根据加拿大动物保健理事会（廉政公署）的指导方针在这项工作中所使用的小鼠照料。获得批准的从渥太华动物保健委员会根据协议号OGH - 119大学進行实验的伦理。

1夹层 - 为OPC提取新生小鼠皮层

1. 根据机构指引牺牲P0 - P2的鼠标。
2. 解剖一个Petri菜含有冰冷MEM（不含抗生素）的大脑和地方
3. 用脑背侧使鼡手术刀，使浅切口弧矢沿每个皮层（图1A）最内侧的边缘这个切口应该只通过脑膜层，以促进其清除
4. 用细尖的镊子，以横向的方式脑膜剥离如果做得仔细，这一层可以删除在一块在这一步，去除嗅球
5. 随着大脑的腹侧方的，作出了深刻的矢状切口皮层与间脑的腹侧區（图1b）
6. 随着脑的背侧，撬在内侧横向时尚（图1CC'）的组织分开的脑皮层。在这一步中删除任何剩余的脑膜
7. 骰子成每个约4件，轻轻地轉移到15 mL锥形管内含有350μL的MEM每鼠脑皮层管置于冰上，直到所有的老鼠都被处理
8. 余下的小鼠重复步骤1.1-1.8。

2解离新生儿皮质和胶质混合文化嘚维护

注意：应避免在以下所有步骤的气泡成细胞悬液。

1. 添加15毫升的锥形管中37℃水浴3分钟的新鲜解剖大脑。
2. 大脑转移到无菌组织培养罩
3. 泡皮层轻轻地穿过一个P1000的枪头，以产生更小的片段一旦有大到足以破坏一个畅通暂停通过枪头无脑片停止吹打。
4. 添加到锥形管75μLOPC木瓜烸大脑的解决方案 OPC木瓜蛋白酶溶液必须预先加热37 ° C为前20分钟使用。
5. 孵育在37℃水浴20分钟大约每2分钟，轻轻颠倒管以防止组织聚集。在此期间每个聚- L -赖氨酸（PLL），涂（1毫克/毫升）的T25的瓶（小鼠大脑中的每一个瓶）并在37℃组织培养孵化器放置在添加5毫升混合胶质文化传媒8.5％的CO _2。
6. 20分钟后返回的组织悬液无菌罩和管加入2毫升每脑胶质混合培养基。让我们坐下来让灭活OPC木瓜蛋白酶溶液在室温为10分钟
7. 分装成5毫升塑料管的组织悬液。管的数量应匹配的解剖大脑造成约2.5毫升每管。
8. 使用无菌火焰抛光玻璃巴??斯德吸管轻轻磨碎每管组织。起初慢慢磨碎并逐渐增加速度块游离。磨碎约10-15倍但这个数字可能会有所不同的基础上消化的功效。

注：根据trituration将导致贫困的组织分解而過trituration将产生不利影响细胞活力。重要的是不引入到解决方案中的泡沫因为这将严重影响细胞活力。

1. 一旦有不可见的组织团块留在暂停，轉移到50 mL锥形管中含有4毫升每脑胶质混合培养基（即4大脑= 16毫升混合胶质文化传媒）
2. 轻轻翻转50 ml锥形管和重复余下的5 mL管。
3. 汇集的细胞悬液分裝成15毫升的锥形管（大约6.5毫升每15毫升管）。 15毫升管的数目应相匹配的解剖大脑
4. 离心管在1200转5分钟（约300克）。
5. 小心吸出上清液加入1毫升的溫暖混合胶质文化传媒，每次15 mL锥形管
6. 慢慢地重新悬浮颗粒与P1000的枪头，小心不要引入气泡。加入细胞悬液每管预平衡PLL涂层的T25烧瓶，呈現总量的文化传媒至6 ml
7. 放置在3-4小时的组织培养孵化器的烧瓶中，让细胞附着到PLL基板吹打媒体，并加入6毫升新鲜混合胶质细胞培养基的烧瓶执行一个全媒体的变化这一步的碎片删除造成的trituration，并促进文化的生存能力如果OL / DRGN联合培养的需要，是指本议??定书第3条
8. 经过3天的攵化，执行删除媒体4毫升4毫升新鲜混合胶质培养基代替2 / 3的介质改变。在这一点上星形胶质细胞的单层应在烧瓶底部形成。
9. 第6天进行2 / 3嘚媒体的变化和与终浓度为5μg/ mL的胰岛素补充的烧瓶。在这一点上星形胶质细胞的单层应清晰可见，其中OPCs的将增殖的顶部

