一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法　 　
一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法　 　
申请专利号
专利申请日
一种中枢神经系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法　 　
公开（公告）号
公开（公告）日
人类生活必需（农、轻、医）
申请（专利权）
中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 　
100071北京市丰台区东大街20号生物工程研究所　
发明（设计）人
绳纪坡;邓继先;杨晓 　
进入国家日期
专利代理机构
本发明涉及的制备方法包括利用从129sv小鼠基因组文库克隆得到的1.8kb的神经胶质细胞酸性蛋白(GFAP)基因的5’端调控序列，构建含有两个β球蛋白绝缘子、GFAP5’端调控区、Cre重组酶基因和人生长激素基因polyA的转基因载体pGFAP-Cre-hGH。以显微注射的方法将7.6kb的转基因片段βglobin insulator-pGFAP-Cre-hGH引入191枚小鼠受精卵，其中176枚分别移植至8只假孕母鼠的输卵管中使其发育，共获得子代小鼠25只，经PCR和Southern杂交鉴定其中7只小鼠基因组上整合有Cre基因，整合率为28％。用整合有Cre基因的转基因小鼠与基因组上整合有LoxP位点和LacZ表达框的ROSA26鼠杂交，以检测Cre酶介导的重组及其活性和组织特异性。LacZ染色结果表明：GFAP-Cre转基因小鼠只在中枢神经系统中表达Cre重组酶并能在体内成功介导LoxP位点间的重组。
1.一种利用129sv小鼠GFAP5’端1.8Kb的调控序列制备中枢神经
特异性表达Cre重酶的转基因小鼠的制备方法，主要包括以下三
(1)利用PCR筛选129sv小鼠基因组文库的方法克隆得到了
GFAP5’端1.8Kb的调控序列；
(2)利用得到的GFAP5’端调控序列构建了包括该调控序列、
β球蛋白绝缘子、Cre重组酶基因和人生长激素polyA
(hGHpolyA)在内的中枢神经系统特异性表达Cre重组酶
的表达载体(pGFAP-Cre-hGH)；
(3)利用构建的表达载体成功制备了基因组中整合有该表达载
体的转基因小鼠。造血干细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立--《中国科学:生命科学》2011年10期
造血干细胞特异性表达Cre重组酶转基因小鼠的建立
【摘要】：EDAG是在胚胎发育阶段造血干细胞特异性表达的基因.为了在早期造血组织细胞中实现相关基因的条件敲除,构建了含有早期造血组织特异性表达的EDAG启动子和Cre重组酶基因的转基因EDAG-Cre表达载体质粒.通过显微注射的方法将线性化的5.6kb的EDAG-Cre转基因片段导入小鼠受精卵细胞核,获得的新生小鼠经过PCR鉴定,常规方法培育传代.结果发现,共获得了6只阳性转基因首建鼠,其中4只已经建系并稳定传代.RT-PCR分析表明Cre重组酶基因在阳性转基因小鼠的骨髓、脾脏、胸腺、外周血以及胎肝等组织中均有表达,重组酶活性也在脾和骨髓中获得确认.EDAG-Cre重组酶转基因小鼠的建立,为研究早期造血组织以及造血干细胞特异性基因条件敲除小鼠模型的建立奠定了基础.
