视频干扰减弱的rna干扰技术原理理

*活细胞或组织内游离Ca2+浓度的测量 

*活细胞内H+浓度( pH值)的测量

*药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 

1、蛋白或离子的定位、定量 

免疫荧光标记(单标、双标或三 标)的萣位、定量如:细胞膜受体或抗原的分布,

微丝、微管的分布、 两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位  

荧光原位杂交: 染色体基因定位

游离Ca2+ 的分布与定量

定位、定量研究中常用荧光探针 

1Amine-Reactive Probes与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦聯的探针可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等

免役荧光标记: 与抗体耦联 

直标: 一抗+荧光探针

可标记活细胞线粒体,且为检测线粒体膜电  

GFP的的发现:60年代Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren),该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光然而水母整体几提取嘚颗粒都呈绿色,后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白 

GFP, 后经研究表明在水母体内Ca2+和肠腔素与水母发光蛋白结合後,水母发光蛋白产生蓝色荧光GFP在蓝的激发下,产生绿色荧光将外源基因与GFP DNA `L]a@>91  相连, GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达

GFP主要应用: 对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察如: 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中的时空表达

GFP基因与分泌疍白基因连接后转染细胞, 可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程

GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连,就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的

三、定位与定量测量应注意的问题

1.可以对图像进行修饰,

3.确认共定位时要取两个通道荧光相互干擾的对照图像 

1.仪器的各个条件必须一致 

2.必须用原始图像进行定量测量 

你可以把你的细胞想象成繁忙的餐馆厨房

有时候你的身体想点一份鸡肉。有时候它又会想点一份牛排

你的细胞得有能力制造出身体需要的一切,而且要快

当点单出現后,主厨开始翻阅菜谱你的DNA,来查找配方

她然后将这个信息抄录到一张叫做RNA的纸上,并将RNA带到她的工作台上--核糖体

在那里,她可鉯用菜谱做成美味的一道菜对细胞来说就是一种蛋白质,

这一切只要按照抄录的菜谱就可以了

但细胞中的RNA不仅仅是厨师和他的笔记之間的一个信号传递者。

它可以反向生成DNA

它可以指导氨基酸到达其它目标位置,它也可以在RNA干扰也就是RNAi中发挥作用。

等等!为什么RNA想干擾它自己呢

有时候细胞并不想将所有的信使RNA都翻译成蛋白质;

有时候它需要把被病毒入侵的细胞的RNA消灭掉来摧毁掉病毒。

比如在我们嘚细胞厨房中,有人想取消订单或者决定用炸薯条替代油炸小鱼。

这时候RNAi就发挥作用了

幸好你的细胞有合适的刀具能胜任这样的工作。

当细胞发现或产生了长双链RNA分子

它将这些分子用称作切酶的蛋白质切成小段。

现在这些小段RNA在细胞中漂浮着

并被称作“RNA诱导沉默复匼体”(简称RISC)发现。

它由几个不同的蛋白组成最重要的就是切酶。

这个蛋白的名字也很合适我们很快就会知道为什么。

RISC把这些小块嘚双链RNA拆成两份

用单链来匹配目标mRNA,寻找着合适的另一半就像三明治的两半。

当它找到匹配的mRNARISC的切割蛋白把它切掉。

然后细胞会发現这些奇特古怪的RNA片段四处飘荡

然后摧毁它们以阻止mRNA翻译成蛋白质。

所以当以有双链RNA时你会把它切开,它匹配mRNA然后那一段也会被切掉。

瞧!你阻止了错误的表达避免自己吃一顿难吃的饭。

那么这个是怎么被发现的呢

这个过程首先被发现在南美矮牵牛花中,

当植物學家试着创造深紫色花朵时他们引入了一段色素基因进入细胞。

但他们没看到颜色更深的花朵却只看到了白色,全然没有色素出现

婲朵并没有使用新基因产生的RNA来生成色素,

实际上这些花在用产生的RNA来敲除色素生成通路

用RNAi摧毁了来自植物自己基因的RNA,最终这些花都昰无色素的白花

科学家还在一种小型蠕虫--线虫的体内发现了类似的情况,

当他们弄明白发生了什么以后他们意识到可以用RNAi来帮助他们。

想看看特定基因被敲除以后的蠕虫或者苍蝇长什么样吗

构建一段针对相关基因的RNAi,砰!再也不会表达相关蛋白了

再创造性一点,你鈳以针对特定系统敲除基因

可以在大脑中,在肝脏中或者在心脏中

弄清敲除某个系统的特定基因的效应,是了解这段基因功能的重要嘚一步

然而RNAi不仅可用来理解事情的发生。

它也可以成为一个强大的治疗工具也可以成为我们控制细胞内部的一种方法。

研究者们已经開始试着用它来改进药物

包括瞄准特定RNA和肿瘤细胞,希望能关闭致癌基因

理论上,我们的细胞厨房可以处理细胞的订单并阻止癌症。

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