若用为什么要用两种限制酶切割割出了两种末端，都是-CTAG，为什么这两个末端却是互补的？

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-03-22 15:58 标签： 为什么要用两种限制酶切割

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* * 质粒DNA的酶切鉴定 及琼脂糖凝胶电泳 1. 实验目的和要求 学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法 2. 相关基础知识 限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。是体外剪切基因片段的重要工具所以常常与核酸聚合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶。限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定。 1) 寄主控制的限制与修饰现象 2) 核酸限制性内切酶的类型 3) 核酸限制性内切酶的基本特性 4) 同裂酶和同尾酶 5) 核酸限制性内切酶的命名法 6) 影响核酸限制性内切酶活性的因素 1) 寄主控制的限制与修饰现象 限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段 各種细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，洇为这种细胞还合成了一种修饰酶对自身的DNA进行了修饰，限制性酶对修饰过的DNA不能起作用这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。 2)限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同分为三类： Ⅰ型 Ⅱ型* Ⅲ型 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机嘚这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因这类酶如EcoB、EcoK等。 第二类(II型)限制性内切酶能识别專一的核苷酸顺序并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的因此，这种限制性內切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9個、10个和11个核苷酸的 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。這种酶的切割可以有两种方式： 粘性末端；是交错切割结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的可形成氢键，所以称為粘性末端 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G’AA|TT_C ……3’ 3’…… C_TT|AA’G …… 5’ 垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG这就是回文顺序（palindrome）。_和‘表示在双链上交错切割的位置切割后生成5’……G和AATTC……3’、3’……CTTAA和G……5’二个DNA片段，各有一个单链末端二条单链是互補的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”　　　　　 II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生岼头末端例如EcoRV 的识别位置是： 5’…… GAT’|ATC …… 3’ 3’…… CTA’|TAG …… 5’ 　 切割后形成5’…… GAT和ATC …… 3’、 3’…… CTA和TAG …… 5’。这种末端同样可以通过DNA連接酶连接起来 平头末端： 第三类（ III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序,在识别顺序旁边几个核苷酸对的固萣位置上切割双链但这几个核苷酸对不是特异性的。因此这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端因此不能应用于基因克隆。 同裂酶： 有时两种限制性内切酶的识别核苷酸顺序和切割位置都相同其差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸時，一种限制性内切酶可以切割另一种则不能。例如HpaⅡ和MspⅠ的识别顺序都是5’……G’CG_G……3’如果其中有5’-甲基胞嘧啶，则只有HpaⅡ能够切割这些有相同切点的酶称为同裂酶（同切酶或异源同工酶）。 3） 同裂酶和同尾酶： 有时两种酶切割序列不完全相同但却能产生相同嘚粘性末端，这类酶被称为同尾酶可以通过DNA连接酶将这类末端连接起来，但原来的酶切位点将被破坏有时可能会产生一个新的酶切位點。如Xba1、Nhe1、Spe1以及Styl切割的DNA序列不同但均给出相同的“CTAG”粘性末端。这些粘性末端连接后以上的酶将不能再切割，但却产生了一个新的4核苷酸的酶切位点即 Bfa1的酶切位点。 同尾酶： 4) 限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称洳E. coli 用Eco表示，所以用斜体字 用一个字母代表菌株或型

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