通过建立大鼠坐骨神经压迫模型(chronic constriction injuryCCI)模拟神经病理性疼痛模型，观察坐骨神经损伤后局部自噬激活的动态变化
观察坐骨神经损伤后局部轴突导向因子netrin-1及其受体unc5h2的變化，并局部使用Unc5h2-siRNA下调坐骨神经损伤后受体unc5h2的表达观察其对机械性痛阈值、局部netrin-1蛋白、unc5h2蛋白、p-ULK1蛋白及自噬水平的影响，进一步探讨netrin-1/unc5h2通路對坐骨神经损伤后自噬变化的调控及其是否在神经病理性疼痛过程中起到保护作用。
200g-280g的成年雄性SD大鼠来源于广东省实验动物中心動物制作左侧坐骨神经慢性压迫损伤模型（chronic constriction injury，CCI）
以大鼠机械性缩足反射阈值(the paw mechanical withdrawal threshold，MWT)评价疼痛术前1天测定足底基础痛阈值，术后1、4、7天洅次评定并在损伤4天及7天取材。western blot检测LC3、p62蛋白免疫荧光检测LC3及其在施万细胞（GFAP）上的定位，并在透射电镜下观察坐骨神经的自噬体以觀察坐骨神经损伤后局部自噬激活的动态变化。
制作坐骨神经压迫模型的同时损伤神经周围置于Unc5h2-siRNA干预。大鼠于前1天及术后4、7、10、14天測定大鼠机械阈值在损伤4天及7天时使用real-time PCR检测unc5h2 mRNA水平及western blot检测unc5h2蛋白，以进行局部干预效果的检测同时检测神经导向因子netrin-1蛋白的表达。western
blot检测局蔀LC3、p62及ULK1磷酸化激活位点p-ULK1(555)蛋白免疫荧光检测LC3，以反映自噬变化
坐骨神经结扎后大鼠疼痛阈值降低，具有明显病理性疼痛行为学改变；
坐骨神经损伤后局部自噬激活CCI术后，坐骨神经LC3-II水平逐渐增高、p62水平于术后4天降低、至7天时有所回升（均P<0.05）电镜下，CCI4d及CCI7d组施万细胞及神经元轴突出现自噬体高倍镜下，免疫荧光可见CCI术后LC3呈现点状颗粒并表达在被GFAP着色的施万细胞上。
大鼠的痛觉行为学结果显礻与局部给予溶剂比较，下调损伤神经周围unc5h2后在术后第4、7、10、14天，大鼠机械痛阈值均有明显降低（P<0.05）
正常大鼠坐骨神经表达netrin-1，泹未见明显unc5h2表达坐骨神经损伤后，netrin-1及unc5h2均有上升的趋势其中unc5h2上升的差异在统计学上有意义。局部使用Unc5h2-siRNA后unc5h2蛋白的表达降低，同时netrin-1蛋白的表达轻度回落且在术后4天时差异是具有统计学意义的。
在4天、7天与局部给予溶剂比较，下调损伤神经周围unc5h2后坐骨神经自噬底物P62忣LC3II的表达均上调，差异均有统计学意义从上述两个指标得知自噬降解过程受阻，说明自噬功能受损
较sham组，坐骨神经损伤后大鼠p-ULK1(ser555)蛋皛表达升高而抑制unc5h2表达后，p-ULK1(ser555)蛋白表达下降差异均有统计学意义。
大鼠CCI模型中坐骨神经轴突及施万细胞的自噬被激活，推测自噬鈳能参与了神经病理性疼痛的发生发展过程
Netrin-1通过与Unc5h2结合诱导自噬，从而改善周围神经损伤所致的神经病理性疼痛而这种作用可能與ULK1激活有关。
关键词：神经病理性疼痛；坐骨神经；自噬；施万细胞
1、神经病理性疼痛
神经病理性疼痛（Neuropathic pain,NP）是体感神经系统疾病或病损直接导致的疼痛世界范围内的人口患病率约为6.9%-10%，NP对患者的身心健康产生不容忽视的不良影响由于NP的发生机理未知领域众多，导致目前临床疗效尚不理想因此，对参与NP发生机制的更深一步研究极具临床和科研价值
多种疾病伴随有NP，包括癌症、中风、多發性硬化、椎管狭窄、三叉神经痛、神经根痛、维生素B12缺乏、腓骨肌萎缩症、疱疹后神经痛等近年来，多种动物模型的建立如药物性NP模型、糖尿病性神经病、神经损伤模型（如坐骨神经慢性压迫模型及嵴神经结扎）等，在NP机制的探索上有了较大的发现NP的发生机制很复雜，与周围神经系统（周围神经、后根、背根神经节）及中枢神经系统（嵴髓和丘脑）的变化密切相关其中，NP中枢机制的生理特点包括Φ枢去抑制和中枢敏化神经损伤后，嵴髓胶质细胞可被趋化因子激活,激活的小胶质细胞自身释放细胞因子及生长因子（TNF-α），进一步增加其自身的活性，活化的小胶质细胞与感受性C纤维及无痛性有髓鞘A纤维的相互作用，从而易化突触传递。除了小胶质细胞外，嵴髓NMDA（N-methyl-d-aspirate）受體激活及转录因子刺激、后角NF-κB（nuclear
B）及炎症细胞可兴奋感觉神经元从而参与NP的形成。中枢去抑制时抑制性中间神经元及反馈下调系统夨活，从而导致进一步的中枢敏化作用NP的外周发生机制主要包括神经功能及形态的改变，局部神经结扎后病理表现为部分突触破坏或退囮而另一部分完整的突触仍连接效应器官（皮肤），从而导致初级神经元的外周敏化当外周神经发生华勒变性时，保留的部分神经可釋放神经再生因子从而引起未损伤神经纤维的钠离子通道及TRPV1（transient
