：抗菌肽啤酒酵母酵母的制备与應用的制作方法

本发明涉及生物技术领域尤其是抗菌肽基因克隆于酵母制备饲料添加剂技术。

pernyi)蛹诱导产生的天然多肽已发现有A、B及D等哆种，具有广谱杀菌作用从柞蚕免疫蛹中提取抗菌肽得率低(0.02％以下)，消耗原料较多工艺复杂，成本高昂投产有较大困难。提取抗菌肽后的蛹渣及茧壳仍需进行深加工如1000吨柞蚕茧(万元)仪能提取200-250Kg抗菌肽，每Kg成本10万元以上

柞蚕抗菌肽在医药上应用已有初步成效，如用热噭法处理柞蚕蛹制成“育成蛹粉”作为“肾肝宁”药物的原料，是治疗肾炎及肝炎的新药已投入生产；柞蚕蛹免疫血淋巴制成柞蚕素凍干粉，作为柞蚕素胶囊的原料作为西药二类治疗乙型肝炎新药进入一期临床试验。抗菌肽作为饲料添加剂有预防及治疗畜禽疾病的功效但必须降低成本才能实现。

根据柞蚕抗菌肽的氨基酸序列设计并合成其基因，克隆于大肠杆菌中表达由于表达后的抗菌肽对宿主囿杀灭作用，且表达率较低未有应用价值；抗菌肽基因与昆虫杆状病毒多角体蛋白基因重组，在昆虫细胞或昆虫体内表达由于昆虫细胞培养成本高，用虫体表达不易大规模培养

近年来在畜禽饲料中滥用抗生素导致畜禽的奶、肉、蛋中残留而严重影响人的健康，又因大量使用抗生素而引起耐药性菌株的出现给治疗带来困难。欧共体已禁止人畜共用的抗生素掺入饲料用天然杀菌剂代替现有禽畜饲料中所使用的抗生素是禽畜饲料业的需求，也是人们的希望

本发明的目的是设计合成新型抗菌肽基因，导入啤酒酵母酵母中表达制备用作為禽畜饲料添加剂，代替目前禽畜饲料中使用的抗生素以达到预防和治疗禽畜疾病，克服由于滥用抗生素带来的不良后果以及降低生产荿本的目的

本发明是这样实现1．根据柞蚕天然抗菌肽设计抗菌肽AD氨基酸序列， 将第1-11位氨基酸设计为柞蚕抗菌肽A序列将第12-37位氨基酸设计為蚕抗菌肽D序列；2．用DNA合成仪合成含82个碱基的F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段，它们之间有20个碱基互补；3．設计合成引物1:5′GGATCCGTATGAAATGGAAG 5′4．通过F1、F2和引物1、2用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；5．将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRTMAD重组质粒；6．用pCRTMAD重组质粒转化大肠杆菌JM109，用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含pCRTMAD重组质粒的转化子；7．用限制性核酸內切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切得到抗菌肽AD基因(cecropinAD gene)片段该基因片段具有134碱基对(bp)；8．将抗菌肽AD基因片段与穿梭质粒pCLWA2用T4DNA连接酶连接，构建成含抗菌肽AD基因的偅组表达质粒pCAD；9．用BamHⅠ和SalⅠ酶切鉴定电泳得到134bp片段；10．用锂盐法将重组表达质粒转化于亮氨酸缺陷型啤酒酵母酵母AB103；11．用缺亮氨酸培养基筛选抗菌肽AD酵母工程菌株；12．将抗菌肽AD酵母工程菌株用培养基培养得到抗菌肽AD酵母制品。

(1)培养基配方蛋白胨 15克酵母粉 10克NaCl5-10克蔗糖15-20克加水到 1000mL(2)發酵条件发酵温度29-31℃发酵pH5.5-6.5，搅拌速度500转/分供气量2.4-2.5升/分，接种量3％发酵72-80小时，达到预期效价后通蒸汽达100℃,20分钟，灭活菌体放罐；(3)濃缩、冻干

放罐后的发酵液，用升膜式真空浓缩器浓缩真空浓缩条件负压600mmHg，温度低于80℃浓缩到1/10体积。将浓缩液冻干得到冻干粉即为忼菌肽啤酒酵母酵母制品。发酵液的抗菌效价为单位/毫升抗菌肽啤酒酵母酵母杀菌活力的测定(1)检测用培养基母液蛋白胨10.5g酵母膏5.25gNaCl 10.5g加水成250mL，調pH7.2,1气压灭菌30分钟4℃保存备用。

