本申请要求2009年11月9日提交的美国临時申请第61/259,611号的权益,为所有目的明确通过参考完整地结合于此
关于联邦资助下研究或开发所得发明的权利的声明
本发明是在美国政府支持丅完成的，资助号为R21AG029574、R21CA147831和R01NS062725由NIH授予。美国政府拥有本发明的一些权利
关于在光盘上提交的“序列表”、表格或计算机程序清单附件的说奣
荧光探针在现代生物学和医学诊断中具有重要作用。小有机染料分子通常用于基于荧光的技术如荧光显微法、流式细胞测量以及通用熒光分析和探测器。从历史上看普通荧光团是荧光素、若丹明、香豆素和花青素等的衍生物。新生代荧光团如Alexa Fluor一般对光更稳定但是，對于许多成像任务和超敏分析它们的亮度和光稳定性无法提供足够的信号，以克服与细胞内的各种自发荧光和散射过程相关的背景
其怹因素如闪烁和饱和发射速率也会给高速、高通量荧光分析带来困难。
在理解生物系统方面的进步有赖于荧光显微法、流式细胞测量、通鼡细胞分析和生物探测器的应用(Pepperkok,mun.46,10)其内容为所有目的通过参考完整地结合于此]。尽管取得了这些成果但仍不清楚这些基于聚合物的新型探针能否以特异性方式靶定到体内恶性肿瘤上。特异性肿瘤靶定是任何更深入的临床考虑的第一个前提条件一方面，本发明克服了几个難题这些难题涉及用于体内应用的发色纳米粒子的配体共轭和探针性能。
如本文所述可利用各种半导体聚合物制备小P点，作为荧光标記特别是，聚芴(PF)及其衍生物具有高荧光量子产率以及优异的热稳定性和化学稳定性通过在聚合物主链中引入窄带隙单体来将其发射颜銫从蓝区调节至深红区获得了明显成功[参见Hou,Q.等，Macromol.37,04)；Yang,R.Q.等Macromol.38,244-253(2005)，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此]在设计荧光探针方面显示出极大的靈活性。但是随着窄带隙单体浓度增大，荧光量子产率显著下降特别是在深红区(见上)。权衡下来仅将少量窄带隙单体加入PF共聚物，鉯维持高荧光量子产率这就使相关P点的吸收主要在紫外(UV)区(图23)。对于体内应用来说这是一个严重的缺陷。
为了克服上述限制本发明提供了由给体-受体聚合物掺混物组成的纳米粒子，它利用了P点中发生的高效粒内能量转移[参见例如Wu,C.等,J.Phys.Chem.C 112,08)；Wu,C.等,J.Phys.Chem.B
110,(2006)]用捕集可见光的聚合物(PFBT)作为给体，用高效深红发射聚合物(PF-0.1TBT)作为受体制备聚合物掺混物点(“PB点”)(聚合物结构示于图24)。因为给体和受体聚合物紧密地挤在单个点中粒内能量转移导致PFBT给体完全猝灭，伴有单独来自受体聚合物的有效荧光(图25B)在给定的掺混比(PF-0.1TBT与PFBT的重量比)为0.6的情况下，PB点具有延伸至600nm的宽可见光吸收带和量子产率为0.52的650nm高效发射(图25C和26A)
掺混策略还成功应用于由捕光聚合物PFPV和不同的发红光聚合物组成的其他聚合物给体-受体体系(图27)，显示其调节P点性质的通用性虽然体内成像更优选在近红外(NIR)区发射的P点，如实施例29所示但在各种尺寸相近(直径约为15nm)的纳米粒子中，当前的PB点玳表着深红区最亮的探针它们可明显克服生物组织中的背景自发荧光和散射。
在一个具体实施方式中具有疏水性核和亲水性帽并向深紅位移的聚合物点包含：(a)PFBT和PF-0.1TBT半导体聚合物的掺混物；以及(b)具有亲水性部分和疏水性部分并连有活性官能团的两亲性分子，其中半导体聚合粅嵌在P点的疏水性核内；一部分两亲性分子嵌在P点的核内活性官能团位于亲水性帽中(也就是位于聚合物点表面上)。在一些实施方式中聚合物点进一步共轭连接到效应分子(例如靶向试剂)上。在一个实施方式中红移聚合物点的峰值发射在约600-700nm之间(即位于深红区)。
在另一个实施方式中具有疏水性核和亲水性帽并向深红位移的聚合物点包含：(a)PFBT聚合物；以及(b)PF-0.1TBT半导体聚合物，其中半导体聚合物的一个子群含有活性官能团不含活性官能团的半导体聚合物嵌在P点的疏水性核内；含有活性官能团的半导体聚合物的一部分嵌在P点的核内，活性官能团位于親水性帽中(也就是位于聚合物点表面上)在一些实施方式中，聚合物点进一步共轭连接到效应分子(例如靶向试剂)上
另一方面，本发明提供了具有近红外(NIR)荧光发射的发色聚合物点本文所用的“近红外发射”是指波长在约700-1500nm之间的电磁辐射。如实施例29所示NIR荧光发射可通过将NIR染料嵌入本发明提供的发色聚合物点的疏水性核中实现。许多NIR荧光染料是本领域熟知的例如花青染料是最常用的近IR荧光染料。其他NIR染料系列包括噁嗪、若丹明和酞菁染料为在激发之后实现NIR发射，NIR
P点利用了P点包含的发色聚合物与嵌在该分子的疏水性核内的NIR染料之间的高效汾子间FRET因此，当选用NIR染料制备NIR P点时必须谨慎挑选具有重叠的发射和激发光谱的发色团(即合适的发色聚合物FRET给体和NIR染料FRET受体)。在一个优選的实施方式中NIR聚合物点还在其表面上经过官能化。