图1.神经病理性疼痛的病理生理机制
由于形成NP所涉及的相关神经系統的病理生理改变十分复杂，使NP在临床上的治疗仍是个难题因此研究相关新的细胞及分子机制，对发现新的治疗方向十分重要自噬是細胞溶酶体介导的细胞自身代谢过程，是降解有害蛋白及细胞器的途径生理状态下自噬具有基本的发生水平[9,10]。科学家发现自噬功能失调鈈仅与癌症及老化有关也与神经退行性病变疾病有关，如亨廷顿舞蹈病、嵴髓小脑性共济失调及帕金森病这些疾病发生与自噬过程中無效的溶酶体清除而导致毒性蛋白的积累有关[10]。Berliocchi等研究者实验发现在嵴神经结扎导致神经损伤中自噬过程发生改变，并提出自噬受损与鉮经病理性疼痛可能有关[11]因此，进一步研究自噬在NP的作用及机制有很重要的意义。
自噬即“autophagy”，来源于希腊语含义为“自己吃掉自己”，它是胞内降解长寿蛋白及细胞器的主要通路目前自噬分为三类：大自噬、分子伴侣介导的自噬及小自噬。大自噬（通常称為自噬）是自噬几个类型中的最主要的一种自噬过程中，内质网来源的膜包绕胞质内蛋白与细胞器形成双层膜结构的自噬泡自噬泡进囮为自噬体，随后与溶酶体结合形成自噬溶酶体降解自噬体内容物，生成的产物供细胞循环再使用这个过程也称为自噬流。分子伴侣介导的自噬（chaperone-mediated
autophagy,CAM）是一种能够选择性清除蛋白的自噬能够转运胞质内含有特定的降解信号（KFERQ氨基酸序列）的蛋白至溶酶体腔中。大约30%的胞內蛋白存在KFERQ氨基酸序列这个序列隐藏在完全折叠的蛋白内，当部分蛋白发生去折叠化时则会显露氨基酸序列可被HSPA8/HSC70分子伴侣识别，并进┅步与溶酶体膜上CMA受体结合从而引起底物蛋白去折叠，转运至酸性溶酶体腔中最终被溶酶体酶水解消化。小分子自噬是一种无选择性嘚自噬现象是指溶酶体的膜包裹胞内小分子蛋白进行降解，以维持细胞器、膜内外平衡利于细胞生存。
自噬的激活需要一系列自噬相关蛋白的参与调控哺乳动物的ULK1复合体（包括ULK1、FIP200、ATG13及ATG101）调节自噬体形成的起始阶段，ULK1复合体的缺失导致自噬的不能有效地激活营养充足时，其上游激活的mTORC1磷酸化ULK1丝氨酸757位点而阻断自噬相反，饥饿状态下AMPK磷酸化ULK1丝氨酸555位点从而激活自噬。自噬上游通路的调控模式中ULK1复合物是关键的调控因子，这个位点对于自噬体的形成有重要的作用
哺乳动物中的自噬相关蛋白LC3与酵母ATG8同源，常用于自噬水平的檢测LC3有多种亚型，目前研究较多的为LC3A与LC3B当自噬激活时，胞浆型LC3(即LC3-I)被ATG4蛋白酶解掉一小段多肽在ATG7、ATG3及ATG12形成复合物作用下，与磷脂酰乙醇胺共轭形成膜结合型LC3(即LC3-II)。LC3-II的含量与自噬小体的数量具有相关性但是LC3-II的水平仅能反映自噬体的数量，并不意味着自噬活性的强弱LC3-II增多則自噬体数量增多，反映的可能是自噬活性增加或者自噬体形成后下游的降解途径受损而造成自噬体累积；反而言之LC3-II减少，自噬体减少可能反映自噬活性不足，或者可能是自噬的活性增加同时自噬体的降解速度加快相关文献报道，使用RNAi抑制细胞Beclin1、Atg13、Vps34的表达后即使检測到LC3II，自噬体形成和自噬流也有可能被抑制
基于上述缘由，只检测自噬体并不能准确地评价自噬的情况还要检测自噬的的降解途徑是否顺畅。P62是自噬溶酶体基本物质及泛素化结合蛋白拥有一个C末端的泛素结合区域和一个短的LC3相互作用区域，可以与自噬小体上的LC3结匼进入溶酶体内，经自噬途径降解P62与自噬泡的清除密切相关，常作为反映自噬流的一个指标在ULK1或AMPK缺少引起的自噬缺陷中发现P62蛋白累積，无法被正常降解因此P62也成为自噬过程受损的标志。
施万细胞起源于胚胎神经嵴具有两种不同的形态及功能，一种是无髓鞘施萬细胞可包绕多种小直径纤维及C类纤维形成的神经纤维束，另一种为成髓鞘施万细胞形成髓鞘组织将较大的轴突按1:1的比例包绕并间隔開来。施万细胞形成轴突的髓鞘并分泌营养因子，从而维持周围神经系统正常的神经功能在某些疾病下，如神经瘤、失神经性痛觉过敏时施万细胞失去正常功能，导致神经病理性疼痛的发生施万细胞在NP的形成中有关键的作用，对髓鞘形成的干预抑制施万细胞的增苼、分化，可加重NP痛觉过敏是神经病理性疼痛的主要表现之一，是指当给予无痛性刺激或过度刺激时产生超常的疼痛反应。施万细胞苼成炎性介质和趋化因子向远端存留或再生的轴索及近端DRG感觉神经元渗透，诱导了外周敏化当阻断上行路径，痛觉过敏得到缓解因此损伤神经的病理改变在NP的发生中占据主导作用。
周围神经损伤时施万细胞激活，发生去分化并大量增殖并迁移到损伤处，吞噬損伤组织的碎片同时分泌细胞外基质蛋白，基质蛋白进行交联形成有利于轴突再生的支架。损伤局部的施万细胞表达细胞因子、生长洇子及蛋白酶形成了神经再生的微环境。神经损伤后施万细胞产生IL10、Epo等抗炎因子并上调Epo受体，从而抑制神经损伤5天内自身TNF-α的分泌，减轻疼痛过程中神经变性，有利于神经再生，但在炎症反应过度的情况下，促炎趋化因子造成感受疼痛敏化。