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：R329【正文快照】：
血细胞的生成经历一个较长的细胞增殖、分化、成熟和释放的过程,涉及了多层次、多因素的复杂调控过程[1~3],其分子调控机制仍有待阐明.应用基因敲除动物模型是研究基因功能的重要手段,然而由于哺乳动物的造血系统对胚胎早期发育极端重要,造血相关基因的敲除往往导致小鼠发生
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京公网安备75号一种造血系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法
专利名称一种造血系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法
技术领域本发明是关于一种转基因小鼠模型的制备方法，具体涉及利用PCR方法克隆人胚胎发育相关基因EDAG基因的大小为2. 3kb的5’端启动子调控区域并利用该调控序列构建表达载体以及制备造血系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的一种制备方法。
背景技术哺乳动物造血是一个复杂的动态过程。在小鼠胚胎期7. 5天，胚外中胚层来源细胞产生的内皮和造血细胞共同组成血岛，此时造血细胞主要是原始红细胞,核圆、胞体大并表达胚胎型血红蛋白，此过程历时短暂，被称为原始造血。胚胎期10. 5天，胚内位点主动脉-性腺-中肾区(AGM)开始产生成体造血干细胞，在11. 5天达到高峰，此类细胞能向 多个造血细胞谱系分化。胚胎期11天，造血干细胞开始通过已建立的血液循环迁移至胎肝，并继续发育成熟，以红系分化最为显著。此时红细胞无核、合成成体型珠蛋白，标志着永久造血的建立。AGM区造血活动于胚胎期13天结束，其后胎肝成为造血主要场所。临近出生时，胎肝造血活动消退，被骨髓取代，后者成为终生造血器官(Dzierzak E. Ontogenicemergence of definitive hematopoietic stem cells.Curr Opin Hematol，-234)o胚胎造血发育是特异性基因表达或沉默而获得特定表型的过程，已发现多种与造血调控有关的基因或基因家族，如GATA、C/ΕΒΡ和AML/CBF/Runxl等，分别在造血发育的不同阶段发生作用。这些核内造血相关基因的协调性表达是在一系列错综复杂的信号网络调控下完成的，如Notch、Wnt、Sonic、hedgehog(Shh) &Smad等。随着功能基因组时代的到来，对包括上述基因在内的在造血系统尤其是早期造血系统发育过程中发挥作用的基因功能和作用机理的研究显得尤为迫切。传统的基因敲除技术作为有效的研究手段在这个方面发挥了重要的作用，但是敲除与胚胎发育相关的基因常常导致小鼠胚胎畸形甚至在胚胎早期发生死亡而无法进行后续性研究。采用Cre/Loxp的重组系统介导的组织特异性基因敲除技术则可以特异性控制某些重要基因在组织中的特异性表达，进而研究其在不同发育阶段的作用。EDAG基因是造血组织特异表达的新基因，研究表明，EDAG基因特异表达于造血组织(成年骨髓、胚胎肝)中的未成熟造血细胞(⑶34+细胞，即造血干细胞)，在心、肝、脾、肺、肾、脑、肌肉以及外周血单核细胞等成熟细胞中没有表达(闾军，等.EDAG-1，一种与造血调控密切相关新基因的分离和确认.生物化学与生物物理学报，1-646)。但在白血病人外周血细胞以及白血病细胞K562中高表达EDAG，在血红素Hemin、美洲商陆PMA等诱导K562细胞向红系或巨核系分化后，EDAG表达迅速下调；利用反义核酸抑制EDAG表达后，K562细胞增殖受阻，集落形成能力下降，细胞对诱导剂反应更加敏感。研究CDlIa驱动的造血特异表达EDAG转基因鼠发现其胸腺发育异常，脾脏肥大；外周血淋巴细胞形态异常、比例下降，中性粒细胞比例上升；骨髓B220+细胞明显下降，sca-l+c-kit+lin_细胞增加；脾DC细胞增多，B220+阳性细胞减少；胸腺T细胞发育在早期受到阻滞，DN细胞增多；并且骨髓细胞体外分化能力明显下降。这些结果提示EDAG高表达可能阻滞造血干细胞正常分化，其表达下调为造血细胞分化与发育所必需。