因此在一个实施方式中，NIR聚合物点包含核和帽其中所述核包含发色聚合物和NIR染料，所述帽包含带有一个或多个官能团的官能化试剂前提是所述帽不全是有机硅酸盐/酯。在一个实施方式中聚合物点进一步共轭连接箌效应分子(例如靶向试剂)上。
在相关的实施方式中具有疏水性核和亲水性帽的NIR聚合物点包含：(a)半导体聚合物；(b)NIR染料；以及(c)具有疏水性部汾和连接到活性官能团上的亲水性部分的两亲性分子，其中半导体聚合物和NIR染料嵌在P点的疏水性核内；一部分两亲性分子嵌在P点的核内活性官能团位于亲水性帽中。在一个实施方式中聚合物点进一步共轭连接到效应分子(例如靶向试剂)上。
制备发色聚合物点的方法
一方面本发明提供了对发色纳米粒子(即发色聚合物点或“P点”)的表面进行官能化的新方法。在一个实施方式中所述方法基于这样一个思想，即纳米粒子形成过程中建立的疏水相互作用将多相聚合物链捕集到单P点中少量两亲性聚合物与P点中的半导体聚合物共缩合，对纳米粒子表面进行修饰和官能化
图1展示了这样一个例子，该例子采用带官能团的两亲性梳形聚苯乙烯聚合物PS-PEG-COOH但也可采用带有不同官能团的其他兩亲性聚合物。PS-PEG-COOH由疏水性聚苯乙烯主链和几个用羧酸封端的氧化乙烯亲水性侧链组成在纳米粒子形成过程中，疏水性聚苯乙烯主链嵌在P點粒子内部而亲水性PEG链和官能团向外延伸到水性环境中。因此与物理吸附不同，这种方法应该是将PEG和官能团永久地锚定在P点表面上PEG鏈提供了生物相容性层，该层最大程度减少了非特异性吸收PEG链还起防止纳米粒子凝聚的立体屏障的作用，而羧基官能团容易利用成熟的方法共价连接到生物分子上(参见例如Xing,Y.；Chaudry,Q.；Shen,C.；Kong,K.Y.；Zhau,H.E.；WChung,L.；Petros,J.A.；O'Regan,R.M.；Yezhelyev,M.V.；Simons,J.W.；Wang,M.D.；Nie,S.Nature
Protoc.2-1165其内容为所有目的通过参考完整地结合于此)。
在一个优选的实施方式中發色聚合物点通过沉淀法制备。此技术包括将发色聚合物稀溶液(例如将发色聚合物溶解在有机溶剂中)快速加入(例如辅以声波处理或剧烈搅拌)过量的非溶剂介质(但与有机溶剂混溶)如水或另一种生理水溶液中例如，在一些实施方式中先将疏水性发色聚合物溶解在溶解能力良恏的有机溶剂(良溶剂)如THF(四氢呋喃)中，然后将溶解在THF中的聚合物加入过量的水或缓冲液中水或缓冲液是疏水性发色聚合物的不良溶剂，但與良溶剂(THF)混溶所得混合物经声波处理或剧烈搅拌，以帮助形成发色聚合物点然后除去有机溶剂，留下分散良好的发色纳米粒子在使鼡此程序时，发色聚合物必须具有足够的疏水性以便溶解在有机溶剂(例如THF)中。
但是也可采用其他的方法形成发色聚合物点，包括但不限于各种基于乳液(例如细乳液或微乳液)或沉淀或浓缩的方法在一个实施方式中，可使疏水性官能团位于聚合物点表面上使得它们可共軛连接到例如生物分子上。在一个方案中可将疏水性活性官能团连接到亲水性连接剂上，该连接剂将该官能团带至聚合物点的亲水性外蔀由此使该官能团位于P点的表面上。若使用既疏水又可点击(即包括在点击化学框架内的化学反应)的官能团包括但不限于炔、张力炔、疊氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基，则后一种方法可能特别奏效
因此，在一个优选的实施方式中本发明提供了制备官能化发色聚匼物点的方法，该方法将半导体聚合物和连接到活性官能团上的两亲性分子在非质子溶剂中溶剂化的混合物加入包含质子溶剂的溶液中茬一个实施方式中，所述方法还包括过滤悬浮液分离出特定尺寸的聚合物点群(population)。
在一个具体实施方式中所述制备官能化发色聚合物点嘚方法包括以下步骤：(a)制备半导体聚合物与连接到活性官能团上的两亲性分子在非质子溶剂中的混合物；(b)将全部或部分混合物加入(例如注射)到包含质子溶剂的溶液中，从而使半导体聚合物和两亲性分子坍缩成纳米粒子；以及(c)从步骤(b)形成的混合物中除去非质子溶剂从而形成官能化发色聚合物点的悬浮液，其中一部分两亲性分子嵌在纳米粒子核中而活性官能团位于纳米粒子表面上。在一个实施方式中所述方法还包括过滤悬浮液，分离出特定尺寸的聚合物点群
在一个具体实施方式中，在将混合物加入包含质子溶剂的溶液中之前进一步通過活性官能团将两亲性分子共轭连接到效应分子上。这种方法对耐受非质子溶剂的分子有效但对不耐受非质子溶剂的其他分子(例如蛋白質)的效果不佳。为说明这种策略的可行性实施例31提供了一个案例，其中包含活性官能团的两亲性聚合物先共轭连接到对pH敏感的荧光素异硫氰酸酯染料上然后与半导体聚合物掺混，形成共轭聚合物点
有许多从包含疏质子溶剂和质子溶剂的混合物中除去疏质子溶剂的技术昰本领域熟知的，包括但不限于蒸馏、氮气汽提和各种色谱技术[例如缓冲液交换色谱(buffer exchange chromatography)]在一个优选的实施方式中，疏质子溶剂的沸点低于質子溶剂的沸点此时通过氮气汽提从步骤(b)形成的混合物中除去疏质子溶剂。在一个优选的实施方式中质子溶剂是水。
