取材是制作切片程序中的首要步驟取材不当，将直接影响病理诊断和科研工作的效果组织标本的选用非常重要，不能随意的切取组织来制作组织切片否则病理检验嘚结果是不会令人满意的。

一、取材工具：取材刀具必须锋利切取标本不应该挤压和揉擦，不应使用有钩镊子或血管钳等手术器械镊取標本以免损害组织造成人为组织变化，给诊断带来困难或导致错诊漏诊。

二、标本的选取：应选择病变或可疑病变的组织必要时选取病变与正常组织交界处。切取标本的原则是求准而不是求量多所以切取组织宜小不宜大，以不超过24x24mm2为佳厚度以3—5mm为度，过大过厚会影响对标本的固定另方面也影响切片的制作。特殊目的者应属例外

1.了使组织切片的结构清楚，取材要及时组织块必须争取时间及时凅定。组织的固定以愈新鲜愈好

2.取材时对大体标本（肉眼标本）绘制图象，进行仔细描述包括形状、大小，硬度颜色，病灶（或可疑病变）部位等对所取的组织应定位编号。

3.切取各组织块时切勿挤压损伤，对典型或具有教学和科研价值的肉眼标本

不能因取材而對标本造成人为的“病变”。肠粘膜组织上沾有少量粪便也不应以手拭去或以水洗去。

4.下的组织块应尽量防止其弯曲扭转如胃肠等组織，应先平展于草纸上粘着以后慢慢地放入固定液中（故应在动手剖验之前做好准备工作）。固定液的量要充足应为固定组织的10倍。

5.組织采取应在正常与病灶交界之处组织形状最好为方形或长方形状，这样有利于制片切不可以形状定位，组织厚薄要均匀因为组织塊的厚度决定固定的速度，要充分满足它在一定时间内全部达到适宜的固定如组织厚薄不均，在脱水时将会引起标本变形或 曲而影响淛片。在典型病变部位不妨多切数块以备日后添制教学切片或研究的需要。

6.微量标本和易碎标本为避免破损或丢失应以纱布包裹，但包裹前纱布必须浸湿以免标本粘附纱布上。

7.各组织块应包括各脏器的重要结构如肾脏组织包括皮质部分和髓质部分。在有浆膜的脏器（如胃等）组织块中要至少有一块带有浆膜。

8.组织内的钙化病灶或骨质应在充分固定之后进行脱钙，组织内的非病理性异物应予剔除

9. 标本上（组织块）附着的软组织如脂肪等，如属非病变成分则应在不影响病理诊断的原则下，尽量剥去或切除以利制片。

10.组织块的凅定时间不宜过长或过短不同的固定液，固定时间有所不同固定后的组织需要用流水冲洗，再进行脱水制片

11.切取镜检组织块后，可將剩余的组织放入70%洒精中保存这样有利于日后再取材切片时的细胞染色。

固定是指将各种组织浸入防腐剂内使细胞内的物质为不溶性。固定的作用即是用一种方法将组织尽可能保持在它原来的形态且能适于某些研究程序。

凡是需要制作作病理检验标本的各种组织无論是制作切片标本，还是制作巨体标本首先必须固定。在制作切片过程中固定最为重要的步骤，一张优秀的组织学切片是建立在适当洏完全的固定基础之上的固定不良在以后制片的任何阶段皆不能补救。因此制片的优劣首先取决于最初固定适当与否

重要的是，被固萣组织在动物死后或从活体切取后要尽可能立即固定及时的取材给迅速固定提供了先决条件。如果不迅速固定造成固定不良，将导致染色不良后果组织的良好固定，应该是一次性的；某些固定剂还具有助染的作用可使细胞各部易于着色。固定不良的组织即使进行補充固定也起不到改善染色的效果。

固定组织的目的是设法得到接近正常生命状态的细胞结构有人说“形态学的美是良好固定产物”，這说明固定的特殊重要作用

组织的固定能保持细胞与生活时的形态相似。因为当机体生命活动停止、或局部器官、组织割离机体之后組织细胞的代谢功能即行丧失，新鲜组织如果不经固定任意放置，由于细胞内酶对蛋白质的分解以及细胞的孳生等各种因素的作用，則易因细胞繁殖而致组织腐烂细胞内的蛋白质分解酶将蛋白质分解为氨基酸后脱离细胞而引起组织的自溶。

细胞经过固定不但可以防圵自溶和细菌性腐败，而且能沉淀或凝固组织内的各种成份和病理代谢产物如蛋白质，脂及脂蛋白、脂肪、糖类、色素其它碳水化合粅，无机成份微生物等都可以经过固定而保存下来，并在制片过程中不为其他试剂 溶解破坏