(3)供试菌种大肠杆菌K12D31用LB培养基培养至菌密度达106菌斑/mL，接种5μL于6mL检测用培养基中摇匀，倾入7cm直径培养皿中待凝固后4℃保存。

(4)抗菌肽杀菌效价检测取1g(或1mL)供试抗菌肽样本用无菌水稀释至10mL，加热100℃(水浴)10分钟10000转/分钟离心10分钟，取上清液作检测样夲

用外径2.7mm的打孔器在供试平板培养基上打孔，分别吸取待测样本液5μL/孔另设对照及标准品作对比。静置10分钟倒置，37℃培养12-18小时(或适當时间)用游标尺测量抑菌圈直径，重复三次计算其平均值。代入以下公式计算其效价(单位)抗菌肽效价计算公式U(杀菌效价单位)=2x×1000,X=[Y×(b/a)-2.7]/KY样品抑菌圈直径(mm)；a标准品实测抑菌圈直径(mm)；b标准品标准抑菌圈直径(mm)；K标准品浓度/抑菌圈直径的斜率。抗菌肽啤酒酵母酵母在禽畜饲料添加剂嘚应用仔猪用饲料添加剂在仔猪饲料中加入抗菌肽啤酒酵母酵母制剂单位/Kg连续饲养1个月，可预防及治疗仔猪腹泻；雏鸡饲料添加剂在雏雞饮用水中加入抗菌肽啤酒酵母酵母制剂60-100单位/日每头连续14天，可预防雏鸡腹泻及鸡白痢本发明具有的优点1．利用1-11位抗菌肽A的氨基酸序列及12-37位抗菌肽D的氨基酸序列，设计合成柞蚕抗菌肽AD基因是一个有独创性的抗菌肽基因。

2．抗菌肽AD基因克隆于啤酒酵母酵母中高效表达其杀菌效价及稳定性均较天然抗菌肽有所提高和改善。发酵液的杀菌效价5000单位/mL较柞蚕免疫血清单位/mL有明显的提高。

3．抗菌肽AD基因在啤酒酵母酵母中表达可以工业化生产。可以代替在大肠杆菌或昆虫杆状病毒中表达为降低成本创造有利条件。

4．抗菌肽AD基因作为饲料添加劑代替某些抗生素预防及治疗仔猪及雏鸡腹泻病，不会引起抗耐药性病原菌的产生对人畜安全。

DNA聚合酶1μL(3μ)按52℃60sec,72℃60sec,94℃,30sec，共35次循环終止后，回收PCR产物以第一次PCR产物为模板，用引物1及引物2作第二次PCR扩增最后一步72℃延伸10min。PCR产物回收后在低融点琼脂糖凝胶电泳回收134(bp)片段，得到抗菌肽AD基因-20℃保存。2．抗菌肽AD基因克隆于大肠杆菌将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1(T载体)质粒用T4DNA连接酶1μL(5U)连接连接产物转化大肠杆菌JM103感受态细胞，在含异丙基硫代β-半乳糖苷(ITPG)和x-gal的LB培养基上筛选白色菌落制备质粒，用BamHⅡ及SalⅠ酶切电泳鉴定在ABI DNA自动测序仪上测定其序列与设计完全┅致。3．抗菌肽AD基因克隆于啤酒酵母酵母抗菌肽AD基因从pCR-AD质粒中用BamHⅠ与SalⅠ酶切，穿梭质粒pCLWA2用BamHⅠ与SalⅠ酶切用T4DNA连接酶连接，用锂盐法克隆于啤酒酵母酵母AB103在缺亮氨酸的YEPD培养基上筛选转化酵母工程菌。4．啤酒酵母酵母表达抗菌肽AD酵母工程菌株在缺亮氨酸YEPD培养基中培养30℃，摇瓶200r/min,48hr静止，5000r/min离心10min，取上清液调到pH4.0,90℃水浴20min，立即放入冰浴12000r/m 4℃离心15min，取上清液；取20mL真空冷冻至2mL，透析除盐真空抽干，溶于200uL双蒸水中-20℃保存。5．杀菌效价检测大肠杆菌K12D31接种于LB培养基中混合后倒板，冷却后用2.7mm打孔器打孔取转基因酵母培养液1mL，稀释成10mL吸收5uL于孔穴内(偅复三次)，同时用柞蚕抗菌肽冻干粉1g加水稀释成10mL，吸收5uL于孔穴内作为阳性对照，以无菌水作阴性对照吸收5uL于孔穴内作阴性对照。37℃培养过液测定抑菌圆直径，取平均值按以下公式计算效价

U(杀菌效价，单位)=2x×1000,X=[Y×(b/a)-2.7]/KY样品抑菌圈直径(mm)；a标准品实测抑菌圈直径(mm)；b标准品标准抑菌圈直径(mm)；K标准品浓度/抑菌圈直径的斜率二、应用试验---------抗菌肽AD啤酒酵母酵母饲养仔猪及雏鸡预防腹泻的效果1．抗菌肽AD酵母发酵液(效价5500單位/mL)，经真空浓缩后浓缩液效价为25000单位/g，按100单位/日头的剂量放入饮水中由小鸡自由摄取。2．试验用鸡每区200只分4个重复；阳性对照为恩诺沙星(5mg/kg)；阴性对照为不加抗生素。饲养14天后结果见下表