这些研究表明EDAG/特异表达于早期造血细胞/造血干细胞并与造血分化调控密切相关(Li CY，et a I. EDAG regulates the proliferationand differentiation of hematopoietic cells and resists cell apoptosis throughthe activation of nuclear factor-kappa B.Cell Death Differ，99-1308;Li CY, et al. Overexpression of a hematopoietic transcriptional regulator EDAGinduces myelopoiesis and suppresses lymphopoiesis in transgenic mice. Leukemia，77-2286 ；Yang LV, et al. Hemogen is a novel nuclear factor specificallyexpressed in mouse hematopoietic development and its human homologue EDAG mapsto chromosome 9q22，a region containing breakpoints of hematological neoplasms.Mech Dev，5-111)。因此我们在制备造血系统特异性表达Oe重组酶的转基因小鼠的过程中，应用PCR方法克隆了人EDAGEDAG 5’端2. 3kb的调控序列用于指导Cre重组酶基因的造血系统中的特异性表达。 该转基因小鼠的获得为借助Cre/Loxp重组系统在造血系统中实现一系列基因重组操作、制备组织特异性表达动物模型来研究发育相关基因在造血系统中不同发育阶段中的生物学功能及其表达模式体哦国内一个有力的研究工具。
本发明的目的在于提供一种造血系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠动物模型和制备方法。本发明的关键在于利用Cre重组酶的基因重组和敲除特异性与EDAG基因的早期造血特异性表达，产生转基因小鼠，通过EDAG启动子实现对Cre重组酶在造血系统中特异性表达的调控。该转基因小鼠的制备方法包括以下步骤一、人胚胎发育相关基因EDAG 5’端启动子的克隆；二、利用得到的EDAG 5’端启动子序列构建造血细胞特异性表达的Cre重组酶表达载体 pEDAG-Cre ；三、限制性内切酶酶切线性化pEDAG-Cre表达载体，回收并纯化约5. 6Kb的线性化片段；四、将线性化表达载体进行显微注射小鼠雄原核，成功制备了基因组中整合有该表达载体的转基因小鼠。
图I为转基因表达载体pEDAG-Cre的结构示意图。图2为表达载体pEDAG-Cre的酶切鉴定电泳图谱。其中左侧核酸分子量标准DL2000右侧核酸分子量标准DL15000Marker。图3为PCR鉴定EDAG-Cre转基因的首建者(H)代)小鼠的电泳鉴定结果。其中M :DL2000DNA分子量标准；1 :阳性对照；2 10 :经过原核显微注射后得到的首建鼠幼鼠基因组DNA PCR结果。图4为RT-PCR方法鉴定转基因小鼠Cre重组酶的组织特异性表达的电泳鉴定结果图谱。其中，M DL2000DNA标准分子量；1 :阳性对照；2 :骨髓；3 :胸腺；4 :外周血；5 :脾；6 :月干；7 :肾；8 :肺；9 :肌肉；10 :胎肝；11 :胎脑；12 :阴性对照。图5EDAG_Cre转基因小鼠和R0SA26小鼠交配情况。图6为Cre重组酶在R0SA26小鼠骨髓和胸腺中的表达活性。其中A.骨髓细胞中LacZ的表达活性，B.脾脏细胞中LacZ的表达活性ΓΡ & O. 05，***Ρ & O. 001)。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明做进一步的说明。应理解这些实施案例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。 材料和方法I.材料重组酶Cre表达质粒Al. O-Cre由军事医学科学院生物工程研究所杨晓教授惠赠。包含有EDAG启动子的质粒pEDAG-GFP由本室构建并保存。细菌菌株DH5a、JM109由本室制备保存。限制性内切酶和T4连接酶等购自NEB公司。C57B/6小鼠由本院实验动物中心提供。R0SA26报告基因小鼠由南京大学模式动物研究所提供。EDAG-Cre转基因小鼠构建成功后在军事医学科学院实验动物中心保存。2. EDAG-Cre打靶载体构建EDAG启动子区-2214到+96片段以pEDAG_GFP的质粒DNA为模板，经过PCR扩增后，以KpnI/Sall限制性内切酶双酶切后，克隆到Al. O-Cre载体中构建EDAG驱动的Cre重组酶打靶载体EDAG-Cre，经过测序确认序列正确。