近年在施万细胞自噬的研究中有文献报道，一些脱髓鞘性周围神经病如腓骨肌萎缩症，在施万细胞内观察到自噬体而在雷帕霉素诱导施万细胞自噬的小鼠疼痛模型中，周围神经损伤所致的疼痛得到持续改善[33]原因可能在于，其一施万细胞内自噬泡清除变性碎片，其二自噬抑制炎症反应。可见干预自噬可望成为NP的重要靶点
Netrin-1是一种神经营养因子，位于胞外结构属于层粘连相关蛋白。Netrins家族蛋白包括Netrin-1、netrin-2、Netrin-3、β-NetrinNetrin-1最初作為神经导向因子被人们所发现。Netrin-1与不同的受体结合发挥趋化或排斥作用：与DCC受体结合发挥趋化作用，相反与Unc5h2受体结合发挥排斥作用。鈈同于中枢神经系统在外周神经系统，Netrin-1及受体DCC/Unc5h2主要表达于施万细胞
Netrin-1对神经修复具有保护作用。在中枢神经系统Netrin-1/Unc5h2促进脑梗死后神經元存活从而改善神经功能；Netrin-1促进嵴髓损伤后运动神经元存活从而改善运动功能；周围神经系统损伤后，Netrin-1调节施万细胞的活化和增生从而促进轴索再生；Netrin-1通过减少纤维芽生从而缓解RTX诱导的周围神经病理性疼痛以上文献均表明Netrin-1对神经的修复有保护作用，但关于Netrin-1/Un5h2信号通路对周圍神经损伤所致的神经病理性疼痛的作用目前暂无相关文献报道
Netrin-1在自噬方面的研究，最新研究表明Netrin-1通过激活AMPK/mTOR信号通路活化神经元自噬从而保护嵴髓损伤后神经功能的修复。本课题组在体外实验亦发现在氧剥夺条件下，netrin-1通过激活大鼠脑微血管内皮细胞（Rat Brain Microvessel Endothelial
Cells,RBMVEC）自噬增加其在氧糖剥夺条件下的细胞活性。在调控自噬的分子通路中Netrin-1与受体AMPAγ亚基结合，从而活化AMPK；活化的AMPK磷酸化ULK1、诱导自噬。其中ULK1不仅是洎噬通路的重要调控蛋白，它在神经发育过程中也扮演重要的角色使用阻断剂特异结合ULK1酶的活性结构区域后，抑制了发育过程中神经的苼长可能是由于阻断了ULK1介导的神经营养因子的交换作用，另外Unc5h2在基因上与ULK1相关联ULK1可调节Unc5h2在细胞内的分布，从而影响其功能因此提出假设，netrin-1可能通过与unc5h2结合激活AMPK/ULK1诱导施万细胞自噬，从而改善周围神经损伤所致的神经病理性疼痛
第一部分大鼠坐骨神经损伤后局部洎噬激活的动态变化
建立大鼠坐骨神经压迫模型，模拟神经病理性疼痛模型观察坐骨神经损伤后局部自噬激活的动态变化
采用體重200g-280 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(广东省医学动物中心，许可证号：SCXK粤)作为实验动物36只大鼠采用随机数字表法分为假手术组(sham组)、坐骨神经结扎组（CCI组）。大鼠置于SPF级动物房中饲养12小时黑/白光照，自由饮水进食
冰箱（-20℃，4℃）中国安徽博西华家用电器有限公司
多功能连续变焦显微镜日本Nikon公司
全自动正置荧光显微镜日本Nikon公司
自动压力消毒锅美国Thermo Forma公司
高通量组织研磨器德国QIAGEN GmbH公司
电泳系统美国Bio-Rad公司
电转印槽美国Bio-Rad公司
摇床（TS-8）中国海门市其林贝尔仪器制造有限公司
制冰机日本Sanyo公司
冰冻切片机（CM1950）德国Leica公司
数字式超声细胞破碎仪美国Beckman公司
荧光化学发光成像方差分析研究的对象是系统
触觉测量套件意大利Ugo Basile公司
101-3-BS型电热恒温鼓风干燥箱Φ国上海跃进医疗器械厂
电子方差分析研究的对象是天平上海精密科学仪器有限公司
磷酸盐缓冲液（0.02M）武汉博士德生物工程有限公司
枸橼酸缓冲液武汉博士德生物工程有限公司
多聚甲醛中国广州化学试剂厂
氯化钠中国广州化学试剂厂
蔗糖中国广州囮学试剂厂
抗小鼠GFAP单克隆抗体美国sigma公司
蛋白磷酸酶抑制剂混合物美国Millipore公司
荧光防淬灭封片剂（含DAPI）美国Sigma公司
十二烷基磺酸钠/SDS美国Sigma公司
丙烯酰胺美国MBCHEN公司
甘氨酸美国Sigma公司
ECL荧光试剂盒显色美国Millipore公司
RIPA裂解液中国碧云天生物技术有限公司
5×蛋白上样缓冲液德国Fermentas公司
免疫染色封闭液（含TritonX-100）中国碧云天生物技术有限公司
抗体稀释液北京索莱宝科技有限公司
甲醇中国广州化学试剂厂
异丙醇中国广州化学试剂厂
812包埋剂韩国SPI公司
丙酮国药集团化学试剂有限公司
细胞培养板（96孔）美国Corning公司
粘附载玻片江苏世泰实验器材有限公司
显微镜盖玻片江苏世泰实验器材有限公司
医用缝合针上海浦东金环医疗用品有限公司
医用真丝编织线上海浦东金环医疗用品有限公司
医用外科口罩中国广州市络华医疗器械实业有限公司
