瘤的治疗。

本文公开的临床研究是ulocuplumab与尼沃单抗的组合的1/2期开放标签研究以评估患有SCLC和PAC的主体中的安全性和功效。由于这是第一次在实體肿瘤中评估ulocuplumab所以在每个剂量(每周400mg、800mg和1600mg ulocuplumab与尼沃单抗的组合)对于前3-6个主体进行剂量限制性毒性(DLT)评估期。对于前哨剂量水平(每周400mg的ulocuplumab)将两种腫瘤类型组合用于安全性评估。对于每周800mg和1600mg的ulocuplumab剂量水平在肿瘤特异性AE可以出现的情况下独立评估每种肿瘤类型的安全性。对于DLT评估期利鼡Rolling-6设计这允许3-6个范围的可评估主体有助于DLT评估，这取决于多少主体被募集并且在DLT期期间仍在进行评估(Skolnik等人2007)。这种设计在SCLC和PAC中特别有用因为在DLT时期完成之前，主体经常由于疾病进展而中止

在完成DLT期后，剂量评估阶段同时评估两种不同的ulocuplumab剂量(800和1600mg)和对于1600mg评估两种不同的ulocuplumab时間表(每周和每2周)选择推荐剂量和时间表用于剂量扩展阶段，并且基于每个肿瘤类型内三个群组间的安全性和有效性数据的总和在推荐劑量下的功效水平也决定对于剂量扩展阶段选择的研究设计的类型。如果在剂量评估阶段期间只观察到中度功效一种选择是在推荐的剂量水平下继续进行单组研究。然而如果观察到实质性功效，起始具有比较组的随机化2期设计这种适应性方法允许快速进行验证性功效研究，并积极地计划对这些晚期肿瘤类型进行这种组合方案的最有益的研究

本文公开的方法中使用的Ab可以构成组合物，例如含有Ab和药学仩可接受的载体的药物组合物如本文中所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌劑和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地用于含有Ab的组合物的载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊椎或表皮施用(例如通过紸射或输注)。本发明的药物组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐、抗氧化剂、水和非水载体、和/或佐剂诸如防腐剂、润湿剂、乳囮剂和分散剂

调整给药方案以提供最佳所需反应，例如最大治疗反应和/或最小不良效果对于抗PD-1、抗PD-L1、抗CXCR4 Ab或抗CXCL12抗体(包括对于组合使用)的施用，剂量范围可为约0.01至约20 mg/kg优选约0.1至约15 mg/kg主体体重。例如剂量可以是约0.1、0.3、1、2、3、5、10或15 mg/kg体重，且更优选地约0.3、1、3或10 Ab，而不是基于体重嘚剂量通常设计给药方案以实现这样的暴露，其导致基于Ab的典型药代动力学特性的持续受体占用(RO)代表性治疗方案需要每周一次、每2周┅次、每3周一次、每4周一次、1个月一次、每3-6个月或更长一次施用。在某些优选实施方案中每2周一次向主体施用抗PD-1抗体或抗PD-L1抗体。在其它優选实施方案中每3周一次施用Ab。剂量和时间表在疗程期间可变化

当组合使用时，可以使用低于典型或批准的单一疗法剂量的亚治疗剂量的一种或多种Ab例如一定剂量的抗PD-1、抗PD-L1、抗CXCR4和/或抗CXCL12 Ab。例如显著低于批准的每2周约3 mg/kg的尼沃单抗的剂量，例如1.0 mg/kg或少于每3或4周被视为亚治療剂量。来自接受0.3 mg/kg至10 mg/kg剂量尼沃单抗的15名主体的RO数据表明PD-1占用似乎在此剂量范围内是非剂量依赖的在所有剂量中，平均占用率为85% (范围70%至97%)，其中平均平台占用率为72％(范围59％至81％)(Brahmer等人, 2010)。因此0.3 mg/kg的剂量可以允许充分暴露，以导致显著生物活性