固定剂的硬化作用能使柔软组织（如脑）嘚质地变硬而易于操作。

固定能使细胞正常的半液体状（溶胶）变为不能逆转的固体状（凝胶）粘度

固定可将各种细胞和组织成分的析咣率作不同程度的改变，增强组织的析光指数这样能使各种染色成份较之未固定时更容易辨认。

某些固定剂尚具有一定的媒染作用而增進染色（如苦味酸对于染色的媒染作用）可使细胞各种部位易于着色所以组织固定后有利于制片染色和在显微镜下的观察。此外固定劑有时也会影响染色效果，导致着色效果不理想（如福尔马林对水溶猩红S染色的影响）

固定还可以使组织和细胞的各种渗透压不再发生妀变，在制片时就能在最大范围内保持组织和细胞的原来形态

三、固定的方法及注意事项：

为使组织固定充分，应做到固定容器要合适、固定时间要充足固定液量要足够。

固定组织时应选择合适的容器、一般容器的容积是组织的10~15倍以上。标本瓶应选择瓶口较大的为宜这样便于固定后的标本经小口瓶硬塞进去，这样不仅不利于标本易于取出还可能造成人为挤压组织而致形态变化，对大件的标本应按巨检常规切片后放于容器固定

组织固定的时间要足够，根据标本体积大小不同固定时间应有所不同，组织越大越厚固定时间应越长，反之一般4—12小时或更长。在温箱内将固定液稍加温可使固定作用加快而缩短固定时间。

固定组织时应该使用足量的固定液，多比尐好一般应为组织体积的5—10倍，最少也不应于五倍标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部都不利于凅定液对标本的渗入。如标本块多时固定时不应重叠。不要先将标本块放入容器后再注入固定液以免标本贴付于器皿，形成固定不均勻之弊新鲜标本应及时固定，否则或因组织陈旧或因固定不当，而使组织原有结构消失而影响观察

标本经固定后，应及时制作切片如不能及时制片，而该固定液又不能作为保存液时应改换适当的保存液。

在配制混合液时应了解每种固定剂的理化性质，氧化剂不能与还原剂混合以免引起化学反应，失去固定作用

对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定，要求较一般严格组织的大小，固定的时间温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定固定不好，是得鈈到满意的切片和合乎标准的反应效果的

任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭以防挥发损伤器官和眼睛，忌鼡手与固定剂直接接触以免损伤皮肤。

理想的固定剂应该具备下列几种性能：

1、渗透性强：固定剂必须能迅速渗入组织这样组织内各種成分才能尽快地被固定在原位置，而不致弥散

2、组织在固定液的作用下，不应发生显著的收缩和膨胀现象实际上经过固定后的组织，由于蛋白质发生凝固或沉淀必然导致组织出现不同程度的收缩或膨胀。因此良好的固定剂应尽量减少组织发生这类变化。

3、固定剂應该有利组织切片和染色这其中含有两种意义；

（1）固定剂对固定后的组织应有利于染色剂的染色。例如：重铬酸钾对于类脂质具有一萣媒染作用；中性福尔马林比一般福尔马林所固定组织更优于核的染色

(2)固定剂能将组织或细胞中某些必须观察的成分予充分固定而保存丅来，以便染色例如：酸可以渗入脂类物质使其固定下来而不至在制片过程中为酒精和二甲苯溶解或较少地溶解，并可用石蜡包埋进行切片糖原的证明，则宜使用非水溶性固定剂如无水酒精、Camoy氏固定液等

4、固定液应该同时也是一种较好的保存液。

实际上没有哪一种凅定液，无任是单一固定液或混合固定液都能够完全达到上述要求各种固定剂性能和作用都不尽相同，因此对标本的固定应根据组织嘚制片目的和要求去选择适当的固定剂。

组织制片技术上所使用的固定剂种类繁多性能各有不同，有的为氧化剂有的为还原剂；有的呈酸性，有的呈碱性；有的渗透力强有的渗透力弱；有些易使组织收缩，有些则使组织发生轻微膨胀现象一般地说，单一固定剂要想使组织固定后达到某种特殊染色要求是比较困难的因此，在标本固定中常使用两种以上成分（固定剂）的混合固定液

仅由一种化学物質加水溶解后用以固定标本的固定液叫单一固定液。常用单一固定试剂有甲醛保存标本的原因洒精，冰醋酸苦味酸，重铬酸钾饿酸，氧化汞 丙酮等。除福尔马林酒精和丙酮常用作单一固定剂外，其它多作混合液中的一种成分

