作为 DHODH 抑制剂的五元二氢杂环酮类衍生物及应用 技术领域

本发明属于疟疾治疗领域 具体涉及作为 DHODH 抑制剂的二氢噻吩酮衍生物 的合成及应用。 背景技术

疟疾 (Malaria)是经蚊叮咬而感染疟原虫所引起的虫媒传染病 目前仍然是全球影 响人类健康的问题之一。目前典型的治疗疟疾的药物中已上市药物包括氯喹青蒿素， 乙胺嘧啶等 近几十年来， 越来越多的耐药问题在许多一度非常有效的药物中产生 如奎宁， 氯喹 和梅尔喹啉等等； 疟原虫经氯喹作用， 疟原虫的核碎裂 细胞浆出现 空泡， 疟色素聚成团块 氯喹并不能直接杀死疟原虫， 但能干扰它的繁殖 它与核蛋 白有较强的结合力， 通过喹啉环上带负电的 7-氯与疟原虫 DNA上的鸟嘌吟上的 2-氨 基接近使氯喹插入到 DNA的双螺旋两股之间，与 DNA形成复合物从而阻止 DNA 的复制与 RNA转录。 氯喹还能抑制磷酸掺入疟原虫的 DNA与 RNA 由于核酸的合 成减少， 而干扰疟原虫的繁殖 但是， 最近许多年 有报道证实氯喹及其衍生物作为 抗瘧药物的药效正在快速消失， 有些地区的病人中甚至出现了对氯喹的完全抗性 同 时导致寄生虫的清除需要更长的治疗周期和反复发作 (Wu, T.; S. Nagle, A.; K.

), )。臨床上用于预防疟疾和休止期抗复发治疗但随着使用多年 后酶的突变导致药物脱靶现象的不断凸显及上述药物或多或少均存在腹泻、 皮疹、 高 血压以及肝酶系统的紊乱等毒副作用， 因此 寻找新的高选择性， 高效 安全及成药 性好的的恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶抑制剂具有重要的学术价值及应用价值。

Chemistry Letters. 2006 16： 88-92) ， 是催化二氢乳清酸脱氢作用使其转化为乳清酸的一种酶 该过程属于嘧啶 从头合成途径的第四步反应， 因而 DHODH是核酸嘧啶合成的关键酶 同时也是寄生 虫体内唯一催化二氢乳清酸生成乳清酸盐，主要参与催化嘧啶从头生物合成途径中的 苐四步反应人类及疟原虫二氢乳清酸脱氢酶位于线粒体内膜上， 其催化过程需要其 它辅因子的参与 从结构上讲， DHODH主要分为两部分 即 N-末端的 α -螺旋结构 区域和 C-末端的 α / β桶状结构。 DHODH通过 N-末端的独特结构附着在线粒体内膜 上， 而 C-末端区域则是催化作用的主要位点 在 DHODH 上同時具有底物和辅因子 黄素单核苷酸 （Flavin mononucleotide, FMN) 以及辅酶 Q ( CoQ) 的结合位点。 其催 化过程主要通过两步反应完成： 首先二氢乳清酸被还原为乳清酸 同时 FMN接受该 过程脱下的氢原子氧化为 FMNH₂之后在 CoQ的作用下， FMNH₂发生脱氢作用重新 还原为 FMN 任何可以与底物或辅因子竞争性结合的化合物都可以阻断 DHODH的 作鼡， 从而阻断 DNA或 RNA的合成 恶性疟原虫 DHODH抑制剂主要通过阻断疟 原虫体内生物嘧啶的合成， 抑制疟原虫的繁殖和生长达到治疗疟疾的作用

此外， 对于大部分生物来说 嘧啶碱基可以通过从头合成途径和补救途径得到， 但是快速分化的人类细胞 例如激活的 T-淋巴细胞、 B-淋巴细胞鉯及肿瘤细胞， 也 需要依赖于嘧啶的从头合成途径来满足其生长需求这使得 DHODH抑制剂可以作为 抗细胞增殖剂用于肿瘤以及某些免疫抑制反應的治疗。由于 DHODH对 DNA和 RNA 合成的普遍作用机制

Brequinar治疗窗窄， 且联合顺铂或环孢菌 素 A 口服给药时 容易引起血小板减少、 黏膜炎的副作用， 限制叻其在临床中的广 泛应用 Leflunomide于 1998年上市， 对多种自身免疫疾病、 器官移植引起的急慢性 反应和异种排斥反应均有很强的抑制作用 临床上已鼡于治疗红斑狼疮、 类风湿性关 节炎， 并可用于防治移植物排异反应

元二氢杂环酮类衍生物， 结构骨架完全不同于以往文献报道过的高活性恶性疟原虫 DHODH抑制剂 其中的一些化合物在细胞水平具有显著的抑制疟原虫细胞株的活性 和免疫活性， 具有良好的成药前景 针对该系列先导化合物， 本发明人设计合成了一 系列五元二氢杂环酮衍生物 结构通式如下：

R¹选自 H， C1-C10烷基 CIO以下不饱和烃基， 任选取代的芳基 硝基， 氨基 NR⁴R⁵， 卤素；

R²选自 H C1-C6烷基， C2-C6不饱和烃基 C1-C6烷基羰基， 任选取代的苯甲 酰基 羧基， 氨基羰基 C1-C6烷氧基羰基， C1-C6烷基氨基羰基 羟基， C1-C6烷 氧基 C3-C8环烷基氨基羰基， C3-C8环烷基 -C1-C6烷基氨基羰基 C3-C8环烷基 -C1-C6烷氧基羰基；

R³选自 H， C1-C6烷基 任选取代的 C2-C6不饱和烃基， C1-C6烷基羰基 任 选取代的苯甲酰基， 羧基 氨基羰基， C1-C6烷氧基羰基 C1-C6氨基羰基， 羟基 C1-C6烷氧基；

R⁴和 R⁵独立的选自 H， C1-C6烷基 -C(0)NHR⁶， C1-C6烷氧基羰基 卤素取 代的烷基， C2-C6不饱和烃基 任选取代的芳基， C1-C6烷基羰基 任选取代的苯甲 酰基， 任选取代的杂环基 任选取代的杂环基羰基， C1-C6烷氧基羰基；

R⁶选自任选取代的芳基和任選取代的杂环基

在优选实施例中， 所述化合物选自下式 II的化合物： 式中

R⁷选自任选取代的芳基， 任选取代的芳基羰基 任选取代的含氮雜环基羰基， 任选取代的杂环基 和任选取代的芳氧基， C 1-C3烷基羰基；

本文中 "烷基 "通常指碳链长度为 1-10个碳原子的饱和的支链和直链烷基， 優 选长 1-6个碳原子、 更优选长 1-4个或 1-3个碳原子的烷基 "环烷基"指环状烷基， 其成 环碳原子数通常为 3-8个 示例性的环烷基包括环丙基、 环丁基、 環戊基、 环庚基和 环己基等。

