自身对照法测有关物质，特定杂质（对照品只有纯度）方法学验证怎么做？
各位老师，我现在做一仿制原料药，有关物质采用不加校正因子的主成分自身对照法，有一个特定杂质，采用相对保留时间来定位，该杂质对照品为国外试剂公司购得（量少，10mg），只有...
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[求助]有关物质分析方法验证-精密度实验（重复性）
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[求助]有关物质分析方法验证-精密度实验（重复性）
CDE电子刊物“有关物质分析方法验证的可接受标准简介”项下
　　配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。
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比如，我现在有个原料药，无杂质对照品（无已知杂质，故标准也未规定已知杂质限度），最大单一杂质约0.1%，总杂质约0.5%，供试品测定浓度为1mg/ml，1%自身对照溶液，需要做该项实验时，你们是怎么做的呢？最好写出稀释方法和计算方法，看看我们的理解是否有出入？谢谢！查看完整版本请点击这里：
summerxx ( 17:39:49)
这个含量测定的结果可以计算出你的杂质的百分比。其主要目的是要验证你的方法是不是对于相同的样品有相同的测定结果。
对于用自身对照方法做的杂质限度检查，一般我配制样品及自身对照各一份，然后分别测定6次（一一对应），然后计算杂质含量，后计算RSD%。
any333 ( 17:40:22)
首先看定义：
精密度是指再规定的测定条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。
重复性是指，再同一条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度。
这个文章出来的时候就咨询过药检所的老师，此重复性的要求针对的是杂质的定量测定，如果没有杂质对照品时，我们做的就是限度检查，限度检查的基础是”限度“，与限度的响应A（峰面积）比较，重复性一般是配制1份0.1%的重复测定6次，对A进行统计，即可；
定量测定的基础是杂质的”含量“，既用杂质对照品测定杂质的含量，此时的重复性与含量重复性的做法一致。
做法一：可按上面提到的要求再换另一人员使用不同仪器同法测定与前面的合为中间精密度。
做法二：也可同一样品测定6次作为重复性，再行测定2仪器2人员的中间精密度。
个人建议“：供试品1mg/ml，自身对照分2个，一为0.1%的自身对照溶液--》限定单杂，二为1%的自身对照溶液--》限定总杂。
is2011 ( 17:40:45)
我的理解是这么做：
（1）有杂质对照品的。
配制杂质对照品储备液和供试品储备液。
按照限度分别取储备液适量，定容摇匀，平行制备6份；也可以按照80%，100%，120%，制备成3*3，进样。进杂质对照品，然后计算其含量及RSD值。
（2）没有杂质对照品。
按照楼主说的用自身对照法，可以配制6份供试品溶液，分别制备其1%对照溶液，然后进针，计算即可。
再说两句：
1，重复性是指，在同一条件下，由同一个分析人员测定所得结果的精密度，所以最好能体现你的整个操作过程。
2，杂质不是独立存在的，它始终是和API在一起的，所以，在做方法学这块，需要注意。
c86v ( 17:41:19)
我们本着尽量多做的原则，是这样做得：
没有已知杂质只要求单一杂质的时候，我们分别1%，供试品平行6份，进样。考察重复性。
再分别用单杂浓度和1%各进6针，考察精密度。
还有，为什么药丸那个例子里总杂为0.5%，但是用的1%对照呢？为什么不用0.5%对照呢？
pencil菲 ( 17:41:38)
楼上的大娘：用0.5%的也可以，1.0%的也可以，最终取决于你的总杂质限度，如无特别情况一般为1%即可。
药丸选择1.0%是按照一般情况，最大单一杂质约0.1%，总杂质约0.5%，至少5个以上的杂质，考虑到稳定定性放置过程中的增加量，估计将高于0.5%，加上目标国家对总杂质的量一般控制为1.0%，一般使用1%的对照溶液做限度控制较好，当然可以规定不超过0.5%的2倍，意义也不大。
c86v ( 17:42:04)