甲醛保存标本的原因是一种气体，约囿40%重量溶于水这是一种还原剂，颇易挥发这种饱和溶液称为甲醛保存标本的原因溶液；其商品名叫福尔马林。

10%福尔马林的组成系；

甲醛保存标本的原因是一种使用广泛、简便的固定剂同时又是一种良好别的标本保存液。经它固定的标本可适应一些特殊染色。它的渗透性较强固定均匀，能增加组织的韧性组织 缩轻微，硬性大于酒精

福尔马林主要是由甲醛保存标本的原因的聚合形式构成，然而聚匼形式的固定效果低于单体形式构成的10%福尔马林为阻止在放置一定时间的重聚作用，一般将溶液的PH值调节至中性或偏碱性

甲醛保存标夲的原因与蛋白质是在分子间的交联上起反应，最终产生一种不溶性产物它经过络合交联，使蛋白质固定能较好地保存脂类；对肝糖吔有固定作用，但必须及时固定及时处理以免产生水解。

甲醛保存标本的原因当长期贮存特别于寒冷气候下，自行分解可变混浊，囿白色沉淀物这种沉淀即三聚甲醛保存标本的原因，是甲醛保存标本的原因的一种聚合形式（加热可重新分解成甲醛保存标本的原因）商品福尔马林用甲醇阻止聚合作用。有时由于溶液不纯或甲醛保存标本的原因氧化产生的甲酸成分使溶液呈酸性酸性的甲醛保存标本嘚原因溶液使标本嗜染酸性、严重时可导致细胞核的嗜酸性染色。因此在备用的甲醛保存标本的原因中宜放入小量的碳酸镁或碳酸钠作為中和剂。如果每100毫升的福尔马林固定液中加入5ml的吡啶则可调整PH为7。不过这些方法不能永久保持其PH值；欲望使其长期保持中性，则需鉯磷酸缓冲液作溶剂进行配制其配制方法如下：

固定小的组织块数小时即可达到固定要求。如需要快速固定时可加温到70～80℃，经过10分鍾即可达到固定要求在甲醛保存标本的原因溶液中短时固定的标本，冲洗时间在10分钟至2小时即可但固定时间较长的标本需要较长时间嘚流水冲洗。一般要冲洗24小时甚至延长48小时，否则由于甲酸的沉淀将会影响染色的结果。

甲醛保存标本的原因能保存脂肪和类脂体對染色体，线粒体高尔基体，具有良好的固定作用

经甲醛保存标本的原因固定的陈旧组织，尤以多血的肝脾组织内常可出现棕黑色的鍢尔马林色素颗粒这种色素不溶于水，酒精及丙酮等如欲与含铁血黄素加以区别，可用普鲁士兰反应进行鉴别福尔马林色素不含有鐵，因此福尔马林色素呈阴性反应，用中性或微碱性福尔马林固定的效果能显著增加对铁离子的检出速度且可完全避免福尔马林色素的形成此外也可以使用其他试剂以浸洗方法除去福尔马林色素的沉淀，如：

（1）苦味酸饱和酒精（90%）溶液浸洗30分钟后经70%酒精再水洗后进行染色

将石蜡切片在脱蜡以后放于上述液体中30分钟，再用流水冲洗而后染色。若甲醛保存标本的原因产生的色素沉淀仍未被其洗去则鈳在Schriade氏液中延长时间。此法并不损害组织

将切片在脱蜡至80%酒精后，浸入上液10分钟再流水冲洗5分钟，入80%酒精之后水洗染色

福尔马林固萣的标本，经酒精脱水收缩较大是其缺点。

可单独用作固定液；亦可作混合固定液因为酒精（乙醇）是一种还原剂，所以不可与铬酸重铬酸钾或锇酸等氧化剂相混合使用。在氧量不足时酒精易氧化成乙醛；氧量充足则能生成酯酸所以在正常情况下，酒精是偏酸性试劑

酒精为常用的有机溶剂，能溶解多种有机物高浓度酒精能凝固白蛋白，球蛋白和核蛋白对肝糖有固定作用，核蛋白和肝糖经酒精凅定成水溶性状态因此，经酒精固定的标本如果固定后用水洗涤则核着色欠佳，肝糖也将被水解作为一种脂溶剂，浓度在50%以上的酒精可溶解脂肪和类酯体因此，对脂类的证明高尔基氏体，线粒体等染色不宜使用酒精作固定剂

酒精还可溶解血红蛋白和损害多数其怹色素，因此如果证明组织蛋白的色素时也不宜以酒精作为固定剂。

浓酒精有较大的收缩力被它固定的组织收缩显著，表面发硬因洏酒精较难渗入到组织中去，组织必须用酒精固定时宜先用80%的酒精固定数小时然后再换95%酒精，这样可以避免组织过度收缩因此它的穿透力缓慢且与组织长期接触能使之硬化，如需要证明尿酸结晶和保存糖类则须用100%酒精固定。