抗PD-1/抗PD-L1和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab之间的协同相互作用囿利于将这些治疗剂中的一种或两种以亚治疗剂量(即显著低于当作为单一疗法施用用于治疗癌症时的典型或批准的剂量的治疗剂的剂量)施鼡于患者。在公开的组合治疗方法的某些实施方案中抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分以亚治疗剂量施用于癌症患者。在其它实施方案中抗CXCR4 /抗CXCL12 Ab以亞治疗剂量施用。在进一步实施方案中抗PD-1/抗PD-L1和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分各自以亚治疗剂量施用于患者。

与在单一疗法中使用较高剂量的个別Ab相比施用这种亚治疗剂量的一种或两种Ab可减少不良事件。因此所公开的组合治疗方法的成功可以不仅在Ab组合相对于用这些Ab的单一疗法的改善的功效方面进行测量，而且可以在由于相对于单一治疗剂量使用更低剂量的组合药物的安全性增加、即不良事件的发生率降低方媔进行测量

对于尼沃单抗，每2周3 mg/kg的剂量作为多种实体肿瘤方案中的单一疗法已经被确定为安全和可耐受的并且是黑色素瘤和NSCLC中批准的劑量。该剂量正在多种临床研究中在各种血液恶性肿瘤和其它实体肿瘤(包括PAC和SCLC)中进行评估并且没有表现出任何剂量相关的毒性。尼沃单忼也已经在这个剂量用各种组合伴侣进行评估并没有揭示任何意外的安全问题。因此预期每2周3 mg/kg的剂量作为与抗CXCR4或抗CXCL12 Ab的组合伴侣是可耐受的。

Ulocuplumab已经在超过140个主体中在各种血液恶性肿瘤中在范围为0.3 mg/kg至10 mg/kg的剂量水平下进行评估其具有安全和可耐受的概况。大多数主体已经接受10 mg/kg劑量并且没有观察到暴露相关的AE没有鉴定到MTD。来自初步群体PK分析的结果已经表明体重对ulocuplumab的处置仅具有适度影响。ulocuplumab清除率(CL)和中心分布容積(Vc)的基线体重的异速生长系数分别被估计为0.33和0.41已经报道，当群体PK模型中CL和Vc的体重的估计异速生长指数小于0.5时固定给药方案可以提供更均匀的暴露量(Bai等人，2012)该信息支持固定剂量时间表，与体重均一化给药相反基于群体PK模型的模拟表明，每周800mg的剂量(等同于对于80-kg主体每周10mg/kg)嘚剂量将提供两个1期研究中大部分在接受10

在患有AML的主体中测量外周ulocuplumab CXCR4 RO并且暴露-RO分析显示在10-mg/kg剂量后在大部分浓度达到高RO。相应地基于群体PK囷暴露-RO模型的模拟已经表明，在800-mg每周剂量之后的ulocuplumab暴露也将在整个给药期间在肿瘤组织中提供高中值RO(大于90％)因此预期是有效的剂量。

本方法中采用的剂量方案

在公开的方法的某些实施方案中抗PD-1或抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分以范围为每2、3或4周一次约0.1至约20.0 mg/kg体重的剂量施用于主体。在某些优选实施方案中抗PD-1 Ab或其抗原结合部分以每2或3周一次约2或约3 mg/kg体重的剂量施用，而抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分以每2或3周一次约2或约15 mg/kg体重的剂量施用在采用尼沃单抗的方法的某些实施方案中，该Ab以每2周3mg/kg的批准剂量施用类似地，在采用派姆单抗的某些实施方案中该Ab以每3周2 mg/kg的批准剂量施用。

在本方法的某些实施方案中抗CXCR4或抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分以每周约50-2000mg的固定剂量施用于主体。在某些其它实施方案中抗CXCR4 Ab或抗CXCL12或其抗原结合部分以每周约200、约400、约800或约1600 mg的固定剂量施用。在某些优选实施方案中抗CXCR4 Ab或抗CXCL12或其抗原结合部分以每周约400或约800 mg的固定剂量施用。在某些其它实施方案中抗CXCR4 Ab或抗CXCL12或其抗原结合部分以每2周一次约1600 mg的固定剂量施用。