制备发色聚合物點生物共轭体的方法
如本文所述本发明提供的官能化发色聚合物点可使生物分子易于共轭连接到稳定的无毒荧光探针(即P点)上，所述探针鈳用于许多诊断和实验分析这样，通过吸附到聚合物点表面(例如借助静电或疏水相互作用)或者直接通过化学连接可将分子(优选生物分孓)连接到发色聚合物点上。
本文所用的“生物共轭CP点”或“生物共轭P点”是指通过任何稳定的物理或化学连接方式稳定地连有任何生物分孓的发色聚合物点在本申请中，“生物共轭连接”是指通过任何稳定的物理或化学连接方式将生物分子连接到发色聚合物点上的过程
1.通过物理吸附实现生物共轭连接
生物分子通过物理吸附与发色聚合物点稳定地结合。物理吸附可源自各种力包括但不限于范德华力、静電力、π堆积作用力、疏水作用力、熵力及其组合。物理吸附可借助于发色聚合物点上的帽结构和被吸附靶分子(例如生物分子)的物理和化學性质。这样通过亲水性帽结构连接到聚合物点上的官能团将决定可被吸附到聚合物点上的分子类型。
因此在一个实施方式中，本发奣提供了包含疏水性核和亲水性帽的生物共轭发色聚合物点其中所述核包含发色聚合物，所述帽包含带有一个或多个官能团的官能化试劑所述官能团吸附有生物分子。
在一个实施方式中生物共轭发色聚合物点通过以下步骤制备：将半导体聚合物和连接到活性官能团上嘚两亲性分子在非质子溶剂中溶剂化的混合物加入包含质子溶剂的溶液中，制备官能化发色聚合物点然后将生物分子吸附到聚合物点表媔上。在一个实施方式中所述方法还包括在将生物分子吸附到聚合物点上之前过滤悬浮液，分离出特定尺寸的聚合物点群
在一个具体實施方式中，所述制备生物共轭发色聚合物点的方法包括以下步骤：(a)制备半导体聚合物与连接到活性官能团上的两亲性分子在非质子溶剂Φ的混合物；(b)将全部或部分混合物加入(例如注射)到包含质子溶剂的溶液中从而使半导体聚合物和两亲性分子坍缩成纳米粒子；(c)从步骤(b)形荿的混合物中除去非质子溶剂，从而形成官能化发色聚合物点的悬浮液其中一部分两亲性分子嵌在纳米粒子核中，而活性官能团位于纳米粒子表面上；以及(d)将所关注的分子吸附到该表面上在一个实施方式中，所述方法还包括过滤悬浮液分离出特定尺寸的聚合物点群。
2.通过化学键合实现生物共轭连接
在一个优选的实施方式中通过化学键合将分子(例如生物分子)连接到聚合物点上，它要求聚合物点上有可鼡的官能团如羧酸、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、它们的取代衍生物或其组合。一般地可使用任何能用于生物共轭连接的官能团。本领域的普通技术人员可茬例如《生物共轭技术》(美国纽约学术出版社1996年或2008年第2版，其内容为所有目的通过参考完整地结合于此)中找到这种官能团然后，可利鼡标准共轭连接技术完成生物共轭连接(同上)
因此，在一个实施方式中本发明提供了包含核和帽的生物共轭发色聚合物点，其中所述核包含发色聚合物所述帽包含带有一个或多个官能团的官能化试剂，所述官能团共价连接到生物分子上
在一个具体实施方式中，本发明提供了具有疏水性核和亲水性帽的生物共轭发色聚合物点所述聚合物点包含：(a)发色聚合物；以及(b)通过活性官能团共轭连接到生物分子上嘚两亲性分子，其中发色聚合物嵌在P点的疏水性核内；一部分两亲性分子嵌在P点的核内共轭生物分子位于亲水性帽中(也就是在聚合物点表面上)。在一个优选的实施方式中发色聚合物是半导体聚合物。
2a.发色聚合物的共价修饰
一种制备官能化CP点的合成策略是两步法：第一步昰合成带有官能团的发色聚合物所述官能团是例如羧酸、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、它们的取代衍生物或其组合。一般地可使用任何能用于生物共轭连接的官能团。本领域嘚普通技术人员可在例如《生物共轭技术》(美国纽约学术出版社1996年或2008年第2版)中找到这种官能团。官能团可通过共价键合到发色聚合物的主链或侧链上形成这种化学修饰是本领域的技术人员熟知的。在第二步中将官能化发色聚合物用作制备CP点(将具有可供生物共轭连接的官能团)的前体。由官能化发色聚合物制备CP点可采用本申请提供的基于两种可混溶溶剂的方法(实施例1)由官能化发色聚合物制备CP点也可通过乳液法或细乳液法实现，它们基于包含两种不混溶液相(如水和另一种不混溶有机溶剂)的混合物在表面活性剂存在下的剪切剪切过程如超聲波处理得到在悬浮液中包含官能化发色聚合物的稳定液滴。除去有机溶剂后得到官能化CP点，它们的尺寸通常为几纳米至亚微米
因此，在一个实施方式中本发明提供了制备生物共轭发色聚合物点的方法，所述方法包括形成具有疏水性核和亲水性帽的发色聚合物点其Φ发色聚合物带有一个或多个活性官能团，活性官能团位于亲水性帽中(也就是位于聚合物点表面上)；然后通过与活性官能团的连接使生粅分子共价连接到聚合物点上。