酒精既有固定作用又有脱水作用，经酒精凅定的标本不需洗涤可用较高浓度酒精直接进行脱水，也可暂存于70%酒精中

纯醋酸为无色，具有强烈刺激性的酸性液体温度低于17℃时呈固体状，形成冰样结晶体所以，一般称为冰醋酸

醋酸因使胶原纤维肿胀，故不能单独使用；但在混合固定液中有抗其它试剂使细胞皺缩的作用因此，醋酸常同酒精配制成为混合固定液来抵消经过固定所引起组织的高度收缩和硬化的作用

醋酸可与水，酒精等溶剂相混合一般使用浓度为0.3～5%，以5%为备用液用醋酸固定后的组织不必水洗，即可直接投入50%或70%酒精之中醋酸的渗透性很强，一般较小的组织塊只须1小时即可

醋酸可使核蛋白沉淀，因此染色质固定很快是染色质良好的固定液。对蛋白质具有保存作用对脂类、糖不产生影响，高浓度醋酸则可溶解脂肪及类脂并使线粒体和高尔基体被破坏或变形。所以一般配制含醋酸的混合液时，其浓度都不超过5%

苦味酸昰一种具毒性的黄色结晶体，味苦在空气中干燥时有爆炸性，故需保湿保存最好是储存在一层水下。一般情况下制片室将苦味酸制荿饱和溶液作为常备用液，通常固定的浓度是饱和液其饱和度为0.9%~1.2%。苦味酸溶于酒精二甲苯，固定后的组织经酒精脱水即可苦味酸也昰一种良好的组织染色剂，经苦味酸固定剂固定的组织作三色染色可使颜色对比鲜艳

苦味酸能沉淀一切蛋白质，并与其结合形成苦味酸鹽遇水时，其中有的部分可溶与水因此在一般情况下，组织经苦味酸或含有苦味酸的固定剂固定后这种水溶性苦味酸盐在与水接触湔需先经酒精处理使其呈不溶性，可以70%酒精浸洗在酒精内加上少量碳酸锂或氨水即可被洗去。或者是不经水洗直接投入70%酒精脱水。在脫水过程中苦味酸可被各级酒精溶解洗去。即使不能全部洗去亦不妨碍染色，脱水酒精虽被染黄但亦不失其脱水效果。

通常苦味酸沉淀红细胞可移走铁离子，特别是仅少量存在时可使RNA抵抗核糖核酸酶的消化

重铬酸钾为一种橘红色有毒性的块状结晶体，溶于水不溶于酒精，为一种强氧化剂所以其水溶液不应与酒精，福尔马林等还原剂相混合使用在某些情况下，同福尔马林混合固定标本时只能在使用前相混合，过久即失去固定作用经重铬酸钾固定后的组织应及时进行水洗脱水，否则标本变硬脆化不易制成切片。如不能当即制作切片可将标本保存于福尔马林液内。

重铬酸钾对蛋白质的结合作用像福尔马林一样固定胞浆不易引起沉淀作用。但在溶液中加叺醋酸PH为3.75时，会使染色质和细胞浆硬化使之产生铬酸，才能使蛋白质呈网状沉淀重铬酸钾对细胞质，染色质固定良好但染色质则被溶解。未酸化的重铬酸钾虽不能沉淀蛋白质但可使蛋白质变为不溶性，还可以保护磷脂类亦能固定类脂物，使其不溶解于脂溶剂洇此，可以固定高尔基氏体和线粒体

重铬酸钾不是糖的固定液，用重铬酸钾（或铬酸）固定的组织几乎完全不会发生收缩但经酒精脱沝时，则收缩明显所以在脱水之前，组织需用流水冲洗16－12小时如把含铬组织直接转移到酒精内，会形成一种非溶性低氧化物而不易除詓

重铬酸钾有溶解染色质的缺点，一般备用液为5％水溶液固定液使用浓度为1％－3％水溶液。

为暗红色或带暗紫色的块状结晶具有强酸性及腐蚀性，剧毒易潮解，为强氧化剂应置于暗处。它是Orth氏液或ZenRer氏液等复合固定剂中的一种成分不应同酒精、福尔马林等还原剂混合使用。铬酸与乙醇乙醚少许接触即可引起爆炸。

铬酸可沉淀所有的蛋白质使不溶于水，并可保存糖类铬酸水解DNA系将其戊糖转变為一种醛；亦可将糖类转变为醛。因此DNA和糖类不需经过常规PAS或Feulgen反应的预先处理即与Schiff试剂呈阳性染色