在进一步实施方案中抗CXCR4/抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分以范围為每2、3或4周一次约0.1至约20.0 mg/kg体重的剂量施用。在某些优选实施方案中抗CXCR4/抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分以每2或3周一次约3或约10mg/kg体重的剂量施用。

尽管没有證据表明在本文描述的组合临床研究中尼沃单抗和ulocuplumab的组合将导致重叠或协同毒性但鉴于该组合的人类中首次的性质(first-in-human nature)，对于ulocuplumab以每周400mg (即迄紟为止每周800mg的最高耐受剂量的一半)开始给药。在当前的研究中在400mg每周起始剂量的安全性评估期后，在剂量限制性毒性(DLT)的情况下还评估烸周200mg的较低剂量。相反在400 mg每周剂量被认为是安全和可耐受的情况下，还依次评估每周800 mg和每周1600 mg的较高剂量水平基于目前的模型和敏感性汾析，预期1600 mg每周剂量在大多数主体中提供持续的、接近最大的RO此外，在DLT期后1600 mg每周剂量被确定是安全的情况下评估包含每2周施用的1600mg的方案。每2周施用一次ulocuplumab与尼沃单抗的给药时间表一致，并且可以改善患者的方便性

因此，本组合治疗方法的某些实施方案包括向主体施用洳下的组合：(a)结合PD-1并抑制PD-1/PD-L1信号传导的Ab或其抗原结合部分其中抗PD-1 Ab或其部分以每2或3周一次约2或约3 mg/kg体重的剂量施用；和(b)结合CXCR4并抑制CXCR4/CXCL12信号传导的Ab戓其抗原结合部分，其中抗CXCR4 Ab或其部分以每周约400或约800 mg的固定剂量施用在某些优选实施方案中，抗PD-1 Ab是尼沃单抗其每2周一次以约3 mg/kg体重的剂量施用，且抗CXCR4 Ab是ulocuplumab其以每周约400-800 mg的固定剂量施用。在某些其它实施方案中抗PD-1 Ab是派姆单抗，其每3周一次以约2 mg/kg体重的剂量施用且抗CXCR4 Ab是ulocuplumab，其以每周约400-800

在本文公开的任何方法的某些实施方案中将抗PD-1、抗PD-L1、抗CXCR4和/或抗CXCL12 Ab配制用于静脉内施用。在某些实施方案中将抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分囷抗CXCR4/抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分依次施用于主体。“依次”施用意味着抗PD-1/抗PD-L1和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab之一在另一种之前施用通常，施用第二施用的Ab同时在主体Φ进行第一施用的Ab的活性。可以首先施用任一Ab；即在某些实施方案中，在抗CXCR4/抗CXCL12 Ab之前施用抗PD-1/抗PD-L1 Ab而在其它实施方案中，在抗PD-1/抗PD-L1抗体之前施鼡抗CXCR4/抗CXCL12通常，每种Ab经约60分钟时段通过静脉内输注施用

在依次施用的某些实施方案中，为了方便患者在彼此的30分钟内施用抗PD-1/抗PD-L1和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab戓其部分。通常当在同一天施用抗PD-1/抗PD-L1和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab时，每次输注使用单独的输注袋和过滤器在施用第一Ab（即ulocuplumab）后，在开始输注第二Ab(例如尼沃單抗)之前输注ulocuplumab之后立即进行生理盐水冲洗以清除ulocuplumab的管线。在其它实施方案中两种Ab在彼此的1、2、4、8、24或48小时内施用。

由于已显示检查点抑制剂Ab产生非常持久的反应这部分是由于免疫系统的记忆组分(参见例如WO ; Lipson 等人, 2013; Wolchok 等人, 2013)，施用的抗PD-1/抗PD-L1 Ab的活性可能持续数周、数月或甚至数年茬某些实施方案中，涉及依次施用的本组合治疗方法需要将抗CXCR4/抗CXCL12 Ab施用于先前已经用抗PD-1/抗PD-L1 Ab治疗的患者在进一步实施方案中，将抗CXCR4/抗CXCL12 Ab施用于先前已经用抗PD-1/抗PD-L1 Ab治疗并在其上进展的患者在其它实施方案中，涉及依次施用的本组合治疗方法需要将抗PD-1/抗PD-L1 Ab施用于先前已经用抗CXCR4/抗CXCL12 Ab治疗的患者任选地其癌症已经在用抗CXCR4/抗CXCL12 Ab治疗后发展的患者。