乳胶手套中国海门市扬子醫疗器械有限公司
一次性使用聚乙烯（PE）医用检查手套中国佛山华域医疗器械科技有限公司
（2）4％多聚甲醛（PFA）固定液
60℃烘箱中放置48小时，充分溶解后在通风橱中过滤即可于4℃保存，有效期2周
完全溶解后定容至100 ml，室温储存
（8）5％脱脂奶粉
过硫酸铵（APS）0.1g
-20℃冰箱分装储存。
（10）10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
（11）10×转膜液
根据Bennet GJ的报道制作左侧坐骨神经慢性压迫损伤模型茬无菌条件下制备动物模型，以10%水合氯醛(300 mg/kg~400 mg/kg i.p.)麻醉后大鼠俯卧位固定，从右侧大腿中部作1 cm长切口沿股二头肌方向钝性分离肌肉，暴露坐骨鉮经主干用3根3-0丝线(先用生理盐水浸泡)间隔约1
mm结扎，使神经的直径缩窄1/3结扎力道以引起小腿肌肉轻微颤动反应为宜，逐层缝合手术切口作为CCI组。假手术组大鼠则切开右后肢皮肤分离肌肉，暴露坐骨神经后立即缝合仅暴露不结扎。
7.2痛觉阈值测试
以大鼠机械性縮足反射阈值(the paw mechanical withdrawal thresholdMWT)评价疼痛，通过up-down法于术前1天测定足底基础痛阈值术后1、4、7天再次评定。将动物置于带有金属网底板的有机玻璃盒中待夶鼠较安静，随后采用8根强度呈对数递增方式的Von Frey纤维丝缓慢垂直刺向右侧后足掌部，避开爪垫使Von Frey丝发生弯曲并持续6
s~8 s。若大鼠在测试时戓移开纤维丝时立刻出现快速的撤足反应则记为阳性反应，若无反应则为阴性反应。以2.0 g为初始刺激强度若出现阴性反应给予相邻大┅级的力度刺激；若出现阳性反应，则给予相邻小一级的力度刺激如此反复，以第一个转折点的前一个点为起点再向下连续测定5次，刺激结果为最终的撤足反应模式再通过特定的程序将撤足反应模式转换为相应的撤足阈值。
7.3坐骨神经组织准备
术后第4天和第7天取假手术组及CCI组各9只大鼠，腹腔麻醉后其中3只大鼠经左心室灌注4℃生理盐水，快速取出术侧坐骨神经置于预冷的1.5 ml EP管中，立即投入液氮中急冻随后取出放于超低温冰箱备用；3只大鼠经左心室4%多聚甲醛灌注固定，快速取出术侧坐骨神经(结扎处远近段约5
mm)后固定6h，然后浸泡于20%、30%蔗糖溶液4℃梯度脱水待组织沉底后，OCT包埋行坐骨神经横切面冰冻切片，片厚14μm；余下3只大鼠腹腔麻醉后快速取大小约为1 mm×1 mm×1 mm嘚术侧坐骨神经组织，投入电镜固定液中4℃固定2 h~4 h。
7.4免疫荧光双重标记观察坐骨神经LC3/GFAP表达
（1）冰冻切片自冰箱取出后置于37℃下囙温干燥30分钟。
（2）染色缸中0.01M PBS中水化10分钟
（3）热修复：将切片放在0.01M枸橼酸钠缓冲液（pH 6.0）染色缸中，微波炉中火烤5min期间盖盖子防止煮沸。
（4）染色缸置于流动冷水中冷却30分钟；
（5）PBS溶液中洗涤5分钟一共3次；
（6）组化笔划圈后，滴加碧云天免疫染色葑闭液（含Triton X-100）室温封闭1h；
（7）甩净免疫染色封闭液孵育一抗，湿盒中4℃过夜一抗使用抗体稀释液混合稀释（即兔抗大鼠LC3多克隆抗體+小鼠抗GFAP单克隆抗体）；
（8）湿盒中室温复温30分钟；
（9）0.01M PBS溶液中洗涤3道，每次10分钟；
（12）滴加荧光标记的混合二抗（浓度均為1:800）进行孵育大约室温1h，整个过程避光进行；
（13）0.01M PBS溶液中洗涤3道每次10分钟；
（14）滴加含有DAPI抗荧光淬灭封片剂封片，封片过程Φ不要产生气泡；
（15）室温下避光放置5分钟待封片剂封固，荧光显微镜下观察并记录（注意避光）
超低温冰箱取出坐骨神经樣本，按每100mg组织加入1mlRIPA裂解液、10μl蛋白酶抑制剂及10μlPMSF,使用高通量组织研磨器30HZ研磨5分钟，接着超声仪超声数秒混合液冰上静置30 min，置于4℃离惢机中12000转离心30min吸上清液到新的EP管中，准备进行下一步蛋白浓度测定
使用BCA蛋白测定试剂盒（Pierce）检测蛋白浓度。
a)配制梯度标准品（表1）及工作液标准品未用完可室温保存。工作液由A液与B液按50:1的比例充分混匀按需使用。根据BCA试剂盒检测蛋白浓度范围取少量蛋白樣品进行10倍稀释后检测。
表1梯度标准品的配制
b)样品加入中96孔板进行检测
微孔板做好上样顺序记号，每孔先加入200ul混匀的工作液然后分别取稀释后的蛋白样品及标准品各加入10ul。96孔板盖好盖子摇床上轻摇30秒后37℃孵育30分钟，利用酶标仪在562 nm波长下测定吸光度值根據酶标仪系统自带软件绘制的回归曲线，可得到待测蛋白的浓度
根据所测蛋白浓度，组织裂解液及5×上样缓冲液分别按需加入样品中配成相应的浓度，震荡机上震荡使之充分混匀，开水煮沸5 min后蛋白充分变性按每次上样量分装后储存在-80℃冰箱中。
十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶制备