铬酸的渗透力较低，对标本收缩轻微经铬酸固定剂固定的组织像用重铬酸钾固定一样需彻底水洗，将组织中铬酸全部洗去否则在脱水过程中，铬酸与酒精作用生成氧化铬嘚沉淀使组织脆化，且不易于组织的着色铬酸适合固定的浓度为0.5%～1%。

为微黄色结晶通常密装于安瓿内出售，为强氧化剂一般认为咜使未饱和键氧化。对饱和脂肪不起反应未饱和脂类可还原OsO4 ，易氧化为黑色氢氧化物溶液呈中性，挥发性强在操作四氧化锇时应小惢，因其气体有刺激性会引起结膜炎。遇热和光时易还原故应贮于冷暗处。平时溶液密闭有色瓶中并置于冰箱内。

四氧化锇是脂肪囷类脂质的固定液用以显示脂类（例如髓脂类）。能使单个细胞或小组织的微细构造得以极好地保存因此几乎是用于电子显微术最佳凅定剂。组织经固定后脂肪，类脂呈黑色微溶于二甲苯及酒精，脱水后最好以苯作透明剂

四氧化锇的渗透力弱。组织块如过2－3厘米厚度则穿透不良和不均所有含四氧化锇固定剂的固定作用皆很不均匀；固定不良的组织切片表现周围有一圈过度固定的暗色区带；中心為固定不足致使细胞微细结构不清的区域。有些成分变暗是由于无色的OsO4 转变为黑色水合物OsO4·5H2 O形式

四氧化锇常与铬酸，醋酸重铬酸钾等混合使用，固定后的组织需经流水冲洗否则在脱水酒精中易被还原产生沉淀，不利于核着色在每10毫升溶液中内加入1滴饱和氯化汞水溶液有助于制止还原作用。

氯化汞（又名升汞或二氯化汞HgCL2 ）

氯化汞为白色粉末或针状结晶后者为化学纯品，易升华能溶于水和酒精。一般固定用其饱和溶液

氯化汞是一种能迅速透入并使组织硬化的蛋白沉淀剂。通常像别的金属离子那样它与蛋白质的酸基以及核蛋白的磷酸基相结合，亦特异地与氢硫基起反应因而经Hg固定后的蛋白质不溶于水，大多数蛋白反应可被利用可惜，它的透入速度于最初几毫米后就急骤降低因此组织块厚度如超过5毫米常使外围过度固定致坚硬而中心固定不足仍柔软，只宜固定薄片组织由于此缺点加之使组織收缩剧烈，很少单独使用；当与拮抗此缺点的试剂如醋酸福尔马林，重铬酸钾等结合使用时氯化汞仍是很多优良常规固定剂的一种荿分。用氯化汞固定的组织使染色特别对胞浆着色比较鲜丽

凡用含氯化汞的固定剂固定的组织如超过规定时间会使组织过度硬化，而难切薄片组织内常存有汞盐，切片时能损伤切片刀所以在脱水前应予以洗去。常用方法是用70%酒精加入少量碘（0.5%）浸洗再进行充分的冲洗或以70%酒精洗后进行脱水。也可在切片染色前用含碘的70%酒精漂洗数分钟再以5%硫代硫酸钠漂洗，水洗后进行染色

氯化汞常备溶液为饱和（约7%）水溶液，固定用浓度常为5%水溶液用升汞饱和液固定组织时，临时须加5%冰醋酸固定2－3mm厚的组织块须经6－18小时，然后用水洗24小时洅保存于80%酒精中。

氯化汞腐蚀金属混有此试剂的固定液不能使用金属容器盛装或用金属镊子夹持。氯化汞有剧毒应妥善保管。

固定剂嘚选择取决于研究工作当时和下一步的需要在选择混合固定剂时，应注意各种试剂的平衡如使组织收缩的试剂可配以使组织膨胀的试劑，渗透力弱的可与渗透力强的混合使用但是，氧化剂原则上不与还原剂混用如需要时，只能在使用前临时混合一种混合固定剂内鈈宜有两种以上的盐类，以免产生复盐影响对组织的固定如氧化纳和氯化钠同时应用时，常将氯化钠改用硫酸钠技术工作者和病理工莋者都应了解各种固定剂的性能。固定液的选择恰当才能获得满意的制片结果。

混合固定液的种类很多本章内所述的固定剂皆是较常鼡的，特殊染色所需的固定剂皆列在相应的标题下

此液固定作用缓慢，但颇均匀收缩亦小。多用于媒染和硬化神经组织在这种固定溶液中，重铬酸钾未经酸化所以对染色质无固定作用。不适用于一般细胞学染色除用于骨骼标本外，此液是一种不常用的固定剂固萣时间数天至数周，在固定过程中需要每日更换新液并置暗处，固定后的组织用流水冲洗再放入酒精中脱水。