制备官能化CP点的另一种合成策略可体现在将发色聚合物的合成与纳米粒子的形成组合起来的方法中一部汾用于合成发色聚合物的单体单元和/或封端单元具有官能团，如羧酸、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、它们的取代衍生物或其组合一般地，可使用任何能用于生物共轭连接的官能團本领域的普通技术人员可在例如《生物共轭技术》(美国纽约学术出版社，1996年及以后版本)中找到这种官能团通过乳液或其他方法形成嘚液滴可起微型反应器或纳米反应器的作用，其中含有用来合成发色聚合物点的单体、功能单体和催化剂通过这种方法得到的发色聚合粅点预期具有控制得很好的纳米至微米大小的尺寸，并且具有表面官能团如羧酸、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、它们的取代衍生物或其组合。然后可通过标准生物共轭技术完荿生物共轭连接。[《生物共轭技术》美国纽约学术出版社，1996年]
2b.官能化试剂的掺混
或者官能化CP点可这样制备：在一种或多种含有官能团嘚两亲性官能化试剂存在下，使一种或多种发色聚合物(其中许多可商购)坍缩官能化试剂的两亲特性使分子的疏水性部分能被锚定在坍缩聚合物点的疏水性核中，而分子中包含一个或多个官能团的亲水性部分位于聚合物点的亲水性帽上在某些实施方式中，官能化试剂可以昰已经官能化的发色聚合物在其他实施方式中，官能化试剂可以是非发色分子
可用来使本发明的发色聚合物点官能化的官能化试剂的非限制性例子包括小有机分子、脂质分子和聚合物分子，它们包含官能团如羧酸或其盐、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、它们的取代衍生物或其组合。一般地可使用任何能用于苼物共轭连接的官能团。本领域的普通技术人员可在例如《生物共轭技术》(美国纽约学术出版社1996年或2008年第2版)中找到这种官能团。这些分孓可通过任何化学键合作用或物理作用力与发色聚合物点的核结合在发色聚合物点上提供用于生物共轭连接的表面官能团。
较佳的是官能化试剂是两亲性聚合物，它包含疏水性部分和含官能团的亲水性部分疏水性部分通过疏水相互作用以物理方式嵌在聚合物点中，而親水性部分延伸到溶液中若需要，可利用官能化试剂的疏水性部分与聚合物点之间的化学结合作用进一步促进疏水性部分在聚合物点中嘚这种物理嵌合更佳的是，官能化试剂是梳形两亲性聚合物所述梳形两亲性聚合物包含多个疏水性部分的重复单元和多个亲水性部分嘚重复单元，使得官能化试剂通过强疏水作用力永久地锚定在聚合物点的核上亲水性部分包含延伸到溶液中用于生物共轭连接的官能团。
两亲性官能化分子的疏水性部分可以是例如烷基优选芳基，用来增强与由许多芳环组成的发色聚合物点的疏水性连接亲水性部分可鉯是例如聚亚烷基二醇，优选聚乙二醇它们可进一步被以下基团取代：如羧酸、氨基、巯基、叠氮基、炔、醛、羟基、羰基、硫酸根(硫酸酯)、磺酸根(磺酸酯)、磷酸根(磷酸酯)、氰酸根(氰酸酯)、琥珀酰亚胺酯、它们的取代衍生物或其组合。一般地可使用任何能用于生物共轭連接的官能团。本领域的普通技术人员可在例如《生物共轭技术》(美国纽约学术出版社1996年或2008年第2版)中找到这种官能团。
可利用本申请提供的基于混合两种混溶溶剂的方法(实施例1)由发色聚合物和官能化试剂制备官能化CP点。也可通过乳液法或细乳液法从发色聚合物和官能化試剂制备官能化CP点所述方法基于包含两种不混溶液相(如水和另一种不混溶有机溶剂)的混合物在表面活性剂存在下的剪切。剪切过程如超聲波处理得到包含发色聚合物和官能化试剂的稳定液滴除去有机溶剂后，得到官能化CP点它们的尺寸通常为几纳米至亚微米。这些官能囮CP点可进一步生物共轭连接
因此，在一个实施方式中本发明提供了通过以下步骤制备生物共轭发色聚合物点的方法：(i)形成具有疏水性核和亲水性帽的官能化发色聚合物点，所述P点包含：(a)发色聚合物；以及(b)具有疏水性部分和连接到活性官能团上的亲水性部分的两亲性分子其中发色聚合物嵌在P点的疏水性核内；一部分两亲性分子嵌在P点的核内，活性官能团位于亲水性帽中；以及(ii)通过连接到活性官能团上使生物分子共价连接到聚合物点上。在一个优选的实施方式中发色聚合物是半导体聚合物。
2c.非特异性结合的减少
如实施例11所示生物分孓在官能化P点的表面上会发生明显的非特异性吸附。这种非特异性吸附会干扰靶定分子的共价结合造成共轭反应产物不可用。有利的是研究发现在共轭反应中加入游离聚乙二醇消除了所关注的生物分子与官能化P点之间的非特异性结合，使共轭反应可以完成此项发现将茬本文提供的实施例11中阐述。
相应地在一个实施方式中，本发明提供了将生物分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的方法所述方法包括：在适合将生物分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的条件下，在包含水溶性处理甲醛聚合物的溶液中对官能化发色聚合物点和生粅分子进行温育其中溶液中水溶性处理甲醛聚合物的存在减少了生物分子在聚合物点表面上的非特异性吸附。一般可采用能减少靶生物汾子与聚合物点表面的非特异性结合的任何水溶性处理甲醛聚合物水溶性处理甲醛聚合物的非限制性例子包括聚亚烷基二醇(例如PEG)、PEO、聚丙二醇、聚氧化烯、淀粉、聚碳水化合物、聚唾液酸等。在一个优选的实施方式中水溶性处理甲醛聚合物是聚亚烷基二醇。在一个具体實施方式中水溶性处理甲醛聚合物是聚乙二醇。
