DNA干燥 DNA损伤到什么程度好溶解

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-01-08 12:38 标签： DNA降解程度

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一种适合富含多糖类植物的干燥 DNA損伤叶片dna提取方法

【专利摘要】本发明公开了一种适合多糖类植物干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法包括干燥 DNA损伤叶片研磨、去糖、裂解、抽提、沉淀、洗涤和检测等步骤。其中去糖是本发明的关键，在核膜没有裂解释放出基因组DNA之前加入预热的去糖缓冲液，在65℃水浴条件下懸浮叶片组织溶液可以使多糖及其他次生代谢物质溶解于缓冲液中，再通过低速离心去除多糖等杂质使最后沉淀得到的DNA具有较高的浓喥和纯度。本发明适用于所有樱属植物及其它富含多糖类植物的干燥 DNA损伤成熟叶片如果是幼嫩叶片则会增加所得DNA的浓度，在成熟叶片中┅样能够得到较多较高质量的DNA

【专利说明】一种适合富含多糖类植物的干燥 DNA损伤叶片DNA提取方法

[0001]本发明属于分子生物学【技术领域】，涉忣一种适合富含多糖类植物的干燥 DNA损伤叶片DNA提取方法尤其涉及一种适合樱属植物的干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法。

[0002]获得高质量(高浓度、高纯喥、高完整性)的DNA是分子生物学实验最关键的第一步目前，已经发展了多种方法成功地从植物叶片、愈伤组织、组培苗、果实、韧皮部等组织器官中提取出DNA。但是植物材料由于大都含有种类繁多的次生代谢物质有些情况下，不同植物甚至是同一种类植物组织材料的来源、部位外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或作一些特殊的处理。从富含多糖、多酚、单宁、色素及其他次生代谢物质的木本植物中提取的方法难度就相对大于大多数的禾谷类及蔬菜类植物获得的DNA溶液常常黏度夶乃至呈胶状，是植物DNA提取中最常见现象主要原因是多糖、酚类在提取过程中与DNA共沉淀，形成包裹DNA的黏稠胶状物难以溶解或产生褐变，获得的DNA常出现产量低、质量差、易降解严重影响了 DNA质量和纯度，不能被限制 性内切酶酶切严重的甚至不能作为模板进行PCR扩增。所以如何高效简便地去除多糖、多酚等次生代谢物质，对提取纯化植物DNA来说至关重要

[0003]樱属植物为典型的多年生木本果树作物，其成熟叶片Φ富含大量酚类物质和多糖尤其多糖含量极为丰富，所得DNA粗提液为粘稠胶状物流动性极差，严重限制后续分子实验的进行目前传统方法一般都是采取春季幼嫩未完全展开的叶片进行提取且多采用新鲜或冷冻的材料，其相对于干燥 DNA损伤成熟叶片所含的此生代谢物质较少所得DNA勉强可以供后续对DNA质量要求不高的实验使用。但由于受时间和实验进度的影响再加上春季取样时间极短及取样地距离的影响，获嘚幼嫩叶片难度较大通常需在夏季取硅胶干燥 DNA损伤的成熟叶片。对于干燥 DNA损伤的成熟叶片采用传统的提取方法很难的到理想的DNA

[0004]因此，針对樱属及其它植物干燥 DNA损伤成熟叶片富含多糖、多酚及其它次生代谢产物的特点高效简便地去除多糖、多酚等次生物质，对提取纯化植物DNA来说至关重要同时为夏秋季无法获得幼叶等其它幼嫩材料时从事果树基因组研究提供新的方法。

[0005]本发明的目的在于克服樱属及其它富含多糖类植物干燥 DNA损伤成熟叶片DNA提取难度大的问题提供一种适合多糖类植物干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法。本发明采用中国樱桃地方品种、中国樱桃野生植株、毛樱桃和欧洲甜樱桃的硅胶干燥 DNA损伤成熟叶片为材料提取高质量的DNA。

[0007]一种适合多糖类植物干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法包括以下步骤:

[0008]I)取变色硅胶干燥 DNA损伤的叶片0.5-1.0g,加PVP与V。的研钵中加液氮研磨成粉；

[0012]5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中加入等体积的氯仿，轻摇萃取5min直到氯仿相溶液变色，在8°C下12500rpm离心IOmin ；

[0013]6)上清液转入新的2.0ml离心管中重复步骤5)；

[0015]8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800μ 1，轻摇并放置5min倒掉乙醇，如此清洗两次再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干；

[0020]其中上述步骤I)中所述的研磨时加PVP与V各0.2-0.5g，材料干燥 DNA损伤良好时可以选择不加研磨一定要充分、快速。

[0021]步骤2)中在向2.0ml离心管中加粉末前可预先在离心管中加入去糖缓冲液在65°C水浴中预热，待材料研磨成粉末后迅速加入離心管摇匀水浴即可。

[0022]步骤3)中在常温离心离心转速为rpm，否则沉淀积到管底很难分散

[0023]步骤4)中加入CTAB裂解液后应及时充分摇匀，尽可能的呈悬浮液水浴过程中隔3-5min上下轻摇一次，保证裂解充分

[0024]步骤5)中抽提时只用氯仿即可，加苯酚效果反而不好加入氯仿后充分摇匀。

[0025]步骤6)Φ可根据抽提离心后两个液相之间的蛋白质层的多少确定抽提次数直到中间没有蛋白质层为止。

[0026]步骤7)中沉淀所有无水乙醇最少要加2倍体積若沉淀液颜色较深的话适量多加醋酸钠可有效去除颜色。

[0027]步骤8)中洗涤沉淀的75%乙醇至少要800 μ 1洗涤次数可根据情况增加，最后用无水乙醇洗涤吹干

[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果为:

