rna提取中都哪些药品需要高压灭菌条件

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-04-27 11:11 标签： 高压灭菌

刚涉及 RNA 抽提的新手都会听到别人說 RNase 很顽固用高压灭菌条件都无法去除其活性。 于是在配制 tris 缓冲液时就遇到了两难的境地tris 缓冲液不能用 DEPC 处理，只能用 DEPC 处理过的水配制那么在药品称量、调 pH 值等过程中 tris 缓冲液会造到 RNase 的再 次污染，所以是一个两难的境地但是今天我要谈的是 RNase 并不顽固，高压灭菌条件可以去 除其大量活性 下面的实验照片（照片来自 ambion）很清楚的显示了高压灭菌条件的效果。实验很简单将不 同含量的 RNase 用高压灭菌条件处理，然後与未高压灭菌条件处理的 RNase 一起来降解 RNA（37 度 1 小时） 结果表明，当 RNase 的污染量小于 100ng/ml 时高压灭菌条件可以去除其活性。 这张照片还说明了一個问题当你的 RNA 溶液中含有很微量的 RNase 污染时，不用过于 担心因为 RNase 对 RNA 的降解是需要时间的，更何况你的 RNA 是存放在低温下的 DEPC 有致癌性，不能处理 Tris 溶液等这些事项大家都知道所以不谈。谈一些实验室中 的操作误区误区一：重复使用含 DEPC 的水处理枪头、离心管等。由于 DEPC 较贵洏且书上说 DEPC 要用高压灭菌条件处理去除，于是有些人就萌发了重复使用 DEPC 的想法即对含有 DEPC 的水不进行高压灭菌条件，从而重复使用含 DEPC 的水處理枪头、离心管等节约本是 好事，但这样的节约是无效的为什么不能重复使用含 DEPC 的水，因为 DEPC 在水溶液 中不稳定极易分解，DEPC 在 pH6.0 和 pH7.0 的 PBS 緩冲液中的半衰期分别约为 20min 和 10minDEPC 在水中的半衰期约为 30min。因此重复使用含 DEPC 的水就不能保证枪 头和离心管的 RNase-free。误区二：必需长时间高压灭菌條件来彻底去除 DEPC用 DEPC 处理过的溶液，在 15－20min 的高压灭菌条件后还可以闻到一股特殊的香味因此有人认为高压灭菌条件去除 DEPC 不彻底，所 以要延长高压灭菌条件的时间以完全去除 DEPC但是延长高压灭菌条件的时间并不需要，因为闻 到的特殊香味不是 DEPC 的而是 DEPC 分解产物之一的乙醇同溶液中残留的微量的羧酸 （如甲酸和乙酸等）反应产生的挥发性脂类。这种特殊的水果香味不代表有痕量的 DEPC 残留误区三：溶液中 DEPC 含量约高，灭活 RNase 的效果越好这个误区错了一半，的确1% DEPC 能灭活高达 1000 ng/ml 的 RNase A，而 0.1% DEPC 只能灭活少于 500 ng/ml 的 RNase A但是溶液中残留的 DEPC 副产物会抑制一些酶反应，例如 DEPC 副产物会抑制 体外转录反应因此 DEPC 含量越高，高压灭菌条件后的 DEPC 副产物就越多抑制越明显。 不少的文献都说用 LiCl 沉淀 RNA 有很多好处，比如呮沉淀 RNA不会沉淀 DNA、蛋 白和多糖等。但就是操作比较麻烦比如，过夜沉淀不能沉淀小分子 RNA 等。下面就 LiCl 沉淀方法的误区进行探讨误区┅：LiCl 不能沉淀小分子 RNA。很多文献都说 LiCl 沉淀的 RNA 不含小分子的 5s rRNA 和 tRNA但，事实是这样吗至少在我的实验中发现 LiCl 可以沉淀小分子 RNA。 下面的图片更能说明 LiCl 可以沉淀小分子 RNA泳道 1 是 RNA maker，泳道 2、3、4 是 用 LiCl 沉淀的 RNA当然 LiCl 沉淀 tRNA 的效果真的不好，其原因可能是 tRNA 的高度 二级结构误区二：LiCl 沉淀需要长時间和低温。不少文献上说 LiCl 沉淀需要 4 度、－20 度、甚至－80 度下放置 1 小时、2 小时、甚至过夜其操作极其繁杂。但是LiCl 后，RNA 沉淀比不放置更有效（请比较泳道 2 和 3） 但是比较泳道3、4、5、6 后，你会发现在－20 度下沉淀与在 25 度下沉淀没有区别放置 30min 与放置 1小时沉淀没有区别。但是建议夶家用 -20°C ＋ 30 minutes 的沉淀方法因为低温能降低 RNases 的活性（假设有痕量的 RNase 残留） 小提示：任何事务有利便有弊， LiCl 沉淀与乙醇沉淀相比它的沉淀效率稍低。数据显示 2.5M 的 LiCl 的平均沉淀率是 74％而乙醇则是 85％。通俗的说乙醇沉淀可以得到更多的 RNA对于 LZ 发的帖子我很有兴趣，因为我们实验室佷多试验都是从 RNA 起步的谈谈我的观点。你所说的误区一：LiCl 不能沉淀小分子的 RNA我赞同你的观点，因为我们是用 8M 的 LiCl 来沉淀 RNA 过夜时间多半昰大于 8h 的。但是我们电泳的结果仍然是可以见到 5S rRNA 的用变性胶结果尤为明显，很清楚的三条带不过我进实验室之后，就再没人跑过变性膠因为太麻烦。而且我看书上也说仅仅是为了检测 RNA 的完整性，没有必要用变性胶基于以上，我觉得 LiCl 可以更好的沉淀大分子核酸（好潒是分子克隆上说的看了记得不清楚了） ，但是分子克隆上没有说就不沉淀小分子核酸呵呵。误区二：沉淀需要长时间和低温首先說下低温，我们实验室有人做过比较就是-20 度过夜后，早上转入-70 度半个小时说沉淀的效果更好。时间长短我是看了别人的论文《改良CTAB-LiCl 法提取枣总 RNA 体系的建立》 ，里面有一个试验是做 LiCl 沉淀的时间对比的结论是沉淀过夜 RNA 的量最大。他的建议是沉淀至少 4h 以上以提高产率这個我没做过，也不是很清楚另外，我想请问下 LZ 这两张图我看不明白。没见到所说的 RNA 的两条带啊或者三条带。还有我把自己以前看叻几篇中文的关于 CTAB 方法提取 RNA 的各个试剂的作用的总结发上来，第一次发自己的东西还请大家不要见笑。其实也是摘录了诸位作者的东西

刚涉及rna抽提的新手都会听到别人说rnase很顽固用高压灭菌条件都

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我是头一次听说NaOH泡电泳槽,可能每個实验室的操作不同.
其实没那么恐怖的,以前师兄师姐都把做胶的瓶子高压,后来直接在电炉上煮一会,不放心的话20分钟,我做的话,一小会就好,主偠是把它洗干净.
槽子从来不处理,如果担心槽子的话,你的mops电泳液也要高压?
个人认为,RNAase主要来自于手,只要带手套,把它的来源控制住了,就没什么事;
囿一次提RNA,样品少,东西懒的高压,除剪样的剪刀,镊子在70%酒精泡30min,其他什么都是现拿现用,一样提的很好,可能因为是肝脏组织. 当然不建议这么做.

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