本文中 "不饱和烃基"包括链烯基和炔基。 "链烯基"指直链或支链含有 2-10 个碳原子、 其中至少是链中的两个碳原子の间含有一个双键的基团优选的烯基是含 有 2-4个碳原子的烯基。 典型的链烯基包括乙烯基、 1-丙烯基、 2-甲基 -1-丙烯基、 1- 丁烯基 和 2-丁烯基

本文所用 "炔基"是指直链或支链含有 2-10个碳原子， 其中至少是链中的两个碳 原子之间含有一个叁键的基团 优选的炔基是含有 2-4个碳原子的炔基。 典型的炔基 包括乙炔基、 1-丙炔基、 1-甲基 -2-丙炔基、 2-丙炔基、 1 -丁炔基和 2-丁炔基

本文中， "芳基"指含有 6到 14个碳原子的单环、 双环或三环芳族基团 包括苯 基、 萘基、 菲基、 蒽基、 茚基、 弗基、 四氢化萘基、 二氢化茚基等。 芳基可任选地被 1 -5个 （例如 1、 2、 3、 4或 5个） 选自以下的取代基取玳： 卤素、 C 1-C4醛基、 C 1-C6 的直链或支链烷基、 氰基、 硝基、 氨基、 羟基、 羟甲基、 卤素取代的烷基 （例如三氟 甲基） 、 卤素取代的烷氧基 （例如彡氟甲氧基） 、 羧基、 C1-C4烷氧基、 巯基、 C 1-C4 烷基巯基、 -SF₅、 吗啉基、 任选取代的芳基 （例如任选取代的苯基） 、 任选取代的芳 氧基 （例如任选取玳的苯氧基） 和任选取代的苄氧基。 例如 芳基可以被 1-3个选自 以下的基团取代： 氟、 氯、 溴、 C 1-C4烷基、 三氟甲基、 吗啉基、 甲氧基、 苯基、 甲 氧基取代的苯基、 苯氧基、 苄氧基、 被卤素取代的苄氧基、 乙氧基和硝基等。

本文所使用的术语 "杂环基"指单一或稠合的环结构 在性质仩可以是芳族或 非芳族的， 并且其优选含有 3-20个成环原子 更优选含有 5-14个环原子， 其中至少 1个并且优选最多可至 4个是选自 0、 S和 N的杂原子 本攵中， 杂环基的例子包括 呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 吡咯烷基、 咪唑基、 三唑基、 噻唑基、 四唑基、 噁唑基、 异噁唑基、 吡唑基、 吡啶基、 嘧啶基、 吡嗉基、 哒嗉基、 三嗉基、 喹啉基、 异喹啉基、 喹喔啉基、 苯并噻唑基、 苯并噁唑基、 苯并噻吩基、 苯并呋喃基、 吗啉基、 咔唑基、 二苯并噻吩、 香豆素基和 1,2-亚甲基二氧苯基 本文中， 杂环基可任选地被 1-3个本 文所述的取代基取代

本文所使用的术语 "杂原子 "包括 0、 S囷N。 当杂原子是 N时 此 N原子可 以进一步由例如氢或 C1-C10烷基的基团所取代。 当杂原子是 S时 此 S原子可以进 一步由例如 C1-C10烷基的基团所取代。

本文所使用的术语 "杂芳基" 或 "芳香杂环基"指如上所述具有芳族特性的那 些杂环基 包括但不限于呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 吡啶基、 噁唑基、 吡嗉基、 哒嗉 基、 嘧啶基等。

本文所使用的术语 "卤素" 包括氟、 氯、 溴和碘

除非另有说明， 本文所使用的术语 "任选取代的" 指其所修饰的基团鈳任选地 被 1-5个 （通常为 1、 2或 3个） 选自以下的取代基取代： C1-C4 烷基、 羧基、 卤素、 C1-C4 烷氧基、 氰基、 硝基、 氨基、 羟基、 醛基、 C1-C6酰基、 羟甲基、 鹵素取代的 C1-C4 烷基 （例如三氟甲基） 、 C1-C10硫代烷基 （例如五氟硫甲基） C1-C10硫代 烷氧基 （例如五氟硫甲氧基） ， 卤素取代的 C1-C4 烷氧基 （例如三氟甲氧基） 、 巯 基和 C1-C4 酰基

本文中， 酰胺基 （氨基羰基） 自身或作为其它基团的一部分 指 " C1-C6烷基 -CO-NH-"基团、 " C3-C8环烷基 -CO-NH-"或 " C3-C8环烷基 -C1-C6烷基 -CO-NH-" 。 示例性的酰胺基包括但不限于甲酰胺基、 乙酰胺基、 丙酰胺基、 丁酰胺基、 环丙酰胺 基、 环丙甲酰胺基等

本文中， 酰基自身或作为其它基团的一部分 鈳含有 1-6个碳原子， 优选 1-4个碳 原子 示例性的酰基包括但不限于甲酰基、 乙酰基等。

本发明优选的化合物包括那些 为 S和 0 X₂为 0的化合物。

本发奣优选的化合物包括那些 R³为 H的化合物

在某些实施方式中， 本发明的化合物不包括化合物 14一 21

本发明优选的化合物包括 R²为 C1-C6烷氧基羰基（例洳甲氧基羰基、乙氧基羰基， 环丙氧基羰基 环丙甲氧基羰基等） 、 C1-C6氨基羰基 （例如甲酰胺基， 乙酰胺基 丙酰胺基， 丁酰胺基 环丙酰胺基， 环丙甲酰胺基等） 的化合物

本发明优选的化合物包括 R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH-任选取代的萘基、 -NH- 任选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的㈣氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基的化 合物。 本发明优选的化合物中包括 R¹中任选取代的苯基或萘基上的取代基为卤素、 卤 素取代的 C 1-C4烷基、 C 1 -C4烷基、 C 1-C4烷氧基的化合物

在优选实施例中， 本发明包括 ₁为8和 0 X₂为 0， R³为 H R²为 C 1-C6烷氧基羰 基 （例如甲氧基羰基、 乙氧基羰基， 环丙氧基羰基 环丙甲氧基羰基等） 、 C 1 -C6氨 基羰基 （例如甲酰胺基， 乙酰胺基 丙酰胺基， 丁酰胺基 环丙酰胺基， 环丙甲酰胺 基等） R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH-任選取代的萘基、 -NH-任选取代的二氢化 茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基的化合物。 更优选地 R¹中任选取代的苯基或萘基上的取代基为卤素、 卤素取代的 C1 -C4烷基、 C 1 -C4烷基、 C 1 -C4烷氧基。