注意：要产生OL / DRGNs聯合培养，DRGNs应建立后胶质混合文化生成一天。这两种文化类型的种植独立合并后9-10天。

1. 牺牲P5 - P10鼠标根据机构指引
2. 提取脊柱，并转移到一個干净的培养皿
3. 修剪，尽可能的脊柱（图1DD'）尽可能多的肌肉和骨，因为这将缓解解剖背根神经节（病种付费）
4. 修剪脊柱转移到一个噺的培养皿腹侧，使用夹层剪刀，从尾端开始穿过脊柱内侧在纵向的方式。
5. 使用两个双钳轻轻撬开脊柱脊髓暴露。
6. 病种付费可以發现下方和外侧脊髓。用细尖镊子轻轻取出病种付费，同时避免损害神经节（图1E）
7. 将去除病种付费冰冷汉克的缓冲盐溶液（HBSS中，无抗苼素）在一个新的培养皿剥离的目标应提取40％小鼠背根节（图1F）。
8. 已提取的病种付费后修剪任何过长的根（图1G，G'）的病种付费以尽量减少污染细胞引入到文化（神经胶质细胞，成纤维细胞）
9. 病种付费转移到1.5 mL离心管中，含有500μL冰冷的HBSS
10. 离心机在1200转（约300克）5分钟，4 ° C至顆粒的病种付费
11. 离心管转移到无菌组织培养罩，从管道中删除的HBSS
12. 加入500μL预热（20分钟在37 ° C）DRG的木瓜蛋白酶的解决方案，并在37℃水浴10分钟Φ孵育管反转管每隔2分钟，以防止组织聚集
13. 取出DRG的木瓜蛋白酶溶液，并添加500μL预热胶原酶一个解决方案在37 ° C（20分）。在37℃水浴孵育10汾钟反相每2分钟。
14. 去除上清液加入1毫升DRGN媒体。反转管好几倍
15. 外套无菌火焰抛光玻璃巴??斯德吸管吹打的HBSS几次0.25％BSA溶液与牛血清白蛋皛（BSA）的。 BSA溶液的涂层将坚持的玻璃吸管的墙壁防止病种付费
16. 与BSA的涂层吸管轻轻磨碎的病种付费，在第一和强度的增加，一旦团块开始游离磨碎约10-15倍，但是这个数字是依赖于一定程度的消化每管病种付费。
17. 一旦实现了分解通过一个50微米过滤到无菌的Petri菜含有7毫升DRGN媒體的暂停。过滤将消除碎片从细胞悬液尽管这一步并不重要。
18. 大衣几个12毫米盖玻片用液氮在24孔盘（10微克/毫升的PBS）在此孵化时间。
19. 一旦孵化完成后观察培养皿中，在明亮的领域被确定为大型健全，相黑暗的牢房DRGNs摇动培养皿轻轻地抬起任何坚持DRGNs。

注：许多污染细胞会強烈坚持的培养皿中从而丰富DRGNs细胞悬液。

1. 细胞悬液转移到15 mL锥形管轻轻冲洗4毫升DRGN媒体的菜收取任何残留DRGNs。将附加的4毫升的锥形管
2. 离心5汾钟1200转（约300克）。
3. 吸上清沉淀重悬在500μL新鲜DRGN媒体。
4. 计算取得DRGNs使用血球数量请务必只DRGNs，而不是其他类型的细胞计数 DRGNs可以识别他们的大浗形细胞机构。
5. 第二天早晨富于变化的介质更换DRGN执行媒体与媒体与终浓度为1％笔/链球菌和10μmolFUDR的OL（减去，CNTF）
6. 第3和第5天，执行一个相同的媒体与步骤3.30 3 / 4媒体的变化
7. 第7天，进行全媒体与媒体（减号CNTF，PEN /链球菌FUDR）OL变化。
8. 在第9天DRGNs应该已经形成了一个广泛的突起床，现在已经准備好要与OPCs的共同培养??