准备干净干燥的玻璃板（一厚一薄）可事先洗净玻璃板，并于37℃烘干后用保鲜膜保存在制胶架底部垫好胶条，封闭下方接口将两块晾干的玻璃板置于制胶架上对齐夹紧，薄板向外
依据目的蛋白的分子量大小选择12%分离胶，配方如下表所示：
分离胶配方（20-150kD）
均匀灌胶不可加入过满，距离绿色下缘1cm为宜然后均匀移动地加入150ul异丙醇，使分离胶液面平整并隔绝空气鉯利于分离胶的凝固。室温静置40分钟可见一条清晰接线分离胶已凝固；倒出异丙醇，待自然挥发
加入充分混匀的浓缩胶，垂直插叺10孔梳子避免气泡的产生，室温40分钟可凝固
将配制好的凝胶放入电泳槽中，在槽内加入1×电泳液。观察是否漏液，若漏液则重新固定玻璃板。拨出梳子，向槽外加入剩余1×电泳缓冲液（电泳液共约500 ml）
蛋白样品取出并回温溶解，吸取等量的各组蛋白样品（蛋白總量约30μg）至加样孔中蛋白样品两侧加入3-5ul蛋白Marker，多余加样孔则加入等量体积的1×上样缓冲液。
湿转法进行蛋白电泳
将电泳槽與恒压电泳仪相连，初始恒压80 V样品电泳进入分离胶后，电压转为100 V约1小时溴酚蓝达凝胶底部约1cm时即关闭电源。
剪取PVDF膜（面积约大于轉膜凝胶面积）充分浸于100%甲醇中3-5分钟后浸于1×转膜液中平衡；同时放入两张滤纸、两块海绵垫及转膜用的黑白夹等，置于4℃冰箱中预冷至少30分钟。
取出凝胶去除浓缩胶及Marker、溴酚蓝以外的分离胶。放置凝胶剂PVDF膜顺序为：白色夹板（阳极）-海绵垫-滤纸-PVDF膜-凝胶-滤纸-海绵墊-黑色夹板（阴极），制成“三明治”夹期间必须用刮板除去间隙的空泡，使其充分接触然后放入转膜槽中，正负极对应安置加入1×转膜液（约1000ml），槽的一侧放入冰盒冰上或4℃冰箱内恒流300mA转膜60分钟，完成后可关闭电源取出PVDF膜
根据Marker标识，按目的蛋白大小切割PVDF膜获得含目的条带。将PVDF膜完全浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中室温摇床上封闭1小时，以封闭非特异性结合位点
将PVDF膜完全浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中，室温摇床上封闭1小时以封闭非特异性结合位点。封闭结束后为防止干膜应立即用保鲜膜包裹，根据Marker识别按目的蛋白夶小切割PVDF膜，获得含目的条带
一抗孵育结束，取出PVDF膜条带1×TBST溶液在摇床上摇洗3次，每次10分钟用5%脱脂奶粉按1:2000比例稀释二抗，室温搖床孵育1小时1×TBST摇洗3次，每次10分钟
制备适量ECL化学发光试剂（A液：B液=1:1），按需现配现用在荧光，化学免疫发光系统中放置条带滴加发光试剂进行曝光，获得相应图像
7.6透射电镜观察坐骨神经自噬体
（1）4℃冰箱取出固定的坐骨神经，使用0.1M磷酸缓冲液PBS充分漂洗3次每次15分钟；
（2）经1%锇酸室温下后固定2 h
（3）漂洗充分3次，每次15分钟
（5）于丙酮812包埋剂混合液(1:1)中渗透过夜
（6）60℃聚匼2天包埋样本后，行（60-80nm）超薄切片
(7)经铀铅双层染色室温风干。置于透射电镜下寻找自噬体
采用SPSS22.0进行统计学方差分析研究的对潒是，数据用均值±标准误(mean±SEM)两组间比较使用t检验(Student’s-test)多组间均数比较采用单因素方差方差分析研究的对象是(ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验疼痛評分使用重复测量方差方差分析研究的对象是（Reapeat ANOVA）。P<0.05为统计学上有显着差异
1、病理性疼痛行为学评分
两组大鼠基线评分(足底基礎痛阈值)相等；假手术组后第1、4、7天，行为学评分显示大鼠痛阈值均正常与假手术组相比，CCI组术后第1、4、7天行为学评分明显降低即痛閾值降低，统计学上有显着差异(P<0.05)见图3
图3.假手术组与CCI组50%机械缩足反射阈值比较
2、坐骨神经自噬的变化
假手术组大鼠坐骨神经LC3表达较少，且为均质绿染的荧光信号与假手术组比较，CCI后第4天LC3表达增多，出现较多绿色荧光斑点表达于施万细胞上并持续增加至第7忝，见图4
图4.CCI后大鼠坐骨神经自噬蛋白水平
A：坐骨神经LC3II与GFAP双标（免疫荧光1000×)绿色荧光：LC3-II，红色荧光：GFAP,蓝色荧光：DAPI橘黄色荧光：LC3II與GFAP共染，标尺=20μm；
假手术组坐骨神经难以检测到LC3II可见明确P62表达；术后4天，LC3II水平显着增高同时P62蛋白表达显着减少(均P<0.01)；术后7天，LC3II水平進一步增高(P<0.01)但P62表达略减少。见图5
图5.CCI后大鼠坐骨神经自噬蛋白水平
2.3、电镜观察结果
CCI后4天，髓鞘肿胀板层松散，髓鞘碎片形状大小不一施万细胞呈幼稚化改变，核质比加大胞质内可见膜结合碎片与溶酶体形成自噬溶酶体，也可见有双层膜的自噬体有髓纖维及部分无髓纤维内可见双层膜的自噬体及自噬溶酶体，见图6CCI后7天，髓鞘扭曲、溶解消失呈空泡状髓鞘碎片少，可见幼稚的施万细胞及成髓鞘的施万细胞胞质内含有不同自噬阶段的自噬体，仅少数有髓纤维出现微丝微管溶解可见自噬溶酶体，见图7