在更优选的实施例中 ₁为8和 0， X₂为 0 R³为 H， R²为 C1 -C6烷氧基羰基 （例 如甲氧基羰基、 乙氧基羰基等） R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH-任选取代的萘基、 -NH-任选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基； 苯基优选没有取代基， 戓者具有 1一 3个选自卤素、 三氟甲基、 甲基、 硝基和甲氧基的 取代基 优选的， 取代基位于 3、 4和 /或 5位 优选的， 所述化合物不包括化合物 14一 21

在其它优选的实施例中， ₁为8和 0 X₂为 0， R³为 H R²为 C2-C4烷氧基羰基（例 如乙氧基羰基，环丙氧基羰基环丙甲氧基羰基等）， R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH- 任选取代的萘基、 -NH-任选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH- 任选取代的喹啉基； 苯基优选没有取代基 或者具有 2— 3个选自卤素和 C 1 -C4烷基的 取代基。 优选地 所述化合物不包括化合物 14一 21。

在其它优选实施例中 本发明的化合物包括 为^11-任选取代的萘基、 -NH-任 选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基的化合 物。

本发明优选下文表 1中所示的编号 1 -67的化合物 尤其优选抑制率在 50 %以上 的那些化匼物。 尤其是 本发明化合物包括化合物 1、 2、 4、 6、 7、 10、 22-25、 35、 38、 39、 44、 61禾 Π 62。 本发明的化合物可采用以下方法制备获得

丙酮 18h ' 氯仿，12h 上述制备鋶程中 R¹为最终产物中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义相同本领域技术人员可根据实际制备需要， 采用本领域常规獲得的各种起 始化合物为原料 制备本发明的化合物。 例如 可参考杜晓华等 （非硫光气法合成一 些难合成的苯基异硫氰酸酯 . [J]. 农药， 2004 43 (2)， 78-79)) 所述的方法合成本发 明式 Π化合物。

上述制备流程中 R¹为最终产物中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义 C1-C6

上述制备流程中 R¹为最终产物中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义相同 R³的定义与上文中 C1-C6烷氧基羰基相同。

上述制备流程中 R¹为最终产粅中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义相同 本发明第二方面包括一种药物组合物， 该组合物含有治疗有效量的本发明式 I、 II的化合物或其药学上可接受的盐 以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明化合物的药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和囿机酸盐 例如 盐酸盐、 氢溴酸盐、 硫酸盐、 柠檬酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 马来酸盐、 富马酸盐、 扁桃酸盐和草酸盐； 以及与碱例如钠羥基、 三 （羟基甲基）胺基甲烷 （TRIS， 胺丁三 醇） 和 N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐 虽然每个人的需求各不相同， 本领域技术人员可确萣本发明药物组合物中每种 活性成分的最佳剂量 一般情况下， 本发明的化合物或其药学上可接受的盐 对哺乳 动物每天口服给药， 药量按照约 0.0025到 50毫克 /公斤体重但最好是每公斤口服给药 约 0.01到 10毫克。 例如 单位口服剂量可以包括约 0.01到 50毫克， 最好是约 0.1到 10毫 克的本发明化合物單位剂量可给予一次或多次， 每天为一片或多片 每片含有约 0.1 到 50毫克， 合宜地约 0.25到 10毫克的本发明化合物或其溶剂化物

本发明的药物组合粅可被配制成适合各种给药途径的制剂形式， 包括但不限于 被配制成用于肠外 皮下， 静脉 肌肉， 腹腔内 透皮， 口腔 鞘内， 颅内 鼻腔或 外用途径给药的形式， 用于治疗肿瘤和其他疾病给药量是有效地改善或消除一个或 多个病症的药量。对于特定疾病的治疗 有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病 有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用 或者可依据有效的治疗方案给 药。 给药量也許可治愈疾病 但是给药通常是为了改善疾病的症状。 一般需要反复给 药来实现所需的症状改善 药的剂量将根据病人的年龄， 健康与体偅 并行治疗的种 类， 治疗的频率 以及所需治疗效益来决定。

本发明的药物制剂可以给予任何哺乳动物 只要他们能获得本发明化合物嘚治 疗效果。 在这些哺乳动物中最为重要的是人类

本发明的化合物或其药物组合可用于治疗与预防各种 DHODH介导的疾病， 尤其 与 DHODH的抑制相关嘚疾病 本文中， DHODH介导的疾病主要包括： 寄生虫病 包 括恶性疟疾、 间日疟、 卵形疟疾、 三日疟、 克氏锥虫病和登革热等； 由某类细胞快速 增殖引起的疾病， 如癌症； 炎症反应； 以及各种自身免疫疾病 DHODH介导的疾病 还包括由同种或异种器官移植引起的宿主排斥反应。

具体地講 DHODH介导的疾病包括但不限于克氏锥虫病、 恶性疟疾、 登革热、 间日疟、 卵形疟疾、 三日疟、 类风湿性关节炎、 结肠炎、 红斑狼疮 （包括系统性红斑 狼疮） 、 肾小球疾病 （包括多种继发性和原发性肾小球疾病） 、 抗器官移植物排异反 应、 黑色素瘤、 银屑病关节炎和银屑病等。

本发明的药物制剂可用已知的方式制造 例如， 由传统的混合 制粒， 制锭 溶解， 或冷冻干燥过程制造 制造口服制剂时， 可结合固體辅料和活性化合物 选择 性研磨混合物。 如果需要或必要时加入适量助剂后 加工颗粒混合物， 获得片剂或锭 剂芯

合适的辅料特别是填料， 例如糖类如乳糖或蔗糖 甘露醇或山梨醇； 纤维素制 剂或钙磷酸盐， 例如磷酸三钙或磷酸氢钙； 以及粘结剂 例如淀粉糊， 包括玉米淀粉 小麦淀粉， 大米淀粉 马铃薯淀粉， 明胶 黄芪胶， 甲基纤维素 羟丙基甲基纤维素， 羧甲基纤维素钠 或聚乙烯吡咯烷酮。 如果需要 可增加崩解剂， 比如上面提到的淀 粉 以及羧甲基淀粉， 交联聚乙烯吡咯烷酮 琼脂， 或褐藻酸或其盐 如海藻酸钠。 辅助剂特別是流动调节剂和润滑剂 例如， 硅石 滑石， 硬脂酸盐类 如镁硬脂酸钙， 硬脂酸或聚乙二醇如果需要，可以給锭剂核芯提供可以抵忼胃液的合适包衣为此， 可以应用浓缩糖类溶液 这个溶液可以含有阿拉伯树胶， 滑石 聚乙烯吡咯烷酮， 聚 乙二醇和 /或二氧化钛 漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。 为了制备耐胃液的 包衣 可使用适当的纤维素溶液， 例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻 苯二甲酸 可向药片或锭剂核芯的包衣加入染料或色素。 例如 用于识别或为了表征 活性成分剂量的组合。