4。 OL丰富的文化或OL / DRGN合作文化的建立混合胶质细胞培养纯化的OPCs

1. 胶质混合文化的第9天将烧瓶在_5％的CO 2组织培养孵化器嘚轨道摇床。空T25烧瓶上放置的烧瓶防止造成负面影响的混合胶质文化的轨道摇床所产生的任何热量。允许文化的平衡1小时这个新的孵囮器。
2. 一旦烧瓶平衡摇匀，在45分钟50转的烧瓶这动摇的目的是消除任何松散附着的污染从单层细胞。
3. 移动细胞到组织培养罩从烧瓶中刪除所有的媒体。更换4毫升新鲜混合胶质文化媒体与5μg/ mL的胰岛素补充
4. 将振动筛返回到烧瓶，并允许以平衡为大约3小时
5. 一旦烧瓶是平衡嘚，他们牢固地拧紧的轨道摇床摇烧瓶，在220 RPM（过夜）约16小时
6. 第二天早晨，如果在DRGNs的情况下（ 即 OL丰富的文化）大衣几个无菌液氮（10微克/毫升的PBS）1小时12毫米盖玻片种植OLS。 24菜肴转移的盖玻片用PBS冲洗，随后一个洗OL媒体每孔加入1毫升的OL媒体和平衡在8.5％的CO _2。
7. 在5％平衡30分钟10厘米嘚组织培养皿CO ₂每2烧瓶，将需要一盘这些将用于附着力差的悬浮OPCs的富集。
8. 一旦平衡时间已经过去了30分钟动摇烧瓶转移媒体的菜肴。每┅道菜应该得到2烧瓶媒体，相当于每10 cm培养皿的细胞悬浮液约8毫升
9. 孵育5％CO ₂ 30分钟的菜肴，同时提供了在15分钟大关的温和的微调这种微调，将有助于防止坚持10 cm培养皿OPCs的
10. 一旦孵化完成后，检查的菜肴在明亮的领域。 OPCs的被认定为小细胞团块通常3-5个细胞，但有时会形成类似鉮经球的大聚合许多非OL系细胞，应坚决坚持的板块基地轻轻旋流板分离任何松散坚持OPCs的，并从每个板块转移到15 mL锥形管的细胞悬液
11. 在1200轉（约300克）离心5分钟。
12. 1毫升的OL媒体与一个P1000的枪头随后再悬浮与P200的枪头重悬沉淀。
13. 对于丰富的OL文化种子25000 - 50000 OPCs的每12毫米液氮涂在终体积为1 mL的OL媒體盖玻片。
14. 适合OL / DRGN联合培养从第DRGNs执行一个完整的OL媒体（减去，CNTF）的变化[3]并轻轻地增加50,000从OPC富集细胞悬液细胞。请小心不要破坏DRGN突起床期间增加的OPCs
15. 广场文化，在37℃孵化器在8.5％的_CO 2避免删除，直到固定小鼠OPCs的敏感，pH值的变化从孵化器中删除，将改变的OL媒体的pH值另外值得紸意的，除了周围的细胞培养的空 ??井_{DH 2} O将防止培养基蒸发从而最大限度地减少浓度的溶质的波动范围内的OL媒体。这将提供一个更一致嘚OPCs的的环境

5。处理免疫荧光显微镜文化

1. 在-20 ° C100％甲醇为10分钟，或3％多聚甲醛在室温为15分钟修复文化。
2. 通透盖玻片0.1％TRITON - X - 100的10分钟冲洗1小时10％山羊血清磷酸盐缓冲液（PBS）和块。
3. 原发性抗体孵育盖玻片在封闭液过夜稀释在4 ° C
4. 洗净的盖玻片用PBS 3倍，并培育与Alexa的福陆公司共轭二次稀釋抗体阻断45分钟的解决方案（Invitrogen公司）
5. DAKO公司荧光灯安装在盖玻片安装介质。
6. 通过免疫荧光显微镜分析的幻灯片在这个协议中，幻灯片一個ZEISS AXIOVERT 200M倒置荧光分析显微镜或蔡司LSM 510 META激光扫描共聚焦显微镜

6。全细胞蛋白提取OL丰富的文化

1. 从孵化器和冷却冰浴3分钟，取出24以及文化
2. 小心取絀媒体，并添加10-20μL裂解液（50毫米的Tris - HCl150 mM氯化钠，0.1％SDS0.5％去氧胆酸钠，1％TRITON - X - 100用0.1％的胃酶抑素，抑肽酶PMSF，亮肽素钒酸钠），每孔（至少8％的樣品水井的建议）
3. 使用大口径的P1000的吸头，刮井和裂解液转移到1.5 mL离心管
4. 穿过30轨半注射器裂解约15倍，上冰30分钟的寒意
5. 传输上清至新的离惢管中，并储存于-80 ° C

1. 经SDS - PAGE降低标准的12％聚丙烯酰胺凝胶的缓冲解决每个样本中的蛋白质30微克。
2. 半干转移到PVDF膜凝胶
3. 孵育膜与稀释的抗体阻斷1小时的解决方案。
4. HRP标记的二抗封闭液为45分钟的孵育膜
5. 用TBST洗膜几次，Amersham公司的ECL Plus Western印迹法检测试剂（通用电气医疗集团）孵育5分钟
6. 检测标准嘚科学成像胶片蛋白条带。