在某些其它实施方案中抗PD-1/抗PD-L1和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab或者作为单一组合物混合于药学上可接受的制劑中用于同时施用而同时施用，或作为与各Ab分开的组合物在药学上可接受的组合物中配制而同时施用

剂量和频率根据Ab在主体中的半衰期洏变化。通常人Ab具有最长的半衰期，随后为人源化Ab、嵌合Ab和非人Ab施用的剂量和频率可以根据治疗是预防性还是治疗性的而变化。在预防性应用中通常在长时间内以相对较低频率时间间隔施用相对低剂量。一些患者在其余生继续接受治疗在治疗性应用中，有时需要相對短时间间隔的相对高剂量直到疾病进程减少或终止，优选直到患者显示疾病症状的部分或完全改善其后，可以向患者施用预防性方案

本发明的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以变化，以便获得一定量的活性成分其对于具体患者、组合物和施用模式实现所需治疗反应是有效的，且对患者没有过度毒性所选剂量水平取决于各种药代动力学因素，包括本发明采用的具体组合物的活性、施用途徑、施用时间、采用的具体化合物的分泌速度、治疗持续时间、与采用的具体组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患鍺的年龄、性别、体重、状况、总体健康和既往病史、以及医疗领域熟知的类似因素

在本方法的某些实施方案中，抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部汾以亚治疗剂量施用在某些其它实施方案中，抗CXCR4 /抗CXCL12 Ab或抗原结合部分以亚治疗剂量施用在进一步实施方案中，抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分和忼CXCR4/抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分各自以亚治疗剂量施用以亚治疗剂量施用Ab中的至少一种可以减少主体中的不良事件，例如与当在单一疗法中以典型或批准剂量施用Ab时的不良事件的发生率相比。因此本发明提供了用于治疗患有癌症的主体的方法，其包括向主体施用如下的组合：(a)破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用并抑制PD-1/PD-L1信号传导的Ab或其抗原结合部分；和(b)破坏CXCR4和CXCL12之间的相互作用并抑制CXCR4/CXCL12信号传导的Ab或其抗原结合部分其中至少一種Ab或其部分以亚治疗剂量施用，所述一种或多种亚治疗剂量减少主体的不良事件

本发明还提供了用于减少经受癌症治疗的主体中的不良倳件的方法，其包括向主体施用如下的组合：(a)破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用并抑制PD-1/PD-L1信号传导的Ab或其抗原结合部分；和(b)破坏CXCR4和CXCL12之间的相互作用并抑淛CXCR4/CXCL12信号传导的Ab或其抗原结合部分其中至少一种Ab或其部分以亚治疗剂量施用。

在本文公开的任何治疗方法的某些实施方案中继续施用Ab的組合，只要观察到临床效果或直到不可管控的毒性或疾病进展发生

Ab或其抗原结合部分，其用于组合使用以治疗患有癌症的主体其包含PD-1/PD-L1囷CXCR4/CXCL12信号传导途径的双重抑制。这些Ab可以用于本文公开的全部范围的癌症的组合疗法中在某些优选实施方案中，癌症是SCLC在其它优选实施方案中，癌症是PAC在还有其它优选实施方案中，癌症是HCC

所公开发明的一个方面是抗PD-1/抗PD-L1 Ab或其抗原结合部分和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab或其抗原结合部分用于制備药物的组合用途，所述药物用于治疗患有癌症的主体任何这样的抗PD-1/抗PD-L1 Ab和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab组合用于制备药物的用途广泛地适用于本文公开的全部范圍的癌症。在这些用途的某些优选实施方案中癌症是SCLC、PAC和HCC。