楼上的大爷，我是这样想的，最后定的杂质限度肯定是经稳定性考察的，既然定0.5%就表示在有效期内总杂不超过0.5%。虽然一般使用1%对照做限度控制，但是也要根据具体情况，我认为如果总杂质为不超过0.5%，对照选用0.5%更合理。
pencil菲 ( 17:42:31)
我没看出是稳定性考察完了的，人家貌似在做方法学研究。
你的限度订多少就用多少的对照，如果你愿意你可以订不得检出任何杂质，只要你能保证最终样品合格。
药丸的杂质0.5%，最大的0.1%，很可能有7、8、9个以上，每个增加一些你还能保证在0.5%么，你可能是说，最后0.5%所以用0.5%的，但你在研发之处怎么知道最后0.5%，还停留在早期的编造思路上么？总杂质是根据单杂的量与个数订的，前面做了几个品种，杂质数量均在3个及以下（各种破坏、影响因素考察等），此时我完全没有必要订成1.0%，因为单杂0.1%卡在那里3个杂质总共也不能超过0.45%否则就不合格了，因此此时订1.0%没有必要及意义。你的思路应该做定量测定，稳定性考察完毕了，知道杂质含量小于0.5%所以再研究0.5%杂质限度的自身对照方法学，实际上目前大部分开始就设计的是限度测定，要知道限度测定中你推算出来的0.X%不是真正的杂质含量。
如果总杂质不到0.5%就订0.5%，那没有杂质就订不得检出么？
限度检查就是：多少的限度就与多少的对照进行比对。定量测定原则是对照一般不超过样品浓度的2倍。你也可以做半定量测定，0.1%、0.5%、1.0%等各种对照，一般常用于TLC。
c86v ( 17:51:37)
我没看出是稳定性考察完了的，人家貌似在做方法学研究。
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问题就出在我说的是定标准，您老说的是方法学~
yjf1026 ( 17:52:03)
CDE电子刊物“有关物质分析方法验证的可接受标准简介”项下
　　配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。
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其实我们之前的做法和“悠云水塮”、“晴天1210”老师的差不多，由于某种原因，今天又细看了一下，看得越久，疑问又多，比如：
1,杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液
－－为什么一般为0.1%？这个0.1%是指总杂质还是单一杂质？如果我的样品实测总杂质结果约为0.5%（供试品浓度为1mg/ml，采用1%自身对照计算）时,配制该供试品溶液时的浓度应该是多少？就是1mg/ml还是稀释5倍？还是......
2,6份供试液含量
－－“供试液含量”到底是指主药的含量还是杂质的含量？是用已知的方法（比如1%自身对照计算杂质）计算还是配制对照品按外标法计算主药的含量？
是我语文没学好？
另，飞鸡和1984讨论的问题我得好好看看才行，目前，我没有想得那么多，反正一般的情况下，比如杂质一般小于1%时，不管实际测得值是0.1%还是0.5%，我制定标准时自身对照一般都是1%，如果稳定性研究发现，有明显增大或将超出制定的限度时，会将杂质限度增大，但自身对照还是采用1%，因为这并不影响我的检测方法的准确性......
tie8 ( 17:52:26)
化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则上关于重复性:
重复性系指在同样的操作条件下，在较短时间间隔内，由同一分析人员测定所得结果的精密度。
重复性测定可在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，如制备3个不同浓度的试样，各测定3次，或100％的浓度水平，用至少测定6次的结果进行评价。
个人观点偏向于,没有杂质对照品的情况下,用1%自身对照法测定有关物质6次.
ending ( 17:53:01)
1,杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液
－－为什么一般为0.1%？这个0.1%是指总杂质还是单一杂质？如果我的样品实测总杂质结果约为0.5%（供试品浓度为1mg/ml，采用1%自身对照计算）时,配制该供试品溶液时的浓度应该是多少？就是1mg/ml还是稀释5倍？还是......