Cre PCR引物序列如下正向引物CGGGGT ACC TAC AGT CCC TCC ACA CTC TGC TTC反向引物CGGGTC GAC CTT CCT GCT ATT TTG GTC TGA CTT CC3. EDAG-Cre转基因小鼠的制备EDAG-Cre质粒经过KpnI/SacII线性化酶切，DNA片段回收，按常规进行受精卵原核显微注射和输卵管胚胎移植，由中国医学科学院实验动物研究所完成。实验动物用C57B1/6 小鼠。4. EDAG-Cre首建鼠的鉴定剪取出生后10-14天的幼鼠尾尖约O. 3-0. 5cm，加入55ul组织裂解液，55°C孵育过夜后，100°C灭活5分钟，加入IOOul蒸馏水后，离心取上清作为基因组PCR模板。Cre重组酶通用引物如下，扩增目的片段长354bp 正向引物序列GGACAT GTT CAG GGA TCG CCA GGC G反向引物序列CCATGA GTG AAC GAA CCT GGPCR 条件预变性 94°C 3 分钟；94°C变性 30s，58°C复性 30s，72°C延伸 30s，进行42个循环；最后72°C延伸5分钟。5. EDAG-Cre小鼠中重组酶基因的表达处死6周龄的EDAG-Cre阳性转基因小鼠，取包括肝脏、脾脏、肾脏、肺、胸腺、骨髓、外周血、肌肉在内的各种组织；另外将Cre转基因阳性雄鼠与野生雌鼠交配，通过检查雌鼠阴道栓确定交配日期，收集胚龄E13. 5天的小鼠胚胎，以卵黄囊基因组DNA PCR鉴定Cre阳性胚胎，取阳性小鼠胚胎的胎肝和脑，应用Invitrogen公司的Trizol
试剂盒提取上述组织的总RNA,以Takara RNA PCR逆转录试剂盒制备cDNA,用Takara rTaq和上述Cre引物进行PCR鉴定，以GAPDH为内参照基因，目的片段长150bp 正向引物TGCCCC CAT GTT TGT GAT G反向引物TGTGGT CAT GAG CCC CTT TCC6. EDAG-Cre重组酶活性的组织分布EDAG-Cre小鼠和R0SA26小鼠交配后，取8周龄双阳性(EDAG-Cre+/LacZ+)小鼠和LacZ+小鼠骨髓和脾脏，分离成单细胞，取IXlO6细胞，应用β_半乳糖苷酶试剂盒检测半乳糖苷酶活性(LacZ染色)，于37°C孵育I 2h后，于酶标仪检测405nm波长下的吸光度值。结果I. EDAG-Cre打靶载体构建表达EDAG转基因打靶载体由EDAG基因启动子区(2. 3kb)、Cre重组酶(I. 2Kb)和人 生长激素调控序列(hGH,2. Ikb)组成,全长约5. 6该打祀载体经过限制性内切酶KpnI/SacII酶切后，成为线性DNA片段，用于随后的受精卵显微原核注射。2.转基因首建鼠的鉴定EDAG-Cre转基因打靶载体被限制性内切酶KpnI和SacII酶切线性化，经过受精卵原核显微注射后，出生幼鼠经鼠尾基因组DNA PCR鉴定以后，共获得6只阳性Cre转基因首建鼠。3. Cre重组酶基因的造血系统组织特异性表达阳性首建鼠经过传代建系后，Cre重组酶基因在成年小鼠以及胚胎各种各组织中的表达见图3。RT-PCR结果显示，在成年小鼠的体内，Cre重组酶基因仅在骨髓、胸腺、外周血、脾脏等造血系统内表达，其中骨髓和胸腺等组织中的表达高于外周血和脾脏；在胚胎组织中，担负胚胎早中期造血的胎肝中有明显表达，而在胎脑中则未见表达。4. Cre重组酶的组织表达活性为检测EDAG-Cre转基因小鼠的重组酶表达活性，我们将EDAG-Cre小鼠与R0SA26小鼠进行了交配，取8周龄EDAG-CreYLacZ+双阳性小鼠的骨髓和脾脏组织，以LacZ+小鼠为对照，进行β_半乳糖苷酶活性检测。结果表明实验组小鼠的脾脏和骨髓半乳糖苷酶活性均高于对照组，差异明显(P & O. 05)，表明重组酶在这两种组织中有表达活性。
1.一种重组酶转基因小鼠模型，其特征在于，所述转基因小鼠动物模型的基因组整合有DNA片段，包含有人EDAG (Embryonic development associated gene 1，胚胎发育相关基因-1，简称EDAG)基因5’端启动子区域，以及来源于噬菌体的Cre重组酶基因片段。
2.如权利要求I所述的转基因小鼠模型，其特征在于，所述小鼠EDAG5’端调控区域包括该调控序列、Cre重组酶基因、人生长激素poly A在内的序列。
3.如权利要求I和2所述的转基因小鼠动物模型，其特征在于，所述人胚胎发育相关基因(EDAG) 5，端启动子具有SEQ ID No. I所示的序列。
4.如权利要求I和2所述的转基因小鼠动物模型，其特征在于，所述Cre重组酶基因具有SEQ ID No. 2所示的序列。
5.一种重组酶转基因小鼠的动物模型的制备方法，其特征在于包括以下步骤
A.人胚胎发育相关基因EDAG5’端启动子的克隆；
B.利用得到的EDAG5’端启动子序列构建造血细胞特异性表达的Cre重组酶表达载体pEDAG-Cre ；