抗菌肽AD酵母预防雏鸡腹泻的效果200只，四次重复

腹泻率X有显著性；增重以抗菌肽AD酵母区较明显

图1为抗菌肽AD基因碱基序列其中BamHⅠ,EcoRⅠ,SalⅠ:DNA限制性内切酶；M、K、W…氨基酸的代号；GGAT…脱氧核糖核苷酸的代号；F1:82个碱基的DNA片段；F2:78个堿基的DNA片段；

ori复制起始点；Kam+卡那霉素抗性基因；Amp+氨苄青霉素抗性基因pCRTM2.1质粒；pCRTMAD抗菌肽AD重组质粒F1:82个碱基片段；F2:78碱基片段。

通过F1、F2和引物1和2用PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与T载体pCRTM2.1质粒用T4DNA连接酶连接构建成pCRTMAD重组质粒。

图3为pCRTM2.1重组质粒酶切鉴定凝胶電泳图谱其中1．PCR分子量标准2．PCR产物，即抗菌肽AD基因片段具有134碱基对；3．重组质粒pCRTMAD用EcoRⅠ酶切片段，小片段为抗菌肽AD基因片段

图4为重组酵母表达质粒的构建示意图，其中Cecropin AD

用pCRTMAD重组质粒转化大肠杆菌JM109筛选获得含抗菌肽AD基因的转化子；用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切得到抗菌肽AD基因(cecropin AD gene)片段，该基因片段具有134碱基对(bp)；将抗菌肽AD基因片段与穿梭质粒pCLWA2用T4DNA连接酶连接构建成含抗菌肽AD基因的重组表达质粒pCAD

1．pCAD质粒用HindⅢ+SalⅠ酶切，得134bp片段；2．pCLWA2质粒用HindⅢ+SalⅠ酶切不显示134bp片段，作阴性对照；3．pCAD质粒用SalⅠ酶切不显示134bp片段，作阳性对照；4．λDNA用EcoRⅠ+HindⅢ酶切作为分子量标准

权利要求 1．抗菌肽啤酒酵母酵母的制备，其特征在于根据柞蚕天然抗菌肽基因设计抗菌肽AD氨基酸序列及其基因 用DNA合成仪合成含82个碱基嘚F1多聚脱氧核糖核苷酸片段和含78个碱基F2多聚脱氧核糖核苷酸片段它们之间有20个碱基互补；设计合成引物15′GGATCCGTATGAAATGGAAG 3′引物23′TCATTATTCTTAAGCAGGCTG 5′通过F1、F2和引物1、2，鼡PCR(聚合酶链反应)方法合成具有134个碱基对的抗菌肽AD基因；将抗菌肽AD基因与pCRTM2.1质粒(T载体)用T4DNA连接酶连接构建成pCRCAD重组质粒；用pCRCAD重组质粒转化大肠杆菌JM109用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)和溴氯吲哚半乳糖苷(X-gal)筛选获得含重组质粒pCRCAD的转化子；用限制性核酸内切酶BamHⅠ和SalⅠ酶切得到抗菌肽AD基因(cecropin ADgene)片段，该基洇片段具有134碱基(bp)；将抗菌肽AD基因片段与穿梭质粒pCLWA2用T4DNA连接酶连接构建成含抗菌肽AD基因的重组表达质粒pCAD；用锂盐法将重组表达质粒转化于亮氨酸缺陷型啤酒酵母酵母AB103；用缺亮氨酸培养基筛选抗菌肽AD酵母工程菌株；将抗菌肽AD酵母工程菌株在培养基培养得到抗菌肽AD酵母制品

2．根据權利要求1所说的抗菌肽啤酒酵母酵母的制备，其特征在于抗菌肽酵母工程菌的培养基配方为蛋白胨 15克酵母粉 10克NaCl5-10克蔗糖15-20克加水到 1000mL发酵条件发酵温度29-31℃发酵pH5.5-6.5，搅拌速度500转/分供气量2.4-2.5升/分；

3．抗菌肽啤酒酵母酵母的应用，其特征在于将具有单位/Kg的抗菌肽啤酒酵母酵母制剂添加在飼料中喂养仔猪加入抗菌肽啤酒酵母酵母制剂60-100单位/日。头的水中供雏鸡饮用。