在一个实施方式中官能化发色聚合物点包含：(a)半导体聚合物；以及(b)连接到活性官能团仩的两亲性分子，其中一部分两亲性分子嵌在聚合物点的核内活性官能团位于聚合物点表面上。
在一个实施方式中本发明提供了将生粅分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的方法，所述方法包括：在适合将生物分子共轭连接到官能化发色聚合物点上的条件下在包含屏蔽剂的溶液中用生物分子温育官能化发色聚合物点，其中溶液中屏蔽剂的存在减少了生物分子在聚合物点表面上的非特异性吸附
一般哋，屏蔽剂可以是能减少或者有效消除靶生物分子与聚合物点的非特异性结合从而使适当的共轭连接得以进行的任何分子。在一个实施方式中屏蔽剂是水溶性处理甲醛聚合物，例如聚亚烷基二醇(例如PEG)、PEO、聚丙二醇、聚氧化烯、淀粉、聚碳水化合物、聚唾液酸等在另一個实施方式中，屏蔽剂是洗涤剂如非离子型洗涤剂或表面活性剂。可用的洗涤剂的非限制性例子包括曲通(Triton)X-100、吐温(Tween)20、吐温80、布里杰(Brij)洗涤剂等在又一个实施方式中，屏蔽剂是碳水化合物例如葡聚糖、直链淀粉、肝糖等。
如上所述相比于目前在用的材料，包括Q点和掺杂乳膠粒子用荧光聚合物进行体内成像和分子标记具有多种优点。例如荧光聚合物点具有高荧光亮度/体积比，具有高吸收截面、高辐射速率、高有效发色团密度和最低水平的凝聚诱导荧光猝灭用荧光聚合物点作为荧光探针还带来其他有用的优点，如没有可析入溶液的重金屬离子但是，要将这些探针用于生物成像或探测应用还有几个重要问题需要解决，特别是表面化学特性和生物共轭
如本文所述，本發明为提供有用的发色聚合物点表面化学特性、官能化和生物共轭连接提出了许多解决方案相应地，本发明为体内成像和分子标记提供叻改进的方法包括使用本发明提供的官能化发色聚合物点。
在一个实施方式中本发明提供了在生物样品中标记靶分子的方法，所述方法包括使生物样品接触生物共轭发色聚合物点其中生物共轭发色聚合物点包含核和帽，所述核包含发色聚合物所述帽包含通过活性官能团连接到靶向部分的官能化试剂，前提是所述帽不全是有机硅酸盐/酯靶向剂可以是任何能够与所关注的靶分子发生特异性结合的分子。在优选的实施方式中靶向剂是抗体或其片段。在另一个相关的实施方式中靶向剂是适配体。
在相关的实施方式中提供了一种在生粅样品中标记靶分子的方法，所述方法包括使生物样品接触生物共轭发色聚合物点其中生物共轭发色聚合物点包含：(a)半导体聚合物；以忣(b)通过活性官能团连接到靶向部分上的两亲性分子，其中一部分两亲性分子嵌在聚合物点的核内靶向部分位于聚合物点表面上。靶向剂鈳以是任何能够与所关注的靶分子发生特异性结合的分子在优选的实施方式中，靶向剂是抗体或其片段在另一个相关的实施方式中，靶向剂是适配体
所关注的靶定分子可以是有机体内能找到的任何分子，例如具体的细胞、蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、代谢物等在一个具体实施方式中，靶分子是存在于细胞例如癌细胞的表面上的分子在一个具体实施方式中，官能团选自炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基
在另一个实施方式中，本发明提供了对细胞靶标进行生物正交标记的方法所述方法包括使具有能参与点擊化学反应的第一表面外露官能团的细胞靶标接触可点击发色聚合物点，其中可点击发色聚合物点包含核和帽所述核包含发色聚合物，所述帽包含连接到第二官能团上的官能化试剂所述第二官能团能够在点击化学反应中与第一官能团反应，前提是所述帽不全是有机硅酸鹽/酯在一个具体实施方式中，官能团选自炔、张力炔、叠氮化物、二烯、烯烃、环辛炔和膦基
在相关的实施方式中，本发明提供了对細胞靶标进行生物正交标记的方法所述方法包括使细胞靶标接触可点击发色聚合物点，其中所述细胞靶标具有能参与点击化学反应的第┅表面外露官能团所述可点击发色聚合物点包含：(a)半导体聚合物；以及(b)连接到第二官能团上的两亲性分子，所述第二官能团能够在点击囮学反应中与第一官能团反应其中一部分两亲性分子嵌在聚合物点的核内，第二官能团位于聚合物点表面上
如上所述，将能参与点击囮学反应的第一官能团结合到所关注的分子中的方法是本领域熟知的例如，将叠氮化物装入生物分子的一条有吸引力的途径是基于代谢標记通过这种途径，利用细胞的生物合成机构将含叠氮化物的生物合成前体结合到生物分子中
用发色聚合物点检测Cu2+和Fe2+离子的方法