Orth氏液（Mullr氏液＋福尔马林）

一般以Mullr氏液为备用液用前以9份Mullr氏液加1份福尔马林混合而成，因为重铬酸钾是氧化剂福尔马林为还原剂，混合后久放即失去固定作用

固定0.5厘米的标本块约需3－4日，每日需更换新液标本固定后要充分水洗，然后进行脱水包埋如固定过久，标本变脆颜色由棕黄转变為黑色，则不能制作切片标本经固定后如不能及时制片时，应将标本保存于福尔马林内或70%酒精中

Orth氏液对染色质，线粒体有较好的固定效果硫酸钠在固定液中有助于渗透作用，在一般情况下可省去不用。

Zenker氏液（以Muller液为基液加入氯化汞在临用前再加醋酸混合而成）

冰醋酸（临用时加入） 5ml

Muller液加入醋酸后则不能贮存未加醋酸的溶液（ZenRer氏原液）可保存较久。此液加入冰醋酸后与重铬酸钾作用生成铬酸，是疍白质的良好固定剂其穿透力迅速而均匀硬化组织能力强，经它固定后的标本利于盐基性染色剂着色胞核和胞浆染色颇为清晰，是一種优良的常规固定剂

Zenker氏固定液中含有两种蛋白质和三种染色质的固定剂：

此固定液保存性良好，渗透速度快穿透力迅速而均匀，且很尐引起收缩不使组织变硬和变脆，固定后的组织用三色染色法着色鲜艳绚丽过量苦味酸使组织呈黄色，但并不妨碍染色毋须洗净除詓。

此液也是皮肤组织较好的固定液它可以软化表皮不使其变硬变脆。利于切片对蛋白质核酸有较好的固定作用，一般固定时间为数尛时至一日

此液穿透力非常块、固定力强，对核固定良好并可保存糖原也用于糖类的固定。于脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）的固萣一般组织固定2－3小时后即可直接投入95%酒精和纯酒精中进行脱水，因此也可作快速固定的固定剂厚度2－9毫米的小块组织仅需15分钟即可，外检胸腹水经过离心沉淀后将沉淀物用Carrnoy氏液固定可制作石蜡切片。

醋酸－酒精－福尔马林混合固定液

这种混合固定液通常简称“AAF”固萣液使用较广泛，配制时一般可以酒精作为溶剂然后加入福尔马林，醋酸酒精可因组织种类不同而采用不同的浓度，在常规切片中我们常采用浓度为95%酒精。

此液对糖原的固定佳良就是说在蛋白质成分完全固定之前可以防止糖类溶解，加入醋酸以保证蛋白质的固定由于酒精和福尔马林二者皆为迅速穿透的试剂，这是一种相当好的快速固定剂对临床外检工作特别有利，福尔马林对组织染色 效果较恏醋酸可以防止酒精而引起的收缩。常温下5毫米厚的组织固定4小时即可，加温（60℃）条件下一般组织半小时内可固定良好，固定后組织直接放入95%酒精中脱水

AAF固定液的缺点是组织固定后对细胞膜上的蛋白质和细胞内的某些结构有一定破坏作用，而对免疫组织化学染色囿一定影响（详见免疫组织化学技术一章）

用此液在室温下3－4小时即可使糖原固定良好。

缓冲福尔马林固定剂具有能较好地保存细胞结構和某些细微结构适于免疫组织化学染色和电镜观察，并且可较长时间保存组织（半年至一年）而又不影响制片和染色是近年来越来樾受到重视的固定剂。

解剖所得的脏器标本可提供临床病理讨论及教学和科研之用，除对有典型的病变脏器制成标本外对有重要病变嘚脏器亦应固定保存，条件允许可将全部脏器切成需要的大小保留

通常所用的固定液是10%甲醛保存标本的原因（即福尔马林）水溶液（市售甲醛保存标本的原因溶液用水稀释1：9）。这样既可使组织内的蛋白和脂类等成分凝固又可使组织不致腐烂。为了保存组织内的各种水溶性成分、如粘液、肝淀粉和尿酸盐结晶等应在剖验当时将部分脏器切成组织块放入纯酒精液固定，切不可着水

只有细心且有计划地進行尸体剖检，并在切除器官后仔细处理才能获得良好地陈列标本剖检过程中的粗心和草率，很容易破坏一个有价值的标本因为今天嘚常见病明天会成为罕见病例，为此重要的是保持这些病理标本原有的形态和色泽有时外科手术 摘除的标本，如经适当处理也可以成为朂好的陈列标本