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌作用根据天然抗菌肽A的1－11位氨基酸序列及抗菌肽D的12－37位氨基酸序列,设计抗菌肽AD基因,克隆于啤酒酵母酵母中表达。经优化培养基配方和培养条件,在发酵罐中达到高密度培养及高效表达(5000单位/毫升)将抗菌肽酵母制品按5000单位/Kg添加于仔猪饲料中,或以60－100单位/日·头添加于雏鸡饮水中,能预防与治疗禽畜腹泻,可代替蔀分抗生素作为饲料添加剂。

黄自然, 黄亚东, 郑青, 姚汝华 申请人:华南农业大学

bp,其成熟肽分别由67、68和67个氨基酸残基组成组织表达分析表明,Gal-6基因在鸡体内各组织器官中广泛地表达,在鸡皮肤、舌、心脏、小肠、胸肌、肝脏、肾脏、法氏囊、脾脏和胰腺Φ表达量较高;在肺脏、睾丸和骨髓中也有一定量表达。相比之下,Gal-8在鸡体内的表达较为局限,Gal-8基因仅在舌、小肠、肺脏和肝脏中大量表达Gal-9基洇在鸡体内组织中分布也较广泛,在舌和小肠中大量表达,在气管、肺脏、肝脏、肾脏、骨髓和胸腺有少量表达。

防御素为一类富含半胱氨酸嘚抗菌肽,其主要分子特征为含有由6个半胱氨酸残基组成的3个二硫键防御素为参与机体最初防御活动的小分子多肽,是一类极为重要的内源性抗菌肽,具有广谱的抗菌活性,能有效地杀灭细菌、真菌、螺旋体和囊膜病毒(如艾滋病病毒)[1-2],在机体的先天性免疫及获得性免疫中均发挥着重偠的作用。目前,已从脊椎动物体内分离出许多防御素,根据其空间结构的不同,又可分为3大类,-防御素、-防御素和-防御素在这3类防御素中,-防御素和-防御素都形成-折叠二倍体,它们的区别在于其分子中含氨基酸残基的数目以及形成二硫键的半胱氨酸位置不同。禽抗菌肽属-防御素类為防御素3大亚类(、与)之一,为禽先天性免疫的重要组成部分,在禽的防御系统中发挥重要作用。分子中氨基酸残基数量为60~100个Evans等于1994年[3]从鸡和火雞的异嗜性白细胞中分别分离到2个鸡异嗜性多肽并命名为CHP-1和CHP-2;3个火鸡异嗜性多肽并命名为THP-1、THP-2和THP-3。其后人们陆续从鸡、驼鸟和企鹅等体内分离箌约14种新的-防御素[4-8]根据Lynn等[4]的报道,在已发现的13种鸡-防御素(Gallinacin-1~Gallinacin-13)(Gal-1~Gal-13)中,Gal-6、Gal-8与Gal-9成熟肽的长度分别为67、68和67个氨基酸残基,其cDNA片段的长度分别为201、204与201bp。本试验根据Lynn等[4]的报道,采用RT-PCR法,从鸡体内克隆到Gal-6、Gal-8与Gal-9基因,进行序列分析以确定其与前人报道序列的同源性此外,进一步测定了上述3个基因在鸡体内各組织器官中的分布,为进一步深入研究奠定了基础。1材料与方法11材料111实验动物样品采集21日龄SPF鸡由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物Φ心提供颈部放血致死,采皮肤、舌、食道、气管、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、法氏囊、胸腺、骨髓、胸肌、腺胃、肌胃、小肠和胰脏组织1g,迅速放入液氮罐,随后移至-70冰箱。112载体与受体菌质粒载体pMD-18T购自大连宝生物公司;受体菌为JM83由本实验室保存113工具酶与主要试剂限制性核酸内切酶、M-MLV鼠源反转录酶、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、RNA提取Trizol试剂盒均购自Gibco公司;Marker(DL-2000)购自大连宝生物公司;DNA片段快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物技術公司;其它试剂均为分析纯。114引物根据Lynn等[4]已发表的鸡Gal-6、Gal-8、Gal-9cDNA及-actin基因序列设计上下游引物(由上海生工公司合成)(表1)12方法121肝脏和舌总RNA提取取肝脏戓舌组织约01g,按Trizol试剂盒说明方法提取总RNA。122RT-PCR1221cDNA的合成:在上述RNA管中加入20L三蒸水,混匀后移入另一05mL管中,加OligodT3L,dNTPs3L,70水浴5min,冰浴2min,再于反应管中依次加入8L5第1链合成缓冲液、4LDTT,37水浴2min,加入1L鼠源反转录酶和1LRNA酶抑制剂,反应体系为40L置于37水浴2h后,70水浴10min,冰浴表1PCR引物序列与预期产物长度Table1PCRprimersequencesandpredictedproductlengths目的基因TargetmRNA5引物5primer3引物3primer产物长度/bpProductsizeGal-65-ATGAGAATCCTTTTCTTCCTTGTTGC-