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0.1%指的单个杂质，如果某一单个杂质的量大于0.1％，一般会被要求做鉴定（具体见《化学药物杂质研究技术指导原则》或附图）。供试品溶液配置成1mg/ml，对照溶液稀释100倍（按您的方法规定，估计版主的原料是个6类吧）。然后根据峰面积进行计算
ending ( 17:53:24)
[2,6份供试液含量
－－“供试液含量”到底是指主药的含量还是杂质的含量？是用已知的方法（比如1%自身对照计算杂质）计算还是配制对照品按外标法计算主药的含量？
==================================================
前一句话不太懂（长期语文不及格，^_^）；
用已知的方法（比如1%自身对照计算杂质）计算，按方法规定。
公式见我先前发的帖子
不正之处，还请各位老师指正！
新年第一帖，祝dxyers及家人新年快乐，身体健康！
附图忘记了，现在补上，嘿嘿！
langlang ( 17:54:07)
小结一下：
　　配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。
1、设定0.1%浓度是大于0.1%的单杂应该做鉴定，进行定性分析，确定其化学结构，故对原料合成精制提出比较高的要求。
2、有定量要求的杂质检查，做法是：分别配置杂质对照品储备液与供试品储备液，然后取供试品储备液适量稀释定容，平行制备6份，进样，再进杂质对照品，计算含量及RSD。
3、无杂质对照品的限度检查：配置6份相同浓度的供试品溶液及对应的对照溶液（浓度可以是1%或者0.5%或者2%，这个根据具体品种和要求制定），分别进样，分别计算含量及RSD。
实际上感觉就是：不管是外标法还是自身对照法做重复性试验，和做含量的重复性一样。配对照，测6份相同浓度的供试品溶液，含量的RSD应符合相应要求。
云端ing ( 17:54:30)
看了这么多，我出现个问题？
我做的品种有个已知杂质（有标准品）；但是杂质是自身对照，我实际都是主药（标示物）的重复性和精密度；而不是已知杂质的？思索中。
我的已知杂质国内外药典中并未单独限定限度；只有单杂和总杂。思索中。
huifeng0516 ( 17:55:02)
我认为可以把它列入自己标准的已知杂质，但其限度不能超出ICH的规定，然后配6个100%的样品和1%的对照，计算含量和RSD。这块内容真是费解，有个项目，药典里定了好几个已知杂质，我的样品中有几个杂质并不含有，所以验证时候是不是应该把杂质标准品加到样品中，然后再检测杂质含量呢？未知杂质能不能只走1%的对照，不走100%的样品，拿主峰的RSD来代替它呢？
DDD ( 17:55:27)
（1）楼主您的分析方法已经确定了吗？（验证一定要是已经确定的方法，否则就是研发方法了）
（2）按照已经确定的分析方法用统一均匀的样品分析6次，即配制6份100％供试液，再按分析方法配制对照液（按楼主的说法是1％浓度），按法计算杂质量（如单个杂质，总杂质，以及额外的杂质个数等）和RSD，应符合预先的规定（如RSD小于15％或统计上的F检验或T检验，自己定）。
（3）楼主的单个最大杂质0.1％，很是担心，超过0.1％的话，很麻烦，要进行结构确定的说
木槿 ( 17:56:22)
CDE电子刊物“有关物质分析方法验证的可接受标准简介”项下
　　配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。
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比如，我现在有个原料药，无杂质对照品（无已知杂质，故标准也未规定已知杂质限度），最大单一杂质约0.1%，总杂质约0.5%，供试品测定浓度为1mg/ml，1%自身对照溶液，需要做该项实验时，你们是怎么做的呢？最好写出稀释方法和计算方法，看看我们的理解是否有出入？谢谢！
LZ说的原文出处：
看此文后，我觉得应该这样理解：
有关物质分析方法验证的可接受标准是针对杂质进行定量检查，而非进行限度检查，当然限度检查可以此为参考进行方法验证。
为此我们还应考虑2005版中国药典二部附录173页的附表。
在进行杂质测定时限度检查应进行的验证项目主要有专属性、检测限、耐用性；
而进进行杂质测定的定量检查时其验证项目才有同含量测定的验证项目，并增加定量限的检查。
