Primer Premier 6.0使用方法(设计引物) - PCR实验 - 生物秀
标题: Primer Premier 6.0使用方法(设计引物)
摘要: [Primer Premier 6 0使用方法(设计引物)] 各位老师，我想使用Primer Premier 6 0，设计引物，请问这个软件怎么用啊，谢谢！ 关键词:[设计引物]……
各位老师，我想使用Primer Premier 6.0，设计引物，请问这个软件怎么用啊，谢谢！
请参考:Primer Premier 5.0的使用技巧简介！（张新宇，高燕宁*，中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）2.1.1 功能“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（）、语音提示键盘输入（）等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种亚结构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（Ciliate Macronuclear）、无脊椎动物(vertebrates)线粒体（Invertebrate Mitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（Plant Mitochondrion）、原生动物线粒体（Protozoan Mitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物(vertebrates)线粒体（Vertebrate Mitochondrion）和酵母线粒体（Yeast Mitochondrion）。2.1.2 使用步骤及技巧“Premier”软件启动界面如下：其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时，点击 按钮，界面如下：回复
其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新限制性内切酶或基元。进行引物设计时，点击"Primer" 按钮，界面如下：进一步点击 按钮，出现“search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目的（Seach For）有三种选项，PCR引物（PCR Primers），测序引物（Sequencing Primers），杂交探针（Hybridization Probes）。搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物（Sense/Anti-sense Primer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游引物为主（Compatible with Sense/Anti-sense Primer）。另外还可改变选择区域（Search Ranges），引物长度（Primer Length），选择方式（Search Mode），参数选择（Search Parameters）等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然后按 ，随之出现的Search Progress窗口中显示Search Completed时，再按 ，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分为100，即各指标基本都能达标（如下图）。回复
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“Peimer Premier”主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引发情况（False Priming），及上下游引物之间二聚体形成情况（Cross Dimer）。当所分析的引物有这四种结构的形成可能时，按钮由 变成 ，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有 ，只有 。值得注意的是中间一栏的末尾给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击 ，然后修改引物序列。若要回到搜索结果中，则点击 按钮。如果要设计简并引物，只需根据源序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是一个相当不错的软件。回复好东东回复好东西
谢谢分享回复 v回复楼主问的是primer premier 6.0的使用方法，没回答啊。。。。
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求助，这样坑爹的序列怎么设计引物啊？
楼主最近做基因克隆，刚刚开始就遇到困难。这个序列太坑爹。GC含量偏低，CDS前的序列碱基分布又很不平均，到现在都没克隆出来，求助各位！不胜感激。
这是这个序列的全序列，红色部分是CDS。全序列1304bp,CDS1008bp。PCR反应条件95℃，5min。95℃，30s.退火温度做的梯度，30s.72℃，1min30s。72℃，10min。33个循环。反应体系总体积25ul:buffer2.5ul.引物各1ul(浓度10umol).模板1ul.dNTP 2ul.Taq 0.3ul.其余用水补齐。
& & 这段序列在设计时，常常难以达到符合引物设计原则的GC含量标准，好不容易上游引物找到GC含量和退火温度合适的，却又是在“AATTACTCTCTCTTTCTCTCTCCCCTCCTCCTTTATATAA”和“ATTAACAGAGAGAGAGAGAGAGAAGCATAGCA&这样的区域里，这样区域里的引物能用么？
啊啊啊啊.png
我需要克隆的是cds，引物设计已经在目标序列上下游增加一段设计引物了（但还没有长到500bp范围的序列），选择的是宝生物的ex taq 酶，梯度PCR也做了，还是克隆不出来（任何条带没有，只有微弱的引物二聚体），我不知道自己是否该选择高保真酶,，反应体系应该怎么调整呢？实验室经费比较苛刻，压根不敢考虑直接合成吖:cry:
我们实验室克隆基因都是先针对CDS进行引物设计，扩增出来后切胶回收再连接T载体，测序正确后再增加酶切位点，连接表达载体～我现在是CDS扩增不出来，用的是宝生物的EX Taq，没有条带或者非特异条带，请问我该怎么调整反应体系呢？或者换高保真酶？
请问你是如何将退火后的升温调慢的？你的试验结果如何？
我用过KOD酶，也用过KOD-plus，都可以扩出来，你就按照KOD酶说明书上的体系来就可以，程序按照你的引物Tm和片段长度来，KOD和plus都是一分钟差不多延伸1000bp~~
哎，关键是现在扩不出来目的条带吖。梯度PCR也做了～
这样子的话，是不是多考虑在上下游各自多出来的200--400序列范围内设计引物，最关键的参数是TM56--65℃；别的参数都是次要的；
PCR仪可以设定，有个ramp参数，每一步的都可以单独设定，我碰到的几种PCR仪都有这功能的。然后我设的是变性到退火的降温、退火到延伸升温都是设的0.5度/min。设变性到退火步骤是因为我看跑梯度的时候变性到退火的温度变化很慢，花了很长时间。升温步骤是eppendof的pcr仪说明书上说的降低速率有用，所以我把两个步骤都设了。那次的结果还比较好，我先前用同样的模版没扩出来，那次扩出来了。但是我换模版后面一直没弄出来，我是在做酵母的菌落pcr，模版真心不好弄，所以不知道是不是只是模版原因，没有用先前的模版做阳性对照，说起来我是应该做个阳性对照的啊。。。
不知道说清楚了没，设定的最好找pcr说明书看看
因为我的序列GC含量低，退火温度一直上不去，引物合成单上都没有超过60摄氏度的～:cry::cry:而且很容易有引物二聚体或错配
那你这个稍微有些复杂了；
错误引发只要不影响你目标带，可以不去考虑；
引物二聚体的上限，是你的目标带能出来，且足够你下游使用即可；
3‘端稳定性什么的，就不用考虑了；
完美的引物，哪有那么多？
引物达到一定长度比如25bp，基本上那个说的TM还真的只能做参考了，到了这个长度如果说的TM还很小，其实或许用55度或更高些的温度也还能扩出来
已经更换过模板，模板应该是没有问题的，已经用相同的模板克隆出其他基因了~~另外这个基因做过表达量分析，还是取表达量最高时期提取的模板
用定量的PCR引物做一次，看看能不能扩增出来。
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