因此 本发明第三方面提供一种治疗或预防 DHODH介导的疾病的方法， 该方法 包括给予需要的对象以本发明的式 I或 Π化合物或药物组合物。

给药方法包括但不限于本领域周知的各种给药方法 可根据患者的实际情况加 以确定。 这些方法包括但不限于肠外 皮下， 静脉 肌肉， 腹腔内 透皮， 口腔 鞘 内， 顱内 鼻腔或外用途径给药。

本发明包括本发明式 I或 Π化合物在制备治疗或预防 DHODH介导的疾病用的药 物中的用途

本发明也包括本发明式 I或 Π化合物在制备治疗或预防疟原虫 DHODH介导的疾 病用的药物中的用途。

本发明还包括本发明式 I或 Π化合物在制备抑制疟原虫 DHODH活性用的药物中 的鼡途

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。 这些实施例仅用于说明本发明 但不以任何方式限制本发明。 合成部分：

2-取代苯胺基 -4 ,5-②氢噻 -3-羧酸乙酯系列化合物合成通则: 合成方法： 将 3 mmol的取代苯胺溶于 3 mL的丙酮中 加入 9 mmol的三乙烯二 胺， 滴加 15 mL的二硫化碳 常温搅拌 24小时， 析出黃色固体 抽滤烘干得中间体， 将中间体直接加入烧瓶中 加入 10 mL的三氯甲烷,， 悬浮状滴加溶解有 1 mmol三 光气的 10 mL三氯甲烷溶液， 反应过夜 抽濾得母液， 直接旋干柱层析得取代苯基异 硫氰酸酯,收率 45%左右

乙基 2-取代苯胺基 -4-羰基 -4,5-二氢噻吩 -3-羧基系列化合物合成通则：

合成方法： 现制 0.55 mmol的甲醇钠固体和干燥的 DME 10mL， 取 0.55 mmol 的 4-氯乙酰乙酸乙酯 常温搅拌 1小时， 另取 0.5 mmol的取代苯异硫氰酸酯溶于 10 mL的 DME 氩气保护下缓慢滴加， 反应 6小时结束 选幹 DME， 用稀盐酸中和 饱和食盐水洗涤乙酸乙酯萃取， 有机层浓缩干燥柱层析得产品 上述流程中， R为最 终产物中苯基上的取代基 其定义與前文的芳基取代基的定义相同。

合成方法： 冰浴下 取 2- ( 4-三氟甲基苯胺基） -4-羰基 -4,5-二氢噻吩 -3-羧酸乙 酯 3 mmol， 溶于甲醇-水 =5 : 1 (总 18 mL) 的混合溶液中 加入 5 eq的┅水合氢氧 化锂， 搅拌半小时后撤去冰浴 加热至 60度反应过夜， 旋干甲醇 加少许水和 10% 的稀盐酸调节 pH =2,析出大量米白色固体， 抽滤干燥得产品

合成方法： 将干燥的酸 （l mmol) ， 醇 （l mmol) 三苯基膦 （1.1 mmol) 力口 入至 5 mL的甲苯中， 氩气保护下滴加偶氮二甲酸二乙酯 （1.2 mmol) 反应半小时 后升温至 50度， 过夜反应 饱和食盐水洗涤， 柱层析 （PE:EA=3 : 1 v/v ) 提纯， 得

合成方法： 在 50 mL烧瓶中加入 3 mmol的 60%钠氢约 240 mg和 1.8 mL的无水 THF, 冰水浴下滴加 1.8 mL含有 6mmol的丙二酸二乙酯的无水 THF溶液 10分钟 后滴加 3 mL含有 3 mmol的氯乙酰氯溶液， 维持冰浴一小时 40-45摄氏度反应 1小 时， 常温下滴加取代芳香胺 常温过夜后 TLC显示原料少量存在， 回流 2小時 TLC 显示原料仍存 停止反应， 用稀 HC1调节 pH至 7 乙酸乙酯萃取， 食盐水洗涤 2次 有机层浓缩， 干燥 柱层析 （PE:EA=2_: 1， v/v) 柱层析得纯品， 白色粉末 收率 35-40%。 目标化合物谱图数据

2-取代苯胺基 -4-羰基 -4,5-二氢噻吩 -3-羧酸乙酯系列化合物

2—(4-氯 -3-三氟甲基苯胺基) 酸乙酯 （化合物 9)

DHODH活性测试部分

抑制剂筛选使鼡 DCIP比色法 DCIP在反应中被还原， 是 DHO (二氢乳清酸） 最终的电子受体 因此根据 DCIP在 600nm处吸光度的减弱速率可以判断底物 DHO 的水解程度， 光吸收值减弱嘚速率越快 表明酶的活性越高， 即化合物对其抑制作用 越小 （以同体积的 DMSO为阴性对照 等量的 A77 1726为阳性对照） ， 具体见文献 ( The

本发明化合物對两种恶性疟原虫细胞株的体外活性的抑制效果： 氯喹购于 Sigma公司 SYBR Green购于 Invitrogen公司， 氯喹敏感的恶性疟原 虫 3D7细胞株和氯喹抗性的恶性疟原虫 Dd2细胞株用于体外测试抗疟活性 以 0.5% Albumax II ( Invitrogen公司）代替人血清，其他按 Trager and Jensen的培养方法培养

实验中使用 SYBR Green为荧光探针， 通过测定荧光数据的方法来测定抗疟活 性 培养过程如下， 起始感染率为 1% 2%血压积， 与一系列的药物存在或不存在的 条件下培养 终体积为 100 L。 每种化合物经倍比稀释 浓度范圍为 0.15625 μ Μ到 20 μ Μ。 以 0.2% DMSO作为阴性对照， 不同浓度的氯喹作为阳性对照 以 100 L， 1) 培养皿在避光环境中室温放置 1小 时，将所有样品转移到黑色酶標板中（ Corning 3925 )通过 Biotek公司的 Synergy MX 多功能微孔板检测仪进行荧光检测， 在 485/520 nm下读数 本实验重复两次。

数据分析是根据 Michael等报道的方法进行改进获得简述如下， 阴性对照处理 组获得的荧光数据减去未感染红细胞组所产生的背景荧光数据代表本次实验中正常 培养的恶性疟原虫中的 DNA最大量， 记为阴性对照孔的荧光数据 各测试组及阳性 对照组的荧光数据均如此校正。 不同浓度下抑制率的计算由下式所得： 抑制率 （％) 1— (测试孔中平均荧光计数 /阴性对照孔中平均荧光计数） 〕 X