根据LZ描述应为杂质测定的限度检查，而非进行定量检查，因此我认为应方法学验证做专属性、检测限、耐用性即可。
当然你多做，未必不可，我认为在这种情况下如果你要做重复性，那就应平行配制6份供试品溶液与6份自身对照溶液。再进行测定。
注意：这样现在新问题就出现了，如果你有关物质检查时间过长，如60分钟以上或更长，你如要进样6份，得要多长时间。那这之前你就应该有做有关物质溶液稳定性，那你做的溶液稳定性是否保证了你这个重复性试验的有效时间。
dog002 ( 17:56:59)
我认为可以把它列入自己标准的已知杂质，但其限度不能超出ICH的规定，然后配6个100%的样品和1%的对照，计算含量和RSD。这块内容真是费解，有个项目，药典里定了好几个已知杂质，我的样品中有几个杂质并不含有，所以验证时候是不是应该把杂质标准品加到样品中，然后再检测杂质含量呢？
破坏性试验、长期试验、方法学做了吗？如果都没有，个人观点偏向于，不需要加入那几个没有的杂质进行试验；如果是已有标准，可以将标准提高。。。
未知杂质能不能只走1%的对照，不走100%的样品，拿主峰的RSD来代替它呢？
走1%的对照，只说明1%的对照是可以重复的，100%的样品的重复性没有涉及到，毕竟，HPLC中，不同浓度与峰面积的对应关系不一定都是线性什么的，现在，要做的就是验证方法的可行性。
1、&&对于已知杂质，应该配80%、100%、120%进行定量测定等，重复性试验肯定用杂质标准品配。
2、&&对于未知杂质，且限度无来源，应该对杂质进行具体分析，结合ICH、指导原则等进行鉴定、重复性试验等。
3、&&对于未知杂质，且限度有来源，配6个100%的样品和1%的对照，计算含量和RSD。
2541 ( 17:57:29)
参2010版药典附录19A中的检查项目和验证内容，里面说得再清楚不过了，有疑问的时候我觉得先看药典后看指导原则再看电子刊物。
查看完整回复请点击这里：请教有关物质检测波长的确定
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级别: 普通会员
&请教有关物质检测波长的确定
在做一个化学药物，有关物质检测是用HPLC，用自身对照法，做了破坏试验发现杂质吸收波长各不相同，想请教有关物质检测波长该如何确定，我们现在是用主药的最大吸收波长，不知道这个合适吗？
大家有相关经验的，欢迎指教阿，谢谢！[ 此贴被洲际捣蛋在10-05-05 19:28重新编辑 ]
Posted:10-05-05 07:35|
级别: ★★会员
发帖: 1556
财富: 1344
不能死板。有些杂质可以考虑外标对照，或者用几个色谱系统。如果是研发的话，还是做好这块，目前这块很严的。另外破坏只是借鉴，重点关注正常放样情况的杂质谱，所以稳定性要看看考察
上善若水！
Posted:10-05-06 01:16|
级别: ★★会员
发帖: 1556
财富: 1344
用主药的最大吸收波长，除非各杂质与主药响应因子相同或接近，不然是不对的
上善若水！
Posted:10-05-06 01:17|
级别: 普通会员
谢谢楼上的，我们没有杂质对照品所以没法考察响应因子，今天看了一下美国药典，发现他们是有一个杂质对照的，国内标准还没有，而且液相条件也差异很大，美国的更复杂，看来还有很多没研究到
Posted:10-05-06 02:04|
级别: ★会员
下面是引用zhouxh80于10-05-05 15:35发表的请教有关物质检测波长的确定:
在做一个化学药物，有关物质检测是用HPLC，用自身对照法，做了破坏试验发现杂质吸收波长各不相同，想请教有关物质检测波长该如何确定，我们现在是用主药的最大吸收波长，不知道这个合适吗？
大家有相关经验的，欢迎指教阿，谢谢！上传一个审评二部写的“关于HPLC主成分自身对照法检查有关物质时检测波长确定的讨论”，希望有用。
(5 K)下载次数:126
Posted:10-05-06 02:54|
级别: 普通会员
这始终是个悬而未决的讨论,理论与实际是相差太远的,哪里也不可能为此特别的消耗成本去富集杂质来做矫正因子研究
Posted:10-09-07 07:31|
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即送15丁当
【求助】有关物质方法学验收证
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有关物质用自身对照法来计算，做方法学验证时是不是按照下图中限度那一列来做就可以了？不需要做准确度等项目。