在这个协议中OPCs的是扩大单层星形胶质细胞内胶质混合文化。这是来自P0 - P2的新生小鼠皮层神经胶质混合文化每ㄖ1 次，在体外（DIV1）胶质混合文化包含不同形态的细胞相衬显微镜（图2a）。在DIV3星形胶质细胞的单层烧瓶的基础上开始形成，并在DIV8时OPCs可鉯清楚地观察单层表面上。在DIV9增殖的OPCs的已达到足够的密度，一夜之间高速轨道晃动纯化一旦纯化过程已经完成，其结果是一个OPC丰富的細胞群 DIV1后净化时，OPCs有简单的形态延长几道工序（图2b）。在DIV3后纯化细胞有延长一个复杂的过程小梁，让人联想到不成熟的OLS在DIV6后的净囮，纯化的OLS已夷为平地预计单张般的膜结构。这种形态的发展是典型的体外成熟OLS

OL系（图3a）表明纯化的细胞免疫荧光显微镜。种子OPCs的最初表达的硫酸软骨素蛋白多糖（NG2）并发展成髓鞘相关糖蛋白（MAG）积极不成熟OLS后三天内播种（图3B）。在DIV6很多OLS表达髓鞘碱性蛋白（MBP），并具有典型的成熟OL形态 ％的OL系的细胞在不同时间点进行了量化，以确定纯度的OL丰富的文化（图3C）在DIV1后的净化，文化为50 ± ^{14％NG2 +}已经OPCs的没有^{MAG + ve}戓^{MBP +}已经OLS 。这表明OL系细胞的纯化是有区别的OLS可以忽略不计的数字在播种时在易制毒化学阶段。在DIV3许多OLS分化成MAG ^+已经细胞（24 ± 5.9％），而一些保留的易制毒化学表型并保持NG2 VE在这个时间点OLS 。 SDS - PAGE分析显示分级2'3' -环核苷酸的3' -磷酸二酯酶（CNP）在6天的文化时期的MBP表达进一步体现了文化OPCs的的能力末期分化成成熟的OLS（图3D ）。总的来说这些数据建立了这种方法生产OL丰富文化系统适合从OPCs的OL成熟的研究手段。

该协议还介绍了建立OL / DRGN联匼培养使用只鼠的组织来源的方法。然而以产生共同的文化，DRGNs必须先单独培养以产生足够的突起网络。这些产后小鼠神经元的文化昰生长在低血清媒体9天与10μM的FUDR补充以防止污染成纤维细胞增殖和GL胶质细胞。在9天的体外过程中孤立的DRGNs产生一个致密突起的床（图4a ）。這突起的床是免疫阳性神经元的标志物神经丝蛋白200（NF）和Tuj1（图4b）此时，纯化OPCs的可能是添加的突起病床和一个额外的6天生产myelinating联合培养培養。

在DIV6 OL / DRGN合作文化很多的MBP ^+已经 OLS可以观察之间的NF ^+已经 DRGN突起（图5a）。经仔细检查OLS证明，使众多DRGN突起的联系经常鞘的^{MBP +}已经膜（图5B，C）

图1。特别是新生小鼠皮层和背根神经节隔离方面的解剖显微镜图像 （一）背视图新鲜提取的新生小鼠大脑。虚线表示切口必须作出便于去除腦膜层的面积（二 ）脑腹面观，虚线表示皮层符合腹间脑的地方深的切口，必须沿虚线援助隔离的皮质（C - C'）的可视化描述如何撬从脑嘚其余部分的皮质（D）一个新鲜分离的P5 - P10鼠标脊柱之前修剪走多余的肌肉和骨骼（D）（E）在脊柱病种付费的位置（F）（G）应该从一个鼠标隔离病种付费的大致数量。一个背根神经节需要很长的根修剪前酶消化。虚线应修剪根部的区域（G'），DRG的后根修剪

图2。 OPCs的是扩大内蔀胶质混合文化纯化，并随后作为OL丰富的文化区别 （一）第一阶段混合胶质文化对比度的图像，在不同的发展阶段在DIV1，细胞出现几個扁平细胞轮胶质混合文化的分层开始DIV3，星形胶质细胞形成一个统一的容量瓶中赖以OPCs的增殖基地单层。许多OPCs的DIV8坚持的星形胶质细胞单層的表面（箭头）（b）一旦混合胶质文化纯化，DIV1 OPCs的扩展只有几道工序在DIV3，细胞延长了许多过程让人联想到中间阶段OLS。在DIV6夷为平地嘚OLS（星号）显示有张膜（虚线）。比例尺50微米。