实施例 1和 2的结果如下表所示：

噻吩酮衍生物的抑制率和活性化合物的 IC

作为 DHODH 抑制剂的五元二氢杂环酮类衍生物及应用 技术领域

本发明属于疟疾治疗领域 具体涉及作为 DHODH 抑制剂的二氢噻吩酮衍生物 的合成及应用。 背景技术

疟疾 (Malaria)是经蚊叮咬而感染疟原虫所引起的虫媒传染病 目前仍然是全球影 响人类健康的问题之一。目前典型的治疗疟疾的药物中已上市药物包括氯喹青蒿素， 乙胺嘧啶等 近几十年来， 越来越多的耐药问题在许多一度非常有效的药物中产生 如奎宁， 氯喹 和梅尔喹啉等等； 疟原虫经氯喹作用， 疟原虫的核碎裂 细胞浆出现 空泡， 疟色素聚成团块 氯喹并不能直接杀死疟原虫， 但能干扰它的繁殖 它与核蛋 白有较强的结合力， 通过喹啉环上带负电的 7-氯与疟原虫 DNA上的鸟嘌吟上的 2-氨 基接近使氯喹插入到 DNA的双螺旋两股之间，与 DNA形成复合物从而阻止 DNA 的复制与 RNA转录。 氯喹还能抑制磷酸掺入疟原虫的 DNA与 RNA 由于核酸的合 成减少， 而干扰疟原虫的繁殖 但是， 最近许多年 有报道证实氯喹及其衍生物作为 抗瘧药物的药效正在快速消失， 有些地区的病人中甚至出现了对氯喹的完全抗性 同 时导致寄生虫的清除需要更长的治疗周期和反复发作 (Wu, T.; S. Nagle, A.; K.

), )。臨床上用于预防疟疾和休止期抗复发治疗但随着使用多年 后酶的突变导致药物脱靶现象的不断凸显及上述药物或多或少均存在腹泻、 皮疹、 高 血压以及肝酶系统的紊乱等毒副作用， 因此 寻找新的高选择性， 高效 安全及成药 性好的的恶性疟原虫二氢乳清酸脱氢酶抑制剂具有重要的学术价值及应用价值。

Chemistry Letters. 2006 16： 88-92) ， 是催化二氢乳清酸脱氢作用使其转化为乳清酸的一种酶 该过程属于嘧啶 从头合成途径的第四步反应， 因而 DHODH是核酸嘧啶合成的关键酶 同时也是寄生 虫体内唯一催化二氢乳清酸生成乳清酸盐，主要参与催化嘧啶从头生物合成途径中的 苐四步反应人类及疟原虫二氢乳清酸脱氢酶位于线粒体内膜上， 其催化过程需要其 它辅因子的参与 从结构上讲， DHODH主要分为两部分 即 N-末端的 α -螺旋结构 区域和 C-末端的 α / β桶状结构。 DHODH通过 N-末端的独特结构附着在线粒体内膜 上， 而 C-末端区域则是催化作用的主要位点 在 DHODH 上同時具有底物和辅因子 黄素单核苷酸 （Flavin mononucleotide, FMN) 以及辅酶 Q ( CoQ) 的结合位点。 其催 化过程主要通过两步反应完成： 首先二氢乳清酸被还原为乳清酸 同时 FMN接受该 过程脱下的氢原子氧化为 FMNH₂之后在 CoQ的作用下， FMNH₂发生脱氢作用重新 还原为 FMN 任何可以与底物或辅因子竞争性结合的化合物都可以阻断 DHODH的 作鼡， 从而阻断 DNA或 RNA的合成 恶性疟原虫 DHODH抑制剂主要通过阻断疟 原虫体内生物嘧啶的合成， 抑制疟原虫的繁殖和生长达到治疗疟疾的作用

此外， 对于大部分生物来说 嘧啶碱基可以通过从头合成途径和补救途径得到， 但是快速分化的人类细胞 例如激活的 T-淋巴细胞、 B-淋巴细胞鉯及肿瘤细胞， 也 需要依赖于嘧啶的从头合成途径来满足其生长需求这使得 DHODH抑制剂可以作为 抗细胞增殖剂用于肿瘤以及某些免疫抑制反應的治疗。由于 DHODH对 DNA和 RNA 合成的普遍作用机制

Brequinar治疗窗窄， 且联合顺铂或环孢菌 素 A 口服给药时 容易引起血小板减少、 黏膜炎的副作用， 限制叻其在临床中的广 泛应用 Leflunomide于 1998年上市， 对多种自身免疫疾病、 器官移植引起的急慢性 反应和异种排斥反应均有很强的抑制作用 临床上已鼡于治疗红斑狼疮、 类风湿性关 节炎， 并可用于防治移植物排异反应

元二氢杂环酮类衍生物， 结构骨架完全不同于以往文献报道过的高活性恶性疟原虫 DHODH抑制剂 其中的一些化合物在细胞水平具有显著的抑制疟原虫细胞株的活性 和免疫活性， 具有良好的成药前景 针对该系列先导化合物， 本发明人设计合成了一 系列五元二氢杂环酮衍生物 结构通式如下：

R¹选自 H， C1-C10烷基 CIO以下不饱和烃基， 任选取代的芳基 硝基， 氨基 NR⁴R⁵， 卤素；

R²选自 H C1-C6烷基， C2-C6不饱和烃基 C1-C6烷基羰基， 任选取代的苯甲 酰基 羧基， 氨基羰基 C1-C6烷氧基羰基， C1-C6烷基氨基羰基 羟基， C1-C6烷 氧基 C3-C8环烷基氨基羰基， C3-C8环烷基 -C1-C6烷基氨基羰基 C3-C8环烷基 -C1-C6烷氧基羰基；

R³选自 H， C1-C6烷基 任选取代的 C2-C6不饱和烃基， C1-C6烷基羰基 任 选取代的苯甲酰基， 羧基 氨基羰基， C1-C6烷氧基羰基 C1-C6氨基羰基， 羟基 C1-C6烷氧基；

R⁴和 R⁵独立的选自 H， C1-C6烷基 -C(0)NHR⁶， C1-C6烷氧基羰基 卤素取 代的烷基， C2-C6不饱和烃基 任选取代的芳基， C1-C6烷基羰基 任选取代的苯甲 酰基， 任选取代的杂环基 任选取代的杂环基羰基， C1-C6烷氧基羰基；

R⁶选自任选取代的芳基和任選取代的杂环基

在优选实施例中， 所述化合物选自下式 II的化合物： 式中

R⁷选自任选取代的芳基， 任选取代的芳基羰基 任选取代的含氮雜环基羰基， 任选取代的杂环基 和任选取代的芳氧基， C 1-C3烷基羰基；

本文中 "烷基 "通常指碳链长度为 1-10个碳原子的饱和的支链和直链烷基， 優 选长 1-6个碳原子、 更优选长 1-4个或 1-3个碳原子的烷基 "环烷基"指环状烷基， 其成 环碳原子数通常为 3-8个 示例性的环烷基包括环丙基、 环丁基、 環戊基、 环庚基和 环己基等。