不知道邀请谁？试试他们
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按定量去做。准确度必做。
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很想知道用自身对照法，大家的方法学验证是怎么做的，尤其是准确度
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未知杂质按照限度检测做方法验证，已知杂质按照定量检测做方法验证
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光脚看世界 按定量去做。准确度必须做。如果必须做，那么用自身对照法跟外标法进行比较，结果相差不大，这样做是否就比较有说服力了？其余还有别的方法吗？
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自身对照法其本质还是含量测定法，所以需要做准确度测定。但是做法并非回收率法。而是稀释成不同限度测定含量。
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shako 很想知道用自身对照法，大家的方法学验证是怎么做的，尤其是准确度 我也想知道啊
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huiyu207 自身对照法其本质还是含量测定法，所以需要做准确度测定。但是做法并非回收率法。而是稀释成不同限度测定含量。 能说具体点吗，这样就能做出准确度吗？测出来的含量跟谁比，还是看是否成线性？
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加标回收。
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sepuwang 未知杂质按照限度检测做方法验证，已知杂质按照定量检测做方法验证未知杂质可以以主峰来代替。考察低浓度线性。准确度不必考察，因为没法做加标回收。
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gyhandfj huiyu207 ?自身对照法其本质还是含量测定法，所以需要做准确度测定。但是做法并非回收率法。而是稀释成不同限度测定含量。?? 能说具体点吗，这样就能做出准确度吗？测出来的含量跟谁比，还是看是否成线性？其实就是使用主成分配置成不同浓度，然后外标法含量计算与真实浓度间的比值。
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gyhandfj 如果必须做，那么用自身对照法跟外标法进行比较，结果相差不大，这样做是否就比较有说服力了？其余还有别的方法吗？ 至少两种方法比较，一种是杂质对照外标法，另外一种，使用主成分对照品定量计算，其他战友所述其实就是我说的后一种，值得注意和不同的地方是，自身对照法在验证的时候，不能采用供试品，而要采用主成分对照品的。。
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即送15丁当
【求助】主成分自身对照法方法验证需要做准确度吗？
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这个帖子发布于3年零166天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
大家好，请问主成分自身对照法测定有关物质、对映异构体，做方法验证时是否需要做准确度（有些同事说自身对照法不用做，只有外标法时才需要做准确度）？如果需要该怎么设计实验,如何计算回收率？
下面是我设计的试验：
例如，测定对映异构体时，供试品浓度为0.5mg/ml，1.0%自身对照，规定限度为1.0%。验证准确度时，向已知对映异构体含量（例如0.6%）的供试品溶液中分别加入规定限度的80%、100%、120%对映异构体标准溶液（供试品中对映异构体含量变为约1.4%、1.6%、1.8%）。然后分别进样，用主成分自身对照法计算对映异构体的百分含量，再减去供试品中原有的0.6%得到加入的对映异构体标准品的百分含量。然后用算得的加入的对映异构体标准品的百分含量乘以供试品溶液中主药的质量得到加入的对映异构体标准品的理论质量，用理论质量除以实际加入质量得到回收率。