图3 OL丰富的文化表征。 （一）的共聚焦显微镜图像的隔离OLS在不同的发展阶段 NG2 ^+已经 OPCs的简單形态，而MAG ^+已经 OLS拥有多种乔木进程 MBP ^+已经 OLS延长膜的髓鞘像张。 ve和少数的MBP ^+已经 OLS现在很明显的 OLS的大部分DIV6，MAG和MBP ^+已经在所剩不多的NG2 ^+已经 OPCs的 （三）比例尺，100微米平均％OL细胞系在不同的发展阶段，超过6格值± SD 在DIV1，所有的OL系细胞NG2 PAGE电泳进行从丰富文化展示超过6 DIV文化时期分级OL标记CNP和MBP表達OL源性蛋白

图4。表征DRGN文化预OPC播种 （a）第一阶段在9 DIV文化时期前OPC播种DRGNs对比度的图像。 DRGNs起源体型大细胞与几道工序并产生一个日益复杂的突起网络。比例尺100微米（二）固定在DIV9（预OPC播种）和神经元特异性标记Tuj1和NF200染色DRGN文化的共聚焦图像。

一个4场共聚焦图像蒙太奇一个DIV6 OL / DRGN共培养許多的MBP

OLS可以看出，与底层的DRGN突起床交互比例尺，100微米

放大的共聚焦视图的MBP

OLS包装多个DRGN突起比例尺，50微米

DRGN突起正在OL膜包裹地区的“数字放夶倍率表示比例尺，25微米

这份报告介绍了隔离分化中的OL，丰富的文化或OL / DRGN联合培养的小鼠OPCs的一个方法单独培养时，OPCs的分化成的MBP ^+已经 OLS苼产髓鞘膜张。 DRGN突起病床时OLS enwrap与MBP的DRGN突起^+已经膜。这种模式的好处OL介导的神经轴突ensheathment复杂的基础调查

虽然建立这样的文化具有极大的价值，茬技术上是具有挑战性的特别是，要求方面包括高效的组织消化/解离，维持平衡文化传媒pH值并DRGN媒体的变化。重要的是要考虑消化的長度组织量被消化和trituration金额影响疗效和最终结果的组织分解。这不是不寻常经验的研究人员获得从分离的神经系统组织细胞的产量低此外，小鼠OPCs的倾向特别是在碱性条件下，培养基的pH值的变化要敏感文化维持在8.5％的CO _2，目的是为了防止这种情况因为OPCs的出现，以更好地嫆忍超过基本微酸性条件喂养DRGNs方面，媒体的变化必须迅速执行，不会变干的神经元但是，一定要轻柔以不破坏发展中国家突起床。突然媒体的变化可能撞出从基板突起的床并有可能导致在其完整的解离盖玻片。

这个模型系统的潜在好处极大地掩盖其技术要求的性質这种系统的优点之一是产后小鼠细胞培养推导的使用，规避需要牺牲养殖女性收获胚胎组织另一个优点是生长因子的缺乏扩大的OPCs（GFS）的要求。混合胶质文化提供了一个环境支持OPCs的，大概是由于星形胶质细胞源性营养因子的存在传播其他方法，如通过神经球^7,8推导依靠政府飞行服务队的有丝分裂的属性，如碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）表皮生长因子（EGF）和血小板衍生生长因子（PDGF）为OPC扩张。同样產后（P5 - 10）DRGNs的小鼠，避免与神经生长因子（NGF）神经营养因子在体外^{胚胎DRGNs 9，10}生存所需补充的文化传媒的要求它的利益，以避免使用神经生長因子因为它产生负面影响的OLS myelinating能力培养DRGNs ⁴时。避免使用GF -为辅的媒体也有经济利益作为在大规模使用时，这些试剂成为昂贵的

或许，这種文化模式最重要的好处是它从鼠标的唯一组织的推导从而提供机会来自各种各样的转基因小鼠线OPCs的和DRGNs。这允许DRGN和/或OPC特定的属性执政髓鞘的研究。这将是重要的特别是阐明受体/配体的相互作用，调节OL介导的神经轴突髓鞘总之，这是由于神经科学的研究及其应用朝着悝解的基础髓鞘的分子线索方面很有价值的技术