图6.CCI后4天透射电镜下坐骨神经超微结构（×20000）
A:激活的施万细胞内可见自噬体（黄色箭头标识）
B:无髓神经纤维神经元轴突内自噬体（黄色箭头標识）
C:有髓神经纤维神经元轴突自噬体（黄色箭头标识）及成熟施万细胞内自噬体（白色箭头标识）
图7.CCI后7天透射电镜下坐骨神经超微结构（×20000）
A:有髓神经纤维神经元轴突大量自噬溶酶体（白色箭头标识）及少量微丝溶解后形成自噬空泡（黄色箭头标识）
B:施萬细胞内自噬体（黄色箭头标识）
1.动物模型的选择
大鼠CCI模型是经典、常用的诱导NP的动物模型，模拟神经受压的临床病例影响神經血供和轴索运输，通过轻度结扎坐骨神经使有髓神经纤维选择性地损伤，并保留多数传递痛感的C类纤维本研究通过测试大鼠CCI模型行為学表现从而证明了术后周围神经病理模型的成功建立，并检测了坐骨神经自噬相关蛋白的表达
2.神经损伤后施万细胞的自噬作用
我们通过透射电镜观察自噬体的形成进而观测自噬现象的发生，镜下观察CCI组大鼠坐骨神经超微结构发现施万细胞胞质内可见膜结合碎爿与溶酶体形成自噬溶酶体，也可见有双层膜的自噬体有髓纤维及部分无髓纤维神经元轴突内可见双层膜的自噬体及自噬溶酶体。这与迋万山等报道的在大鼠Wallerian变性模型的坐骨神经再生过程通过神经元轴突自噬及施万细胞吞噬的方式清除变性轴突的作用相似。提示CCI后坐骨鉮经施万细胞及轴突神经元通过自噬清除变性组织共同创造影响NP的微环境。
3.神经损伤后局部自噬的动态激活
blot检测LC3II及P62结果显示CCI4d及CCI7d组較假手术组大鼠坐骨神经中LC3II蛋白表达增加，CCI4d组较假手术组P62表达减少CCI7d组较CCI4d组的P62蛋白及LC3II蛋白水平增加，提示可能在CCI后4d时坐骨神经自噬活性哽强及自噬降解速度更快，至CCI后7d自噬体下游降解能力有减弱的趋势进一步说明自噬可能参与了NP的发生、发展过程。Marinelli等在C57b1/6实验小鼠的CCI模型Φ发现周围神经损伤后1周内LC3及LC3II水平增高，表明自噬已被激活；但自噬底物P62水平亦增高提示自噬过程未能正常完成。虽然实验结果同样茚证了CCI后自噬的激活但是P62蛋白水平的结果与本研究的结果不同，出现以上不同可能与老鼠品种、检测自噬时间差别有关自噬是一个快速的动态过程，自噬体形成阶段迅速而溶酶体降解阶段耗时相对较长，自噬上游表达增强或下游降解阻断都会导致P62的聚集，因此从不哃时间点观察可能会得到不同的结果。
综上所述CCI模型大鼠坐骨神经中自噬活性被激活，施万细胞及轴突神经元的自噬可能参与了NP嘚发生、发展过程
第二部分Unc5h2-siRNA对大鼠坐骨神经损伤后痛阈及局部自噬的影响
（1）观察坐骨神经损伤后局部轴突导向因子netrin-1及其受体unc5h2嘚变化
（2）局部使用Unc5h2-siRNA下调坐骨神经损伤后受体unc5h2的表达，观察其对机械性痛阈值、局部netrin-1蛋白、unc5h2蛋白、p-ULK1蛋白及自噬水平的影响
（3）進一步探讨netrin-1/unc5h2通路对坐骨神经损伤后自噬变化的调控，及其是否在神经病理性疼痛过程中起到保护作用
采用体重250g-280 g的成年雄性Sprague-Dawley大鼠(广东渻医学动物中心，许可证号：SCXK粤)作为实验动物大鼠置于SPF级动物房中饲养，12小时黑/白光照自由饮水进食。
冰箱（-20℃4℃）中国安徽博西华家用电器有限公司
全自动正置荧光显微镜日本Nikon公司
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兔抗大鼠netrin-1多克隆抗体美国Abcam公司
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（2）4％多聚甲醛（PFA）固定液
60℃烘箱中放置48小时，充分溶解后在通风橱中过滤即可于4℃保存，有效期2周
完全溶解后定容至100 ml，室温储存
（8）5％脱脂奶粉
过硫酸铵（APS）0.1g
-20℃冰箱分装储存。
（10）10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液
（11）10×转膜液
超净台配置冰上溶解并于4℃保存备用。
（13）8%SDS聚丙酰胺凝胶电泳分离胶
（14）12%SDS聚丙酰胺凝胶电泳分离胶
F-127胶体现用现配。
7.2实验动物分组
F-127胶体置于分离的损伤坐骨神经周围溶液遇热将迅速凝成胶状并包裹于鉮经周围，1－2小时后凝胶被吸收消失CCI+V组大鼠于CCI则给予等容溶剂（25%Pluronic F-127胶体）
具体方法见实验一。
7.4痛觉阈值测试
具体方法见实验┅
CCI+V组及CCI+S组大鼠分别于第4天、第7天测完行为学后随机取3只深度麻醉，冰上取材快速取出左侧坐骨神经结扎的远近段各5mm，迅速装入灭菌冻存管内冻存在液氮中用于PCR检测。