C.限制性内切酶酶切线性化pEDAG-Cre表达载体，回收并纯化约5.6Kb的线性化片段；
D.将线性化表达载体进行显微注射小鼠雄原核，成功制备了基因组中整合有该表达载体的转基因小鼠。
6.权利要求I的转基因小鼠模型，其特征在于，转基因小鼠基因组中整合的Cre重组酶基因只在造血系统包括成年小鼠的骨髓、脾脏和外周血中有表达。
本发明涉及一种造血系统特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠的制备方法。本发明公开了一种转基因小鼠动物模型，该转基因小鼠动物模型的基因组整合有DNA片段pEDAG-Cre，所述DNA片段包括有人胚胎发育相关基因(EDAG)5’端启动子与Cre重组酶基因以及人生长素基因polyA片段。本发明还公开了该转基因小鼠动物模型的制备方法，包括应用PCR方法克隆2.3kb的EDAG基因5’端启动子调控区，构建转基因表达载体pEDAG-Cre，以显微注射方法将5.6kb的转基因片段引入小鼠雄原核，并应用PCR方法鉴定阳性转基因小鼠。RT-PCR方法和ROSA26LacZ报告小鼠鉴定结果表明，EDAG-Cre转基因小鼠只在造血系统中特异性表达重组酶。
文档编号C12N15/85GKSQ
公开日日 申请日期日 优先权日日
发明者葛常辉, 许望翔, 李长燕, 杨晓明 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定(英文)--《生物工程学报》2002年03期
胰腺组织表达Cre重组酶转基因小鼠的建立及鉴定(英文)
【摘要】：组织特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠是进行组织特异性基因剔除研究的重要工具。为了建立胰腺组织特异性Cre转基因小鼠 ,我们通过PCR克隆了大鼠胰岛素基因启动子 ,并用它指导Cre基因在胰岛细胞中的特异性表达。在Cre重组酶基因 5′端添加了真核核糖体结合序列和核定位序列以使Cre重组酶能穿越核膜在细胞核中发挥功能 ;同时 ,在Cre基因 3′端添加了含内含子的 3′端人生长激素基因。表达载体经显微注射导入小鼠受精卵以建立转基因小鼠。PCR检测显示共获得 7只Cre整合阳性的转基因首建者小鼠 ;RT PCR结果表明其中 1只首建者小鼠的子代鼠在胰腺中转录了外源基因 ,进一步的Southern杂交结果表明 ,该转基因小鼠能够在胰腺中表达有功能的Cre重组酶
【作者单位】：
【关键词】：
【基金】：
【分类号】：Q78【正文快照】：
ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅＰ1Ｃｒｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ,ｗｈｉｃｈｉｓａｓｉｔｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃＤＮＡｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅ ,ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓｓｐｅｃｉｆｉｃ 34ｂｐｓｅｑｕｅｎｃｅｓｃａｌｌｅｄＬｏｘＰｓｉｔｅｓａｎｄｃａｔａｌｙｓｅｓｒ
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【引证文献】
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【同被引文献】
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【二级引证文献】
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王剑,张莉,毛春明,程萱,侯宁,吕娅歆,杨晓;[J];军事医学科学院院刊;2005年01期
杨蕾蕾,吴壮,程萱,徐军,杨晓;[J];军事医学科学院院刊;2005年03期
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潘晓晨;王友亮;程萱;侯宁;崔芳;时令;刘伯华;祝庆余;秦鄂德;杨晓;;[J];生物技术通讯;2006年04期
王勇,王峰超,魏泓,倪勇,吴军,高翔;[J];遗传学报;2005年09期
王友亮,程萱,崔芳,程竞,吕娅歆,杨晓;[J];中华肝脏病杂志;2004年03期
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