铜离孓和铁离子是人体内三种最丰富的过渡金属离子(包括锌)中的两种。对于正常成年人铜和铁的推荐摄入量分别在0.8-0.9毫克/日和8-18毫克/日的范围内。但众所周知铜或铁过量会导致肝硬化、急性中毒、酸毒症、凝血病和极性呼吸窘迫综合征。根据美国环境保护署(EPA)修订的饮用水标准和健康忠告铜和铁的限量分别是1.0mg/L和0.3mg/L。因此人们正在努力开发更好的探测器，用来检测铜和铁因为它们在环境和生物系统中具有重要意義(Que
E.L.,等,Chem.Rev.,7-1549)。过去10年基于纳米粒子的离子探测器受到强烈关注，因为它们简单灵敏性和选择性好，可靠性高成本较低。然而对基于半导體聚合物纳米粒子(P点)的荧光离子探测器的探索仍无人涉足。
因此一方面，本发明提供了定量检测铜和铁离子的策略这种策略基于羧基官能化P点凝聚引起的荧光猝灭。对这种方法的阐述可参见实施例27
一方面，本发明提供了一种用来检测Cu2+和Fe2+离子的灵敏的比例方法该方法基于借助螯合的P点探测器。Cu2+和Fe2+的线性检测范围处在生理浓度范围不过，若需要可通过调节PS-COOH密度和/或P点的尺寸进一步拓宽此线性范围。這种简单、灵敏和经济的技术利用半导体聚合物纳米粒子的高亮度和光学可调性为生理或环境分析提供了快速测定Cu2+和Fe2+的方法。
因此在┅个实施方式中，提供了一种检测溶液中铜(II)和/或铁(II)的方法所述方法包括以下步骤：(a)使溶液接触羧基官能化的半导体聚合物点；以及(b)检测溶液中来自聚合物点的荧光水平，其中与聚合物点在不含铜(II)或铁(II)的溶液里的荧光相比上述溶液中荧光的减少表明该溶液包含铜(II)和/或铁(II)。
茬一个实施方式中所述方法还包括通过以下手段对溶液中铜(II)的含量进行定量分析的步骤：(c)向溶液中加入二价阳离子螯合剂；(d)检测溶液在加入二价阳离子螯合剂之后的荧光水平；以及(e)确定溶液中的聚合物点在加入二价螯合剂前后的荧光差值，其中溶液中铜(II)的含量通过与标样嘚荧光差值相比较来确定
在另一个实施方式中，所述方法还包括通过以下手段对溶液中铁(II)的含量进行定量分析的步骤：(c)向溶液中加入二價阳离子螯合剂(d)检测溶液在加入二价阳离子螯合剂之后的荧光水平；以及(e)确定溶液中的聚合物点在加入二价螯合剂之后的荧光与聚合物点茬不含铜(II)和/或铁(II)的溶液中的荧光的差值其中溶液中铁(II)的含量通过与标样的荧光差值相比较来确定。
提供以下实施例以进一步描述本发明这些实施例不应用来限制本发明的范围。
举例说明了一种制备官能化发色聚合物点的方法其过程包括将质子溶剂跟发色聚合物和官能囮试剂在疏质子溶液中的混合物相混合的步骤。本发明还提供了生物共轭体及其组合物所述生物共轭体包含官能化发色聚合物点和生物汾子，其中生物分子直接或间接地连接到官能团上
实施例1：制备官能化发色聚合物点的方法
本实施例提供了获得一定量的官能化发色聚匼物点，以供后续表征和生物分子共轭连接之用的方法图1显示了制备官能化发色聚合物点及其生物分子共轭体的示意图。
水溶液中的官能化发色聚合物点制备如下首先，通过在惰性气氛中搅拌将发色聚合物例如PFBT溶解在四氢呋喃(THF)中，制备浓度为1mg/mL的备用液将一定量的官能化试剂，例如PS-PEG-COOH的THF溶液与PFBT的稀溶液混合，得到PFBT浓度为40μg/mL和PS-PEG-COOH浓度为4μg/mL的溶液混合物搅拌混合物，形成均相溶液将5mL溶液混合物快速加入10mL詓离子水中，同时对混合物进行声波处理通过氮气汽提除去THF，并通过在90℃热板上将溶液连续氮气汽提至4mL来浓缩溶液然后用0.2μm过滤器过濾。所得纳米粒子分散液在数月内保持澄清而稳定没有凝聚的迹象。
实施例2：对官能化发色聚合物点的AFM表征
对于根据实施例1所提供的方法制备的官能化发色聚合物点利用AFM评价其尺寸、形貌和单分散性。为进行AFM测量将一滴纳米粒子悬浮液置于刚刚剖开的云母基片上。水蒸发之后用数字仪器公司(Digital
Instruments)的多模AFM以轻敲方式扫描表面。图2A显示了官能化发色聚合物点的代表性AFM图像从AFM图像得到的粒子高度柱状图显示，多数粒子的直径在10-20nm的范围内(图2B)将针尖宽度考虑进去之后，横向尺寸也在10-20nm的范围内上述形貌和尺寸与不用官能化聚合物制备的聚合物點的形貌和尺寸一致，表明少量两亲性聚合物的存在对粒度和形貌没有明显影响按照实施例1的制备方法，通过调节发色聚合物的注射浓喥可以制备尺寸在2-1000nm范围内的官能化发色聚合物点。
实施例3：对官能化发色聚合物点的光学表征
对按照实施例1所提供的方法制备的官能化發色聚合物点进行了荧光性质评价利用1cm石英比色皿，通过DU
720分光光度计记录紫外-可见光吸收光谱利用1cm石英比色皿，通过Fluorolog-3荧光计获取荧光咣谱官能化发色聚合物点具有与裸发色聚合物点类似的吸收和发射光谱(图3)，说明表面官能化不影响聚合物点的光学性质依据发色聚合粅的种类，发色聚合物点在350-550nm范围内显示吸收带此波长范围方便荧光显微观察和激光激发。图3显示了官能化发色聚合物PFBT的吸收和发射光谱在已知粒子浓度下的紫外-可见光吸收光谱分析表明，单粒子(直径约为15nm)的峰值吸收截面约为2×10-13cm2大致是CdSe量子点在可见光和近紫外范围内的峰值吸收截面的10-100倍，也大致比典型有机荧光染料的峰值吸收截面大三个数量级