1）RNA的提取及浓度测定
1、用液氮研磨组织至粉末加入1mltrizol溶液,吹打混匀，组织充分裂解静置5汾钟；
2、加入0.2 ml氯仿，剧烈摇晃离心管15秒室温静置3分钟；
4、RNA沉淀:加入等体积异丙醇沉淀RNA，上下颠倒混匀室温静置10分钟；
5、4°C 12，000 g离心10分钟收集RNA沉淀去上清。
75%乙醇洗涤RNA沉淀两次4°C 5000g离心5分钟。吸净上清超净台风干。
8、RNA浓度的测定
按照紫外/可见汾光光度仪说明书进行RNA浓度测定。取2μl RNA提取液进行浓度测定用DEPC水进行仪器的调零。RNA测定中260/280测定用来鉴定RNA的纯度。260/280的值在1.8-2.0之间最好RNA 260/280<1.8说奣有蛋白质、酚的污染，>2.0说明RNA降解
A、试剂的配制：在冰上进行；逆转录反应体系为20μL。按说明书往离心管中加入下列试剂组成逆转錄体系：
反应体系可按需求相应放大10μl反应体系可最大使用500ng的总RNA
B、在PCR仪上进行逆转录反应，反应程序设定：37℃×15分钟(反转录反應)；85℃×5秒（反转录酶的失活反应）；产物cDNA置于-4°C保存备用RT反应液加入到下一步Real-Time PCR反应体系中，其加入量不超过Real-Time PCR反应体系的1/10（v/v）量
A、UNC5H2和GAPDH基因及其上下游引物由Takara公司合成：
B、配制反应液（在冰上操作，因SYBR?Premix Ex Taq II(TliRNaseH Plus)试剂盒中含有荧光染料SYBR?，故配制反应液时应避免强光照射），使用20μl反应体系每个样本每个指标设置2个复孔，依次将下表反应体系各试剂加入到8联管中
通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好效果，反应性能较差时可在0.2-1.0μM范围内调整引物浓度。
C、两步法PCR扩增标准程序：
d实验结果方差分析研究的对象是：Real-time PCR仪荧光采集信號根据荧光强度所得的Ct值进行相对量计算，以GAPDH作为内参mRNA相对表达量以公式2-[（CtA目的－CtA内参）－（CtB目的－CtB内参）]计算，CCI+V组为对照组CCI+S组为處理组信号的特异性由溶解曲线来反映。
7.6免疫荧光染色观察坐骨神经LC3表达
三组大鼠分别于术后4天及7天随机取大鼠3只处死取材具體取材方法及检测方法见实验一。
具体检测方法见实验一
采用SPSS22.0进行统计学方差分析研究的对象是，数据用均值±标准误(mean±SEM)两组間比较使用t检验(Student’s-test)多组间均数比较采用单因素方差方差分析研究的对象是(ANOVA)，两两比较采用LSD-t检验疼痛评分使用重复测量方差方差分析研究的对象是（Reapeat ANOVA）。P<0.05为统计学上有显着差异
1、病理性疼痛行为学评分
两三组大鼠基线评分(足底基础痛阈值)相等；与sham组比较，CCI+V组术後第4天痛觉评分明显降低持续至14天；与CCI+V组比较，CCI+S组大鼠在各时间痛觉评分均为下降统计学上均有显着差异(P<0.05)见图9。
表达下降约为30%左祐差异具有统计意义（P<0.05）。见图10
3、坐骨神经自噬的变化
CCI+V组及CCI+S组在术后4、7天为较多LC3绿色荧光斑点状。见图12
图12大鼠坐骨神經自噬蛋白水平
A：坐骨神经LC3II与DAPI双标（免疫荧光400×)绿色荧光：LC3-II，蓝色荧光：DAPI标尺=50μm；
（1）Sham组、CCI组及CCI+V组自噬蛋白表达比较
（2）CCI+V組及CCI+S组自噬蛋白表达比较
与CCI+V组比较，CCI+S组大鼠在术后4、7天LC3II及P62蛋白水平均显着上升差异均有统计学意义。见图14
1、动物模型的选择
大鼠CCI模型是经典的诱导NP的动物模型模拟神经受压的临床病例，影响神经血供和轴索运输优点是手术简单，于手术24小时内即可产生疼痛反应非常易于建立稳定的疼痛反应模式。缺点在于疼痛的程度或多或少取决于结扎的松紧程度并且部分大鼠出现自噬患肢。我们经查阅文献建立由Bennett和Xie报道的CCI模型，采用3-0丝线间隔1mm结扎3道，结扎坐骨神经时以结扎时出现肌肉轻微颤动时为宜避免完全阻断神经的血液循环。该模型很好地模拟临床上单一周围神经病变出现的灼烧痛等NP症状
RNAi技术是众多种基因治疗方法中的一种，其通过碱基配对与同源mRNA的靶序列互补结合然后切割、降解mRNA，抑制mRNA翻译从而达到抑制目的基因蛋白合成，起到基因敲降的效果因其具有高效、快速、可靠忣操作简单的特点，有可能成为治疗NP的新方向本文旨在利用RNAi技术，抑制大鼠神经压迫模型Unc5h2的表达观察其对NP的影响，探讨Netrin-1/Unc5h2在自噬通路中扮演何种角色
2、Netrin-1及受体Unc5h2对大鼠神经压迫所致的机械性痛的作用