我这样设计试验和处理数据对吗？请各位赐教。
另外，计算加样理论值时，有的采用外标法算，这样做合理吗？我觉得如果验证的方法采用主成分自身对照法，计算加样理论值时还是应该用主成分自身对照法。
不知道邀请谁？试试他们
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sunshining86 大家好，请问主成分自身对照法测定有关物质、对映异构体，做方法验证时是否需要做准确度（有些同事说自身对照法不用做，只有外标法时才需要做准确度）？如果需要该怎么设计实验,如何计算回收率？
下面是我设计的试验：
例如，测定对映异构体时，供试品浓度为0.5mg/ml，1.0%自身对照，规定限度为1.0%。验证准确度时，向已知对映异构体含量（例如0.6%）的供试品溶液中分别加入规定限度的80%、100%、120%对映异构体标准溶液（供试品中对映异构体含量变为约1.4%、1.6%、1.8%）。然后分别进样，用主成分自身对照法计算对映异构体的百分含量，再减去供试品中原有的0.6%得到加入的对映异构体标准品的百分含量。然后用算得的加入的对映异构体标准品的百分含量乘以供试品溶液中主药的质量得到加入的对映异构体标准品的理论质量，用理论质量除以实际加入质量得到回收率。
我这样设计试验和处理数据对吗？请各位赐教。
另外，计算加样理论值时，有的采用外标法算，这样做合理吗？我觉得如果验证的方法采用主成分自身对照法，计算加样理论值时还是应该用主成分自身对照法。主成分自身对照进行有关物质检测，其实就是以主成分作为杂质对照品进行杂质测定。只不过进样程序跟正常的外标有所不同。那么你觉得准确度该不该做呢？虽然目前国内也没有相关的要求。
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这种情况还真是得做。
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sunshining86 大家好，请问主成分自身对照法测定有关物质、对映异构体，做方法验证时是否需要做准确度（有些同事说自身对照法不用做，只有外标法时才需要做准确度）？如果需要该怎么设计实验,如何计算回收率？
下面是我设计的试验：
例如，测定对映异构体时，供试品浓度为0.5mg/ml，1.0%自身对照，规定限度为1.0%。验证准确度时，向已知对映异构体含量（例如0.6%）的供试品溶液中分别加入规定限度的80%、100%、120%对映异构体标准溶液（供试品中对映异构体含量变为约1.4%、1.6%、1.8%）。然后分别进样，用主成分自身对照法计算对映异构体的百分含量，再减去供试品中原有的0.6%得到加入的对映异构体标准品的百分含量。然后用算得的加入的对映异构体标准品的百分含量乘以供试品溶液中主药的质量得到加入的对映异构体标准品的理论质量，用理论质量除以实际加入质量得到回收率。
我这样设计试验和处理数据对吗？请各位赐教。
另外，计算加样理论值时，有的采用外标法算，这样做合理吗？我觉得如果验证的方法采用主成分自身对照法，计算加样理论值时还是应该用主成分自身对照法。你的做法是对的。但我觉得做准确度之前先做异构体的定量限，再做准确度，杂质对照的最低加入浓度最好是LOQ左右，结果以外标法计算。
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chenpeidan 你的做法是对的。但我觉得做准确度之前先做异构体的定量限，再做准确度，杂质对照的最低加入浓度最好是LOQ左右，结果以外标法计算。结果如果用外标法计算，还能体现主成分自身对照法的可行性吗？我觉得如果方法是自身对照法，计算加样量时也应该用自身对照法，对吗？
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楼主的做法是可以的，不顾在这个过程中，我们得注意的是，加入量(80%,100%,120%)的供试品溶液，分别需要对应三个自身对照溶液。如果为了体现这个验证的准确性，我们还可以加入一个实验，所得结果同外标法进行对比，差距较近的的话就可以说明准确性的。
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