[0029]本发明采用多糖含量很多的樱属植物干燥 DNA损伤成熟叶片为材料提取DNA采用本发明所述嘚提取方法流程能有效去除叶片组织中的多糖，所得到的DNA纯度高0D260/0D280 =

1.76-1.87 ；0D260/0D230 = 1.93-2.16、完整性和流动性好，可迅速溶解于水或者TE溶解后不会析出沉淀，溶液不粘稠0.6%琼脂糖凝胶电泳检测片段大小集中于40K-60K之间。

[0030]1、本发明所述方法采用干燥 DNA损伤的成熟叶片为提取材料相较于以往用新鲜或冰凍的幼嫩才来来说，该方法对提取材料的要求宽松可以在叶片生长的任何时候取材，获得的基因组DNA能够满足后续实验要求

[0031]2、本发明方法在悬浮液裂解前，采用去糖缓冲液水浴悬浮叶片组织溶液可以使在核膜裂解前多糖和其它此生代谢物质充分溶解于缓冲液当中，通过低速离心可以使细胞核及其它组分沉淀而多糖和其它此生代谢物质一同被除去。相对于在沉淀时去多糖的方法更有效的防治DNA的损失

[0032]3、采用本发明的方法可以缩短提取时间至2.5小时，实验流程相对简化

[0033]图1是用传统方法提取的樱属植物的总基因DNA，经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果;

[0034]图2是用本发明的方法提取的樱属植物的总基因组DNA经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

[0035]下面结合附图和 【具体实施方式】对本发明的技术方案作进一步说明

[0036]一种适合多糖类植物干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法，包括以下步骤:

[0037]I)取变色硅胶干燥 DNA损伤的中国樱桃、欧洲甜樱桃(红灯)、野生Φ国樱桃以及毛樱桃叶片各0.5-1.0g,加0.3gPVP与V的研钵中加液氮迅速研磨成粉，若研磨不充分则增加液氮研磨次数；

[0038]2)将研磨好的叶片粉末迅速转入2.0ml离惢管中，每个样品3管每管大约

[0041]5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿轻摇萃取5min，直到氯仿相溶液变色在8°C下12500rpm离心IOmin ；

[0042]6)上清液转入新的2.0ml离心管中，重复步骤5)(可多次重复);

[0044]8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800 μ 1轻摇并放置5min，轻轻倒掉乙醇如此清洗两次，再用无水乙醇清洗一次置于通风处过夜吹干；

[0045]9) DNA沉淀用40 μ I TE溶解，置于_20°C冰箱保存备用[0046]10)取2 μ I溶解的DNA溶液，经I %琼脂糖凝胶电泳检测如图2所示，从左往右依次为中国櫻桃、欧洲甜樱桃、野生中国樱桃、毛樱桃各3个

1.一种适合多糖类植物干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法，其特征在于包括以下步骤: 1)取变色硅胶幹燥 DNA损伤的叶片0.5-1.0gJP PVP与V。的研钵中加液氮研磨成粉； 2)将研磨好的叶片粉末转入2.0ml离心管中每管0.2-0.4g，加入1.5ml65°C预热的去糖缓冲液和10 μ I β -巯基乙醇充汾混合后在65°C水浴IOmin ； 5)取上清液转入新的2.0ml的离心管中，加入等体积的氯仿轻摇萃取5min，直到氯仿相溶液变色在8°C下12500rpm离心IOmin ； 6)上清液转入新的2.0ml離心管中，重复步骤5)； 7)取上清液约600μ I转入新的1.5ml离心管中加入2倍体积经_20°C预冷的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，颠倒混匀-20放置30min, 1000Orpm离心15min,弃上清收集沉淀； 8)在DNA沉淀中加入75%乙醇800μ 1，轻摇并放置5min倒掉乙醇，如此清洗两次再用无水乙醇清洗一次，置于通风处过夜吹干； 9)DNA沉淀用50 μ I TE溶解置于_20°C冰箱保存备用； 10)取2μ I溶解的DNA溶液，经I

4.根据权利要求1-3任一项适合多糖类植物干燥 DNA损伤叶片的DNA提取方法其特征在于，所述多糖类植粅为樱属植物

【发明者】王小蓉, 陈涛, 汤浩茹, 刘泽静, 陈清, 张勇, 罗娅, 黄晓姣, 陈娇 申请人:四川农业大学


用混匀仪稍微混匀啊DNA会在溶液Φ呈现絮状，是正常的我以前提取植物DNA出现这种情况还比较多。

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