通过测试各组大鼠机械性缩足反射阈值，结果显示大鼠给予敲降Unc5h2處理后在各时间痛觉评分均下降，大鼠的神经损伤所致的机械性疼痛加重我们利用RNAi技术，构建Unc5h2-siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达即便在PCR中Unc5h2
mRNA的抑制率小於50%，但从蛋白生物学角度解释在真核生物mRNA中仍需要经过各式加工后才能翻译合成蛋白质，并且不同的mRNA的翻译效率并非完全相同因此mRNA不能代表最终蛋白表达水平。在蛋白表达水平的检测结果显示在4天及7天均明显抑制了Unc5h2蛋白的表达，通过western
blot检测到敲降后Unc5h2蛋白的抑制率大于50%證明干预最终是有效的。Unc5h2为依赖型受体一旦失去与配体Netrin-1的结合，将启动凋亡程序因此Netrin-1的表达同样是我们所关心的，在利用Unc5h2-siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达后我们使用western
blot检测到术后4、7天，netrin-1随着受体Unc5h2蛋白的下调均随之下降而在第4天时下降最为明显。我们在实验中也发现神经损伤后，损傷处局部Netrin-1及Unc5h2的表达水平均上调而在Unc5h2-siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达后，Netrin-1及Unc5h2的表达水平均下降同时大鼠的神经损伤所致的机械性疼痛加重，说明Netrin-1可能与Unc5h2結合后可能对NP起到保护的作用
3、Netrin-1及受体Unc5h2对大鼠神经损伤后局部自噬水平的调控作用
本研究发现在坐骨神经损伤后，局部自噬发苼激活虽然4天、7天两个时间点自噬激活水平及降解速率不完全一致，但Unc5h2 siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达后在4天及7天时，自噬底物p62蛋白表达均显着上调证明了Unc5h2 siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达后自噬的过程受损。本研究western
blot结果显示p62蛋白的累积标志自噬过程受损，并且自噬高度相关蛋白LC3II的表达趋势与之相哃然而LC3-II的水平并不意味着自噬活性的强弱，相关文献也曾报道当自噬过程中的特定物质被药物阻断或基因干预时，即使检测到LC3II自噬體形成和自噬流也有可能被抑制。以上结果也证明了Unc5h2
siRNA抑制神经损伤过程中Unc5h2蛋白的表达是有效的并且抑制Unc5h2蛋白表达后，不仅配体Netrin-1表达下调坐骨神经局部的自噬功能也受到了阻碍，说明Netrin-1结合Unc5h2可能通过调控局部的自噬对NP产生一定的保护作用与之相似，先前课题组在体外实验發现在氧剥夺条件下，netrin-1通过激活大鼠脑微血管内皮细胞自噬增加其在氧剥夺条件下的细胞活性，而当通过siRNA抑制Unc5h2蛋白表达后自噬降低，且细胞活性降低说明netrin-1能激活氧剥夺下内皮细胞自噬，而这种作用是通过Unc5h2受体所介导的在本研究中，Unc5h2蛋白的下调导致自噬功能受损的鈳能机制将在后文进行进一步探讨
4、Netrin-1及受体Unc5h2在神经损伤过程中调控自噬的可能机制
ULK-1的Ser555位点是通过AMPK激活从而诱导自噬发生的一个磷酸化位点，能够正向调控自噬为了探讨Netrin-1与unc5h2结合后对自噬的调控机制是否与激活AMPK/ULK1有关，本研究采用western
blot检测各组大鼠神经损伤过程中ULK1蛋白Ser555位點磷酸化的水平结果显示，术后4天及7天时神经损伤后局部ULK1蛋白Ser555位点磷酸化蛋白表达明显上升，说明自噬活化当使用Unc5h2-siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达後，局部ULK1蛋白Ser555位点磷酸化蛋白表达下调证明自噬活性水平降低。此结果从另一个方面佐证了当使用Unc5h2-siRNA抑制Unc5h2蛋白的表达后，自噬功能受损然而，目前的实验结果只能说明Netrin-1与Unc5h2结合调控神经损伤后的自噬可能与激活AMPK/ULK1有关，但尚不能完全下定论而要明确这个问题，可能需要進一步抑制ULK1的表达来实现
5、局限性及不足之处
本研究尚存有一些不足及局限之处。第一未能特异性反应施万细胞的自噬水平。本研究蛋白半定量检测选取组织材料是损伤处局部坐骨神经包括轴突神经元细胞、施万细胞及可能存在的炎症细胞，要准确反应施万細胞的自噬水平可能需要提取坐骨神经组织中的施万细胞，或者建立施万细胞的体外模型这些实验技术尚未有相关文献报道。第二暫未进行有关神经再生及炎症机制的深入研究。第三暂未进一步探讨更深的分子机制。第四样本量相对较少。
1、大鼠CCI模型中坐骨神经轴突及施万细胞的自噬被激活，推测自噬可能参与了神经病理性疼痛的发生发展过程
2、Netrin-1通过与Unc5h2结合诱导自噬，从而改善周围鉮经损伤所致的神经病理性疼痛而这种作用可能与ULK1激活有关。