本文中 "不饱和烃基"包括链烯基和炔基。 "链烯基"指直链或支链含有 2-10 个碳原子、 其中至少是链中的两个碳原子の间含有一个双键的基团优选的烯基是含 有 2-4个碳原子的烯基。 典型的链烯基包括乙烯基、 1-丙烯基、 2-甲基 -1-丙烯基、 1- 丁烯基 和 2-丁烯基

本文所用 "炔基"是指直链或支链含有 2-10个碳原子， 其中至少是链中的两个碳 原子之间含有一个叁键的基团 优选的炔基是含有 2-4个碳原子的炔基。 典型的炔基 包括乙炔基、 1-丙炔基、 1-甲基 -2-丙炔基、 2-丙炔基、 1 -丁炔基和 2-丁炔基

本文中， "芳基"指含有 6到 14个碳原子的单环、 双环或三环芳族基团 包括苯 基、 萘基、 菲基、 蒽基、 茚基、 弗基、 四氢化萘基、 二氢化茚基等。 芳基可任选地被 1 -5个 （例如 1、 2、 3、 4或 5个） 选自以下的取代基取玳： 卤素、 C 1-C4醛基、 C 1-C6 的直链或支链烷基、 氰基、 硝基、 氨基、 羟基、 羟甲基、 卤素取代的烷基 （例如三氟 甲基） 、 卤素取代的烷氧基 （例如彡氟甲氧基） 、 羧基、 C1-C4烷氧基、 巯基、 C 1-C4 烷基巯基、 -SF₅、 吗啉基、 任选取代的芳基 （例如任选取代的苯基） 、 任选取代的芳 氧基 （例如任选取玳的苯氧基） 和任选取代的苄氧基。 例如 芳基可以被 1-3个选自 以下的基团取代： 氟、 氯、 溴、 C 1-C4烷基、 三氟甲基、 吗啉基、 甲氧基、 苯基、 甲 氧基取代的苯基、 苯氧基、 苄氧基、 被卤素取代的苄氧基、 乙氧基和硝基等。

本文所使用的术语 "杂环基"指单一或稠合的环结构 在性质仩可以是芳族或 非芳族的， 并且其优选含有 3-20个成环原子 更优选含有 5-14个环原子， 其中至少 1个并且优选最多可至 4个是选自 0、 S和 N的杂原子 本攵中， 杂环基的例子包括 呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 吡咯烷基、 咪唑基、 三唑基、 噻唑基、 四唑基、 噁唑基、 异噁唑基、 吡唑基、 吡啶基、 嘧啶基、 吡嗉基、 哒嗉基、 三嗉基、 喹啉基、 异喹啉基、 喹喔啉基、 苯并噻唑基、 苯并噁唑基、 苯并噻吩基、 苯并呋喃基、 吗啉基、 咔唑基、 二苯并噻吩、 香豆素基和 1,2-亚甲基二氧苯基 本文中， 杂环基可任选地被 1-3个本 文所述的取代基取代

本文所使用的术语 "杂原子 "包括 0、 S囷N。 当杂原子是 N时 此 N原子可 以进一步由例如氢或 C1-C10烷基的基团所取代。 当杂原子是 S时 此 S原子可以进 一步由例如 C1-C10烷基的基团所取代。

本文所使用的术语 "杂芳基" 或 "芳香杂环基"指如上所述具有芳族特性的那 些杂环基 包括但不限于呋喃基、 噻吩基、 吡咯基、 吡啶基、 噁唑基、 吡嗉基、 哒嗉 基、 嘧啶基等。

本文所使用的术语 "卤素" 包括氟、 氯、 溴和碘

除非另有说明， 本文所使用的术语 "任选取代的" 指其所修饰的基团鈳任选地 被 1-5个 （通常为 1、 2或 3个） 选自以下的取代基取代： C1-C4 烷基、 羧基、 卤素、 C1-C4 烷氧基、 氰基、 硝基、 氨基、 羟基、 醛基、 C1-C6酰基、 羟甲基、 鹵素取代的 C1-C4 烷基 （例如三氟甲基） 、 C1-C10硫代烷基 （例如五氟硫甲基） C1-C10硫代 烷氧基 （例如五氟硫甲氧基） ， 卤素取代的 C1-C4 烷氧基 （例如三氟甲氧基） 、 巯 基和 C1-C4 酰基

本文中， 酰胺基 （氨基羰基） 自身或作为其它基团的一部分 指 " C1-C6烷基 -CO-NH-"基团、 " C3-C8环烷基 -CO-NH-"或 " C3-C8环烷基 -C1-C6烷基 -CO-NH-" 。 示例性的酰胺基包括但不限于甲酰胺基、 乙酰胺基、 丙酰胺基、 丁酰胺基、 环丙酰胺 基、 环丙甲酰胺基等

本文中， 酰基自身或作为其它基团的一部分 鈳含有 1-6个碳原子， 优选 1-4个碳 原子 示例性的酰基包括但不限于甲酰基、 乙酰基等。

本发明优选的化合物包括那些 为 S和 0 X₂为 0的化合物。

本发奣优选的化合物包括那些 R³为 H的化合物

在某些实施方式中， 本发明的化合物不包括化合物 14一 21

本发明优选的化合物包括 R²为 C1-C6烷氧基羰基（例洳甲氧基羰基、乙氧基羰基， 环丙氧基羰基 环丙甲氧基羰基等） 、 C1-C6氨基羰基 （例如甲酰胺基， 乙酰胺基 丙酰胺基， 丁酰胺基 环丙酰胺基， 环丙甲酰胺基等） 的化合物

本发明优选的化合物包括 R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH-任选取代的萘基、 -NH- 任选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的㈣氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基的化 合物。 本发明优选的化合物中包括 R¹中任选取代的苯基或萘基上的取代基为卤素、 卤 素取代的 C 1-C4烷基、 C 1 -C4烷基、 C 1-C4烷氧基的化合物

在优选实施例中， 本发明包括 ₁为8和 0 X₂为 0， R³为 H R²为 C 1-C6烷氧基羰 基 （例如甲氧基羰基、 乙氧基羰基， 环丙氧基羰基 环丙甲氧基羰基等） 、 C 1 -C6氨 基羰基 （例如甲酰胺基， 乙酰胺基 丙酰胺基， 丁酰胺基 环丙酰胺基， 环丙甲酰胺 基等） R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH-任選取代的萘基、 -NH-任选取代的二氢化 茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基的化合物。 更优选地 R¹中任选取代的苯基或萘基上的取代基为卤素、 卤素取代的 C1 -C4烷基、 C 1 -C4烷基、 C 1 -C4烷氧基。

在更优选的实施例中 ₁为8和 0， X₂为 0 R³为 H， R²为 C1 -C6烷氧基羰基 （例 如甲氧基羰基、 乙氧基羰基等） R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH-任选取代的萘基、 -NH-任选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基； 苯基优选没有取代基， 戓者具有 1一 3个选自卤素、 三氟甲基、 甲基、 硝基和甲氧基的 取代基 优选的， 取代基位于 3、 4和 /或 5位 优选的， 所述化合物不包括化合物 14一 21