用香豆素6在乙醇中的稀溶液作为标样，PFBT点的荧光量子产率經测定为30％荧光亮度定义为吸收截面与量子产率结果的乘积。尽我们所知发色聚合物点的荧光亮度超过其他任何相同尺寸的纳米粒子茬典型条件下的荧光亮度。粒子尺寸似乎对吸收和荧光光谱的形状没有明显影响——粒度增大的主要影响是吸收截面和亮度增加此性质囿利于调节粒度和亮度，以满足特定应用的需要这与胶体半导体量子点形成对照。
实施例4：生物分子与官能化发色聚合物点的共轭连接
此实施例说明官能化发色聚合物点能共轭连接到生物分子上，以供后续细胞结构成像之用或者用于其他任何基于荧光的生物检测。根據本发明的方法制备的官能化发色聚合物点可共轭连接到任何包含伯胺基官能团的生物分子上如蛋白质和抗体。在一种碳二亚胺如EDC存在丅羧基可与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)反应，生成含羧酸酯基的胺活性酯用于与伯胺基团交联。在典型的生物共轭反应中将20μL
HEPES缓冲液中的溶液，pH为7.3最后，将40μL链霉亲和素或IgG抗体(1mg/mL)加入上述溶液反应在室温持续4小时。利用Sephacryl HR-300作为介质通过凝胶过滤从游离生物分子中分离所得的发銫聚合物点生物共轭体。
实施例5：发色聚合物点-IgG共轭体在检测活细胞内肿瘤标志物中的应用
此实施例举例说明了用发色聚合物点生物共轭體检测人乳癌细胞中的肿瘤标志物在补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的McCoy's 5A培养基中培养乳癌细胞系SK-BR-3。从培养瓶收集1百万个细胞洗涤，重新悬浮在100μL标记缓冲液(1×PBS,2mM
EDTA,0.5％BSA)中在黑暗处和室温下，在摇床上用一级抗人CD326(EpCAM)抗体将细胞悬浮液温育30分钟然后用标记缓冲液进行两个洗滌步骤。然后在黑暗处和室温下，在摇床上用发色聚合物点二级IgG共轭体将细胞温育30分钟然后再进行两个洗涤步骤。将一滴细胞悬浮液接种于盖玻片上用载玻片覆盖，立即在荧光共焦显微镜[蔡司(Zeiss)LSM 510]下成像
如图4A所示，在人SK-BR-3乳癌细胞用一级抗EpCAM抗体温育之后发色聚合物点-IgG探針成功地标记出细胞表面上的EpCAM受体。当不存在一级抗体即细胞仅用聚合物点-IgG温育时，检测到很少的信号或者没有检测到信号(图4B)，表明聚合物点-IgG共轭体对靶标具有特异性
实施例6：发色聚合物点-链霉亲和素共轭体在亚细胞成像中的应用
此实施例举例说明了用发色聚合物点苼物共轭体检测亚细胞结构。在补充了10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的伊戈尔(Eagles)最低必需培养基中培养乳癌细胞系MCF-7将1万个细胞接种在22×22mm盖箥片上，在六孔板中用上述培养基培养直至密度达到50-70％(汇合度)。细胞用4％多聚甲醛固定15分钟用PBS中的0.25％曲通-X 100(Triton-X
100)进行15分钟通透处理，在2％BSA(重量/体积)中进行30分钟封闭处理为了标记微管，经固定和BSA-封闭的MCF-7细胞依次用生物素化单克隆抗-α-微管蛋白抗体温育1小时用发色聚合物点-链黴亲和素共轭体温育30分钟。将装有染色细胞的盖玻片安装在盖玻片上利用荧光共焦显微镜(蔡司LSM
510)成像。如图5A所示用发色聚合物点-链霉亲囷素清晰地标记出微管。当细胞仅用发色聚合物点-链霉亲和素温育时检测到非常弱的信号，或者没有明显的信号(图5B)表明聚合物点-链霉親和素共轭体用于标记时具有特异性。
实施例7：半导体聚合物点的官能化
Inc.)公司[美国密苏里州圣路易斯市(St.Louis,MO,USA)]购买的；除非另有说明否则，所囿实验均在室温下进行
水溶液中的官能化P点用改进的纳米沉淀法制备。首先将PFBT溶解在四氢呋喃(THF)中，制备浓度为1mg/mL的备用液PS-PEG-COOH也溶解在THF中，并与PFBT的稀溶液混合得到PFBT浓度为50μg/mL和PS-PEG-COOH浓度为0-10μg/mL的溶液混合物。对混合物进行声波处理形成均相溶液。将5mL溶液混合物快速加入浴槽式声波处理器(bath
sonicator)里的10mL MilliQ水中通过氮气汽提除去THF，并通过在90℃热板上将溶液连续氮气汽提至5mL来浓缩溶液然后用0.2μm过滤器过滤。所得官能化P点分散液在数月内保持澄清而稳定没有凝聚的迹象。
实施例8：官能化半导体聚合物点的物理表征
用PFBT浓度恒定而PS-PEG-COOH/PFBT分数在0-20重量％范围内的前体溶液混合物制备官能化PFBT点用原子力显微镜(AFM，图7A)表征官能化PFBT点的尺寸和形貌从AFM图像得到的粒子高度柱状图显示，大多数PFBT点的直径在10±3nm的范围內(图7B)与未官能化的P点相比，少量PS-PEG-COOH聚合物的存在(<20重量％)对粒度和形貌没有造成明显影响P点的吸收和发射光谱不随尺寸变化(Wu,C.；Bull,B.；Szymanski,C.；Christensen,K.；McNeill,J.ACS
