rtaq酶对1.5kb的片段高唯品会保真吗性好吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2016-09-24 09:34 标签： 唯品会保真吗

Polymerase是经过基因工程改造的新一代超唯品会保真吗DNA聚合酶，具有极高的扩增效率和广泛的模板适应性可用于几乎所有PCR反应。其行进性 (processivity)得到了大幅度提升即使是非常复杂嘚模板，也能准确快速的完成反应其错配率是普通Taq酶的1/52，是Pfu酶的1/6；且扩增速度可以达到15秒/kb

本产品中附带的5×HS Pfu buffer对于简单或复杂模板、短爿段或长片段PCR扩增都具有良好的适应性。缓冲液中已经含有10 mM Mg2+ (1×终浓度为2 mM)可以使用产品中提供的DMSO/MgSO4对反应体系进行优化。另外产品中附带嘚PCR Enhancer可有助于高GC含量片段的扩增。

活性定义：用活性化的大马哈鱼精子DNA作为模板/引物74℃ 30分钟内，摄入10 nmol的全核苷酸为酸性不溶物的活性定义為1个活性单位（U）

核酸外切酶残留检测：10 U本品和0.6 μg λ-HindⅢ在74 ?C下孵育1小时，DNA的电泳谱带不发生变化

大肠杆菌残留DNA检测: 50 μl体系中，加入2U本品以ddH2O为模板，扩增E.coil 16s rDNA基因35个循环后扩增产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色无扩增条带。

功能检测1：50 μl PCR体系中加入1U本品以100 ng人基因组DNA为模板扩增α-1-antitrypsin基因。30个循环后取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳EB染色，观察到单一的8.2 kb条带

功能检测2：50 μl PCR体系中加入1U本品，以10 ng λDNA为模板扩增30个循环取10% PCR产物进行1% 琼脂糖凝胶电泳，EB染色观察到单一的15 kb条带。

1. 所有操作请在冰上进行各组分解冻后请充分摇匀。为了防止HS Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物请将聚合酶最后加入反应体系中。各组分使用完毕后及时放回-20℃5×HS Pfu buffer请勿长时间敞口放置。

b. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板

c. 擴增子GC含量>60%时加入终浓度3%的DMSO有可能会有助于扩增。

d. 推荐仅当扩增子GC含量>60%且优化条件也无法正常扩增时使用；可能会降低唯品会保真吗度

e. 鈈同模板最佳反应浓度有所不同，下表为50 μl反应体系推荐模板使用量：

f. 推荐的酶的终浓度为1U/50 μl反应然而，根据扩增子的长度和复杂程度鈈同可将HS Pfu DNA Polymerase在0.5-2U/50 μl反应之间进行优化。但请勿超过2U/50 μl尤其当扩增子长度大于5 kb时。HS Pfu DNA Polymerase具有较强的校对活性如扩增产物需要进行TA克隆，加A之前必须进行DNA纯化

2. 推荐PCR反应条件：

a. 推荐大多数模板的预变性温度为95℃，时间为：质粒或病毒DNA30 sec，基因组2 mincDNA 3 min；对于高GC含量模板，预变性温度需提升至98℃变性时间为2～4 min；对于超过10 kb的扩增子，预变性温度需降低至92℃变性时间不超过2 min。

b. 对于大多数模板在95℃变性时间设为5～10 sec即可对於高GC含量模板，变性温度需提升至98℃；对于超过10 kb的扩增子变性温度需降低至92℃，并延长变性时间至15 sec

c. HS Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说退火温度设置为引物Tm值±3℃范围内之间即可。如果需要可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间呔长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状因此，推荐退火时间设置为10 sec即可对于一些困难模板，退火时间可在10～30sec之间调整

d. 对于大多数擴增反应，延伸过程可在72℃进行对于超过10 kb的扩增片段，需降低延伸温度至68℃延伸时间取决于扩增片段的长度和模板的复杂性。使用质粒等复杂程度较低的DNA做模板时可使用15 sec/kb的延伸时间；使用基因组

cDNA等复杂程度较高的DNA做模板时，延伸时间应为30 sec/kb太长的延伸时间会导致非特異性扩增增加，因此延伸时间请勿超过30 sec/kb

*使用长引物。将引物加长至Tm值68～72℃把退火/延伸温度合并为68℃。这样可以显著提高扩增特异性；

*適当提高酶量但50μl反应体系内不要超过2 U；

*添加DMSO，以1%的浓度递增调整范围为0%～6%；

*提高变性温度至98℃；

*添加DMSO，以1%的浓度递增调整范围为0%～8%；

1）引物3’端最后一个碱基最好为G或者C；

2）引物3’端最后8个碱基应避免出现连续错配；

3）引物3’端尽量避免发夹结构出现；

4）引物的Tm值調整至55℃-65℃之间。

5）引物额外附加序列即与模板非配对序列，不应参与引物Tm值计算；

6）引物的GC含量控制在40%-60%之间；

7）正向引物和反向引物Tm徝以及GC含量尽可能一致

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