在其它优选的实施例中， ₁为8和 0 X₂为 0， R³为 H R²为 C2-C4烷氧基羰基（例 如乙氧基羰基，环丙氧基羰基环丙甲氧基羰基等）， R¹为 -NH-任选取代的苯基、 -NH- 任选取代的萘基、 -NH-任选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH- 任选取代的喹啉基； 苯基优选没有取代基 或者具有 2— 3个选自卤素和 C 1 -C4烷基的 取代基。 优选地 所述化合物不包括化合物 14一 21。

在其它优选实施例中 本发明的化合物包括 为^11-任选取代的萘基、 -NH-任 选取代的二氢化茚基、 -NH-任选取代的四氢化萘基或 -NH-任选取代的喹啉基的化合 物。

本发明优选下文表 1中所示的编号 1 -67的化合物 尤其优选抑制率在 50 %以上 的那些化匼物。 尤其是 本发明化合物包括化合物 1、 2、 4、 6、 7、 10、 22-25、 35、 38、 39、 44、 61禾 Π 62。 本发明的化合物可采用以下方法制备获得

丙酮 18h ' 氯仿，12h 上述制备鋶程中 R¹为最终产物中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义相同本领域技术人员可根据实际制备需要， 采用本领域常规獲得的各种起 始化合物为原料 制备本发明的化合物。 例如 可参考杜晓华等 （非硫光气法合成一 些难合成的苯基异硫氰酸酯 . [J]. 农药， 2004 43 (2)， 78-79)) 所述的方法合成本发 明式 Π化合物。

上述制备流程中 R¹为最终产物中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义 C1-C6

上述制备流程中 R¹为最终产物中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义相同 R³的定义与上文中 C1-C6烷氧基羰基相同。

上述制备流程中 R¹为最终产粅中苯基上的取代基， 其定义与上文的芳基取代 基的定义相同 本发明第二方面包括一种药物组合物， 该组合物含有治疗有效量的本发明式 I、 II的化合物或其药学上可接受的盐 以及药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明化合物的药学上可接受的盐的例子包括但不限于无机和囿机酸盐 例如 盐酸盐、 氢溴酸盐、 硫酸盐、 柠檬酸盐、 乳酸盐、 酒石酸盐、 马来酸盐、 富马酸盐、 扁桃酸盐和草酸盐； 以及与碱例如钠羥基、 三 （羟基甲基）胺基甲烷 （TRIS， 胺丁三 醇） 和 N-甲基葡糖胺形成的无机和有机碱盐 虽然每个人的需求各不相同， 本领域技术人员可确萣本发明药物组合物中每种 活性成分的最佳剂量 一般情况下， 本发明的化合物或其药学上可接受的盐 对哺乳 动物每天口服给药， 药量按照约 0.0025到 50毫克 /公斤体重但最好是每公斤口服给药 约 0.01到 10毫克。 例如 单位口服剂量可以包括约 0.01到 50毫克， 最好是约 0.1到 10毫 克的本发明化合物單位剂量可给予一次或多次， 每天为一片或多片 每片含有约 0.1 到 50毫克， 合宜地约 0.25到 10毫克的本发明化合物或其溶剂化物

本发明的药物组合粅可被配制成适合各种给药途径的制剂形式， 包括但不限于 被配制成用于肠外 皮下， 静脉 肌肉， 腹腔内 透皮， 口腔 鞘内， 颅内 鼻腔或 外用途径给药的形式， 用于治疗肿瘤和其他疾病给药量是有效地改善或消除一个或 多个病症的药量。对于特定疾病的治疗 有效量是足以改善或以某些方式减轻与疾病 有关的症状的药量。这样的药量可作为单一剂量施用 或者可依据有效的治疗方案给 药。 给药量也許可治愈疾病 但是给药通常是为了改善疾病的症状。 一般需要反复给 药来实现所需的症状改善 药的剂量将根据病人的年龄， 健康与体偅 并行治疗的种 类， 治疗的频率 以及所需治疗效益来决定。

本发明的药物制剂可以给予任何哺乳动物 只要他们能获得本发明化合物嘚治 疗效果。 在这些哺乳动物中最为重要的是人类

本发明的化合物或其药物组合可用于治疗与预防各种 DHODH介导的疾病， 尤其 与 DHODH的抑制相关嘚疾病 本文中， DHODH介导的疾病主要包括： 寄生虫病 包 括恶性疟疾、 间日疟、 卵形疟疾、 三日疟、 克氏锥虫病和登革热等； 由某类细胞快速 增殖引起的疾病， 如癌症； 炎症反应； 以及各种自身免疫疾病 DHODH介导的疾病 还包括由同种或异种器官移植引起的宿主排斥反应。

具体地講 DHODH介导的疾病包括但不限于克氏锥虫病、 恶性疟疾、 登革热、 间日疟、 卵形疟疾、 三日疟、 类风湿性关节炎、 结肠炎、 红斑狼疮 （包括系统性红斑 狼疮） 、 肾小球疾病 （包括多种继发性和原发性肾小球疾病） 、 抗器官移植物排异反 应、 黑色素瘤、 银屑病关节炎和银屑病等。

本发明的药物制剂可用已知的方式制造 例如， 由传统的混合 制粒， 制锭 溶解， 或冷冻干燥过程制造 制造口服制剂时， 可结合固體辅料和活性化合物 选择 性研磨混合物。 如果需要或必要时加入适量助剂后 加工颗粒混合物， 获得片剂或锭 剂芯

合适的辅料特别是填料， 例如糖类如乳糖或蔗糖 甘露醇或山梨醇； 纤维素制 剂或钙磷酸盐， 例如磷酸三钙或磷酸氢钙； 以及粘结剂 例如淀粉糊， 包括玉米淀粉 小麦淀粉， 大米淀粉 马铃薯淀粉， 明胶 黄芪胶， 甲基纤维素 羟丙基甲基纤维素， 羧甲基纤维素钠 或聚乙烯吡咯烷酮。 如果需要 可增加崩解剂， 比如上面提到的淀 粉 以及羧甲基淀粉， 交联聚乙烯吡咯烷酮 琼脂， 或褐藻酸或其盐 如海藻酸钠。 辅助剂特別是流动调节剂和润滑剂 例如， 硅石 滑石， 硬脂酸盐类 如镁硬脂酸钙， 硬脂酸或聚乙二醇如果需要，可以給锭剂核芯提供可以抵忼胃液的合适包衣为此， 可以应用浓缩糖类溶液 这个溶液可以含有阿拉伯树胶， 滑石 聚乙烯吡咯烷酮， 聚 乙二醇和 /或二氧化钛 漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。 为了制备耐胃液的 包衣 可使用适当的纤维素溶液， 例如醋酸纤维素邻苯二甲酸或羟丙基甲基纤维素邻 苯二甲酸 可向药片或锭剂核芯的包衣加入染料或色素。 例如 用于识别或为了表征 活性成分剂量的组合。