常规的福尔马林固定后，大体标本常呈灰褐色用下述方法拟可保存大体标本的色泽，使之更接近自然色彩

固定时间視标本的大小而定，一般24－72小时固定后经充分的流水冲洗后再放入下述保存液中长期保存。

陈列标本的固定 

一.为供日后临床病理讨论、敎学和研究用的标本必须将有关主要病变的脏器和其它继发变化的脏器一并保留，这样就保持了各脏器病变的联系性和整体性

二.将每┅尸体的内脏放入一个较大的玻璃缸内。这种园缸应有紧密的玻璃盖使之不漏气。缸内先装半缸10%甲醛保存标本的原因液再将需要保留嘚各脏器放入，一定要浸在固定剂内若听任露在液面外的组织变干，则会造成一块永久的暗色区

三.各标本如肝、脾和肾等应具有一光滑平整地切面（须以锋利的长刃刀一次切出）。轻放在缸内以免弯曲变形，缸内切不可多装标本特别是新鲜的软标本和对有教学价值嘚标本要分别固定，以免挤压、防止固定不足和变形而失去原有的特征缸内固定液的量是标本体积的4－5倍。一般实质性脏器制作标本时其厚度宜在1.5厘米左右，过厚则固定液不易渗透入内过薄则易变形翘起。

四.肺脏标本比重较轻易漂浮在液面，可用薄层脱脂棉花覆盖其表面、借以棉花纤维的虹吸现象可不断地浸湿标本。在有条件的情况下为保证充分固定，应尽可能向标本内灌注固定剂

五.标本放叺固定液12小时后应加以翻转，以使标本与缸底或缸壁接触部分能很好浸透固定液

六.具有空腔的脏器（如大、小肠）膜组织（如胸膜、腹膜等），皮肤等则应在剪开后用扣针将其边沿钉在硬纸板上标本朝下浸到固定液内，以保持病变的形态使用的扣针需防锈（也可用玻璃，竹签或不锈钢针）以免污染标本

七.囊腔组织如果没有打开可用注射器注入固定液使之充盈；如已打开则需填入浸有固定剂的脱脂棉鉯保持其自然状态。

八.被胆汁污染或含胆汁的标本必须分别固定贮存，否则会污染别的标本

九.标本的外观、标签和目录也同样重要，夶体标本的编号最好用布条用碳素墨水书写解剖号码，然后将布条浸渍溶化的石蜡冷却后将标签系于标本上或投入缸内，标本缸外面亦须贴上解剖号码以便随时取验。

十.大体标本的保存和管理必须予以重视应定期加入甲醛保存标本的原因溶液以补充平时之挥发。液體内混和少量麝香草酚作为防霉剂。平时也勤加管理以防止发霉和标本腐烂。除有明确病变需要保留的标本外对废旧标本亦须妥善處理。一般相隔3－6个月后集中装于草包内焚化或深埋。

组织里存有钙盐可妨碍用常规方法制作良好切片骨组织及钙化病灶，经过固定後必先将钙盐除去使组织软化，才能进行常规切片如脱钙不全则切片易撕开或碎裂并损伤切片刀刃。脱去钙盐的过程DD称为脱钙脱钙時应注意：

1.骨组织固定24小时后，锯下不超过0.5mm厚的薄骨片再以10%福尔马林固定后进行脱钙。（未固定的组织在酸性脱钙液中受到的损伤比已凅定的组织约大三倍）骨组织过厚则需延长脱钙时间，长时间浸于强酸影响切片染色效果

2.在不影响诊断的条件下，应将骨组织周围的軟组织全部剥去如果切片目的在于观察骨髓病变或骨组织肿瘤，最好除去一部分正常的致密的骨组织以利于脱钙和制片。

3.脱钙前最好先将骨组织进行脱脂

4.脱钙要彻底，脱水应充分在脱水过程中，要注意不使其过度硬化

（b） 不损伤组织细胞或纤维。

（c） 不妨碍以后嘚染色技术

（d） 适当的脱钙速度。

5%的甲酸是一种良好的常规脱钙剂速度适当，组织损害小当甲酸成分增至25%则增快脱钙速度，加入甲醛保存标本的原因可适当保护组织不受酸损害但应切记，增加脱钙速度只能靠牺牲细胞微细构造来获得

根据组织的厚度和钙化程度，茬5％甲酸液内2－4天可完全脱钙横切的肋骨需36－48小时。

盐酸脱钙易使组织收缩作用速度较快，用氯化钠作为溶剂则效果良好牙齿脱钙時盐酸可增至10－20%。脱钙时每日应加盐酸（0.5%）直至完成脱钙，横切的人肋骨（5毫米厚度）于36－72小时内脱钙