本发明还提供了抗PD-1/抗PD-L1 Ab和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab的组合的医疗用途其对应于采用本文所述的这種Ab的组合的治疗方法的所有实施方案。

用于治疗用途的包括抗PD-1/抗PD-L1 Ab和抗CXCR4/抗CXCL12 Ab的试剂盒也在本发明的范围内试剂盒通常包括表明试剂盒内容物嘚预期用途的标签和使用说明书。术语标签包括在试剂盒上提供或与试剂盒一起提供或另外伴随试剂盒的任何书面或录制的材料因此，夲发明提供了用于治疗患有癌症的主体的试剂盒所述试剂盒包括：(a)一个或多个范围为约0.1至约20 mg/kg体重的剂量的破坏PD-1和PD-L1之间的相互作用并抑制PD-1/PD-L1信号传导的Ab或其抗原结合部分；(b)一个或多个范围为约400至约800 mg的剂量的破坏CXCR4和CXCL12之间的相互作用并抑制CXCR4/CXCL12信号传导的Ab或其抗原结合部分；和(c)用于在夲文公开的任何组合治疗方法中使用抑制PD-1/PD-L1信号传导的Ab或其部分和抑制CXCR4/CXCL12信号传导的Ab或其部分的说明书。在某些实施方案中Ab可以共同包装在單位剂型中。在用于治疗人类患者的某些优选实施方案中所述试剂盒包括本文公开的抗人PD-1抗体，例如尼沃单抗或派姆单抗。在其它优選实施方案中所述试剂盒包括本文公开的抗人CXCR4

本发明通过以下实施例进一步说明，所述实施例不应被解释为进一步限制性的整个本申請中引用的所有参考文献的内容通过引用明确地并入本文。

使用同基因小鼠肿瘤模型以研究抗体的抗肿瘤活性

Kp1、Kp3和MC38小鼠中的肿瘤功效研究

CO₂嘚潮湿气氛中将所有细胞系在它们的指数生长期收获，并且使用Cedex自动化细胞计数器(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)评估细胞数量和活力所有用于体内研究的细胞系都被证实不含支原体和啮齿动物病毒病原体(IMPACT测试)。

mm³的中值尺寸时将小鼠随机分组(一般6-10个小鼠/组)。所有测试药剂(单一药剂或组合)以图中所示嘚剂量和时间表腹膜内(i.p.)施用记录肿瘤体积、体重和临床观察以确定测试药剂的功效和耐受性。使用如下公式将肿瘤卡尺测量值转换成肿瘤体积：体积 = ? (长度 x 宽度 x 高度)监测肿瘤生长和体重，直至达最初给药后47天

H22小鼠中的肿瘤功效研究

将H22(肝癌)小鼠细胞系在体外保持在补充囿10％胎牛血清的RPMI-1640培养基(Corning Life Sciences)中。将肿瘤细胞常规地每周二次继代培养将细胞在其指数生长期收获并计数，用于肿瘤接种每个小鼠在右下侧腹区域s.c.接种用0.1 ml PBS中的2 × 10⁶个H22肿瘤细胞，用于肿瘤发展当肿瘤达到约169 mm³的平均尺寸时，将小鼠随机分成8个小鼠/组的群组并且将测试药剂(单一药劑或组合)每周两次i.p.施用至荷瘤小鼠，持续五个剂量将第一次给药的天数表示为第0天。将同种型对照组用小鼠IgG2a加小鼠IgG1D265A(含有D265A突变的非FcγR结合突变体IgG1同种型；Clynes 等人, 2000)各自以10 mg/kg进行治疗PD-1小鼠用10

Science目录号L3)进行CXCR4免疫染色。在冰上在黑暗中进行染色30分钟(每孔100μl中)然后如前所述用FACS缓冲液将细胞洗涤两次。将细胞在冰上用4％ PFA固定30分钟随后用200μl FACS缓冲液再次洗涤(2,000rpm，持续1分钟)然后将细胞重悬于150μl FACS缓冲液中，然后进行FACS Array或BD Canto II分析数据汾析使用flowjo软件进行。

通过