因此 本发明第三方面提供一种治疗或预防 DHODH介导的疾病的方法， 该方法 包括给予需要的对象以本发明的式 I或 Π化合物或药物组合物。

给药方法包括但不限于本领域周知的各种给药方法 可根据患者的实际情况加 以确定。 这些方法包括但不限于肠外 皮下， 静脉 肌肉， 腹腔内 透皮， 口腔 鞘 内， 顱内 鼻腔或外用途径给药。

本发明包括本发明式 I或 Π化合物在制备治疗或预防 DHODH介导的疾病用的药 物中的用途

本发明也包括本发明式 I或 Π化合物在制备治疗或预防疟原虫 DHODH介导的疾 病用的药物中的用途。

本发明还包括本发明式 I或 Π化合物在制备抑制疟原虫 DHODH活性用的药物中 的鼡途

在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。 这些实施例仅用于说明本发明 但不以任何方式限制本发明。 合成部分：

2-取代苯胺基 -4 ,5-②氢噻 -3-羧酸乙酯系列化合物合成通则: 合成方法： 将 3 mmol的取代苯胺溶于 3 mL的丙酮中 加入 9 mmol的三乙烯二 胺， 滴加 15 mL的二硫化碳 常温搅拌 24小时， 析出黃色固体 抽滤烘干得中间体， 将中间体直接加入烧瓶中 加入 10 mL的三氯甲烷,， 悬浮状滴加溶解有 1 mmol三 光气的 10 mL三氯甲烷溶液， 反应过夜 抽濾得母液， 直接旋干柱层析得取代苯基异 硫氰酸酯,收率 45%左右

乙基 2-取代苯胺基 -4-羰基 -4,5-二氢噻吩 -3-羧基系列化合物合成通则：

合成方法： 现制 0.55 mmol的甲醇钠固体和干燥的 DME 10mL， 取 0.55 mmol 的 4-氯乙酰乙酸乙酯 常温搅拌 1小时， 另取 0.5 mmol的取代苯异硫氰酸酯溶于 10 mL的 DME 氩气保护下缓慢滴加， 反应 6小时结束 选幹 DME， 用稀盐酸中和 饱和食盐水洗涤乙酸乙酯萃取， 有机层浓缩干燥柱层析得产品 上述流程中， R为最 终产物中苯基上的取代基 其定义與前文的芳基取代基的定义相同。

合成方法： 冰浴下 取 2- ( 4-三氟甲基苯胺基） -4-羰基 -4,5-二氢噻吩 -3-羧酸乙 酯 3 mmol， 溶于甲醇-水 =5 : 1 (总 18 mL) 的混合溶液中 加入 5 eq的┅水合氢氧 化锂， 搅拌半小时后撤去冰浴 加热至 60度反应过夜， 旋干甲醇 加少许水和 10% 的稀盐酸调节 pH =2,析出大量米白色固体， 抽滤干燥得产品

合成方法： 将干燥的酸 （l mmol) ， 醇 （l mmol) 三苯基膦 （1.1 mmol) 力口 入至 5 mL的甲苯中， 氩气保护下滴加偶氮二甲酸二乙酯 （1.2 mmol) 反应半小时 后升温至 50度， 过夜反应 饱和食盐水洗涤， 柱层析 （PE:EA=3 : 1 v/v ) 提纯， 得

合成方法： 在 50 mL烧瓶中加入 3 mmol的 60%钠氢约 240 mg和 1.8 mL的无水 THF, 冰水浴下滴加 1.8 mL含有 6mmol的丙二酸二乙酯的无水 THF溶液 10分钟 后滴加 3 mL含有 3 mmol的氯乙酰氯溶液， 维持冰浴一小时 40-45摄氏度反应 1小 时， 常温下滴加取代芳香胺 常温过夜后 TLC显示原料少量存在， 回流 2小時 TLC 显示原料仍存 停止反应， 用稀 HC1调节 pH至 7 乙酸乙酯萃取， 食盐水洗涤 2次 有机层浓缩， 干燥 柱层析 （PE:EA=2_: 1， v/v) 柱层析得纯品， 白色粉末 收率 35-40%。 目标化合物谱图数据

2-取代苯胺基 -4-羰基 -4,5-二氢噻吩 -3-羧酸乙酯系列化合物

2—(4-氯 -3-三氟甲基苯胺基) 酸乙酯 （化合物 9)

DHODH活性测试部分

抑制剂筛选使鼡 DCIP比色法 DCIP在反应中被还原， 是 DHO (二氢乳清酸） 最终的电子受体 因此根据 DCIP在 600nm处吸光度的减弱速率可以判断底物 DHO 的水解程度， 光吸收值减弱嘚速率越快 表明酶的活性越高， 即化合物对其抑制作用 越小 （以同体积的 DMSO为阴性对照 等量的 A77 1726为阳性对照） ， 具体见文献 ( The

本发明化合物對两种恶性疟原虫细胞株的体外活性的抑制效果： 氯喹购于 Sigma公司 SYBR Green购于 Invitrogen公司， 氯喹敏感的恶性疟原 虫 3D7细胞株和氯喹抗性的恶性疟原虫 Dd2细胞株用于体外测试抗疟活性 以 0.5% Albumax II ( Invitrogen公司）代替人血清，其他按 Trager and Jensen的培养方法培养

实验中使用 SYBR Green为荧光探针， 通过测定荧光数据的方法来测定抗疟活 性 培养过程如下， 起始感染率为 1% 2%血压积， 与一系列的药物存在或不存在的 条件下培养 终体积为 100 L。 每种化合物经倍比稀释 浓度范圍为 0.15625 μ Μ到 20 μ Μ。 以 0.2% DMSO作为阴性对照， 不同浓度的氯喹作为阳性对照 以 100 L， 1) 培养皿在避光环境中室温放置 1小 时，将所有样品转移到黑色酶標板中（ Corning 3925 )通过 Biotek公司的 Synergy MX 多功能微孔板检测仪进行荧光检测， 在 485/520 nm下读数 本实验重复两次。

数据分析是根据 Michael等报道的方法进行改进获得简述如下， 阴性对照处理 组获得的荧光数据减去未感染红细胞组所产生的背景荧光数据代表本次实验中正常 培养的恶性疟原虫中的 DNA最大量， 记为阴性对照孔的荧光数据 各测试组及阳性 对照组的荧光数据均如此校正。 不同浓度下抑制率的计算由下式所得： 抑制率 （％) 1— (测试孔中平均荧光计数 /阴性对照孔中平均荧光计数） 〕 X

实施例 1和 2的结果如下表所示：

噻吩酮衍生物的抑制率和活性化合物的 IC