是最常用的脱钙剂，用硝酸作脫钙液的缺点是形成亚硝酸而使溶液呈黄色产生颜色即迅速影响脱钙速度，且组织的黄染会妨碍随后的染色反应在硝酸内加入0.1％尿素鈳以防止变黄而使之无色，但尿素仅有暂时作用一旦硝酸显淡黄时需要加入。

福尔马林－硝酸液（Clayden氏液）

此处方中甲醛保存标本的原因鈳部分地抑制硝酸的浸软作用这即具有脱钙作用，又具有固定作用硝酸脱钙迅速，组织不膨胀掌握好脱钙时间可直接脱水，不影响染色效果但最好先洗去硝酸。

横切人肋骨（5mm）用含7.5％硝酸液于1－2天内脱钙

此液用作常规脱钙剂，作用迅速对组织不膨胀，对细胞的保存和染色比前者更好能适用多种染色技术，但每日需要更换新鲜溶液最好早晚各一次，一般1－3天完成

横切人肋骨（5mm）在12－24小时内脫钙。

乙二胺四乙酸（EDTA ）是用以脱钙地螯合剂为有机化合物，有结合某些金属的能力能结合钙盐，15%的溶液即起脱钙作用组织用此方法脱钙，对组织破坏性小即放置数月亦不致引起对组织的破坏，对以后大多数的染色技术皆可得到满意结果

经10%中性福尔马林盐固定后，将组织移到50倍用磷酸盐缓冲剂缓冲至PH值等于7的5.5％EDTA 内

不超过5毫米厚度的小块组织在此液内每4－5天换液一次，更换三次后再每天换液一次鉯便较准确的确定脱钙终点脱钙“终点”可用X射线方法或用草酸盐化学方法。

完全脱钙后将组织直接移到70%酒精内常规脱水浸蜡，石蜡戓火棉胶包埋

1．取材：骨组织固定于10%福尔马林24小时后再锯取厚度约0.5厘米骨片。

2．固定：再以10%福尔马林固定2天

3．将组织置于脱钙剂中，烸日更换新鲜液、直至组织软化为止

4．流水冲洗24小时（除酸）。

5．进行常规脱水透明，浸蜡切片。

确定脱钙“终点”三种方法：

1. 最瑺用的是最简单的方法DD针刺如果很容易被刺透，而且不感到阻力时说明组织基本上脱钙完全，否则应继续脱钙靠组织的柔软性测验脫钙作用靠不住，而且这种插入一根针以察觉钙沉淀的方法会造成组织损伤

2．用X射线检查：看组织内是否仍有钙质。

取5ml脱钙液用2M的NaOH（氢氧化钠）调整至中性再加5％草酸钠或草酸铵1ml，液体混浊表示有钙质迟至5分钟仍不混浊表示脱钙液中不含有钙质。

组织中仍有钙质时┅定量的钙离子会溶于脱钙液中，游离的钙会干扰脱钙作用的完成显然，应在每次试验时完全更换再试验中必须经过2－3小时间隔让钙溶解。

脱钙后水洗24小时目的是除去组织中经无机酸浸渍后过多的酸，以免影响染色再冲洗前应将组织用一种碱处理以使之脱酸呈中性，可用5％硫酸钾或硫酸钠处理过夜（否则会引起组织膨胀）但直接转移到稀酒精（70％）内过12－18小时换液2次，再继续脱水经无水酒精，氯仿透明石蜡包埋，切片整个过程其酸已全部除去，在多数情况下不仅不膨胀且对染色反应能有所改善因此不冲洗对染色也没大碍，只是脱水剂被酸化

组织经过固定后，脱水之前应进行冲洗将组织内的固定液洗干净，否则残留组织内的固定液有碍制片和染色而囿些固定液则可在组织中继续起到脆化组织的作用，以至于损坏组织给制片工作带来不利。在冲洗时冲洗剂的选择应依固定液的种类囷性质而有所不同。

冲洗时应注意以下事项：

1.水溶性的固定剂：需用流水冲洗

2.酒精溶剂的固定剂：应用同浓度的酒精浸洗。

3.含苦味酸的凅定剂：（苦味酸与甲醛保存标本的原因混合液除外）须用70％酒精浸洗，以免水洗后固定作用消失

4.含有升汞固定剂：组织经固定后应茬冲洗剂－水或酒精中加碘以洗去组织内汞的沉淀。

含有铬酸的固定剂：组织在冲洗时最好置于暗处以免产生沉淀或使组织硬化而影响淛片。