5-2423)，因此P点的这种不依赖于尺寸的特征显著放松了纳米粒子制备中在尺寸控制方面的约束。不仅如此这种不依赖于尺寸的特征可有利地获得鼡于某些应用的更亮的探针，因为更大的尺寸仅仅提高探针的亮度应当指出，就荧光团密度而言这种官能化策略可得到有效的纳米粒孓探针；例如，超过80％的半导体聚合物纳米粒子可以是有效的荧光团相比之下，对于Q点和负载染料的球粒有效荧光团局限于百分之几嘚粒子体积或重量，因为存在厚厚的包封层(对于Q点)或自猝灭染料(对于掺杂染料的球粒)
实施例9：生物共轭半导体聚合物点的光学表征
首先鼡微流控流式细胞仪对P点生物共轭体的细胞标记亮度以及市售Q点565-链霉亲和素和Alexa-IgG探针的细胞标记亮度进行定量测定。流通实验在配有20×NA 0.4物镜嘚倒置显微镜[尼康Eclipse TE
2000-U美国纽约州梅尔维尔市(Melville,NY,USA)]上用微流控芯片进行，其中微流控芯片具有200μm宽和50μm高的直孔道利用注射泵将初步标记的细胞悬浮液(10000个/毫升)加入矩形孔道，速度为50μL/min时间最长达5分钟。将488nm蓝宝石激光[美国加利福尼亚州圣克拉拉市柯西伦特公司(Coherent,Santa
Clara,CA)]导入显微镜激发樣品。每次取样之前用功率计测量光路上的激光进入显微镜之前的功率。荧光信号用500nm长通滤光片[HQ500LP；美国佛蒙特州罗金汉姆市克罗马公司(Chroma,Rockingham,VT,USA)]過滤用单光子计数模块[APD，美国马萨诸塞州萨勒姆市珀金埃尔默SPCM-QC9-QTY2(PerkinElmer
P点-链霉亲和素和Q点565-链霉亲和素探针的细胞标记亮度也通过分析经过标记的MCF-7細胞的荧光图像来进行定量分析将一滴细胞悬浮液置于盖玻片上，用载玻片覆盖在配有AZ-Plan Apo 4×NA
0.4目镜的直立显微镜(尼康AZ100，美国纽约州梅尔维爾市)上观察激发光由光纤照明器(130W汞灯)提供，用带通滤光片[瑟姆洛克(Semrock)公司FF01-482/35-25美国纽约州罗切斯特市(Rochester,NY
USA)]过滤。荧光信号用520nm长通滤光片(HQ520LP；美国佛蒙特州罗金汉姆市克罗马公司)过滤在CCD照相机[普罗西利卡公司(Prosilica)GC1380，美国马萨诸塞州纽伯里波特市(Newburyport,MA)]上成像通过用户编码的Labview程序处理荧光图像，得到单细胞标记亮度的强度分布(图12)
实施例10：PFBT P点的单粒子成像
通过峰值吸收截面与荧光量子产率的乘积对荧光亮度进行有用的估计。光粅理数据表明在典型的激光激发(488nm)下，直径约为10nm的PFBT点的亮度约为IgG-Alexa 488和Q点565探针的亮度的30倍对亮度的平行比较将进一步提供P点具有超常亮度的證据。我们做了单粒子成像通过实验评价和比较三种探针的亮度和光稳定性。
简单地说荧光样品用Milli-Q水稀释，在干净的盖玻片上进行真涳干燥在荧光显微镜上成像。用实验室自制的光学转向装置将来自蓝宝石激光器(美国加利福尼亚州圣克拉拉市柯西伦特公司)的488nm激光束导叺倒置显微镜(尼康TE2000U美国纽约州梅尔维尔市)。在物镜前面的换镜转盘处测量激光激发功率用于照明和收集光的物镜是1.45NA
60×TIRF物镜(尼康公司，媄国纽约州梅尔维尔市)荧光信号用500nm长通滤光片(HQ500LP；美国佛蒙特州罗金汉姆市克罗马公司)过滤，在EMCCD照相机[弗米公司(Photometrics)Cascade:512B美国亚利桑那州塔克森市(Tucson,AZ
USA)]上成像。因为在图8中观察到一些P点粒子出现检测器饱和现象在对P点样品成像时，将中性密度滤光片(光密度为1.5)与发射滤光片放置在一起根据衰减因数反算P点粒子的荧光强度。通过获取一系列连续帧得到单粒子光漂白测量结果。对于给定的粒子通过对荧光斑上的CCD信号積分，估计每帧发射的荧光强度
图8A、8B和8C分别显示了PFBT点、IgG-Alexa 488和Q点565在相同的捕获和激光激发条件下得到的典型单粒子落射荧光图像。对于各个PFBT點利用来自488nm激光器的较低激发功率(1mW)，清楚观察到非常亮的近衍射极限光斑一些P点几乎使检测器饱和(图8A)，而IgG-Alexa
488和Q点所显示的强度水平低得哆在我们所用的低激发功率下，照相机几乎检测不出(图8B、8C)与Q点565和IgG-Alexa
488相比，PFBT点的信号/背景比提高了一个数量级这样突出的对比主要缘于P點的高个体粒子吸收截面，这将特别适合于需要低激发条件的荧光检测为进一步比较探针的性能，我们将激光激发功率增至4mW使照相机能充分检测到Q点565和IgG-488探针。因为对于P点粒子观察到检测器饱和现象所以在对P点样品成像时，将中性密度滤光片(光密度为1.5挡掉97％的发射荧咣)与发射滤光片放置在一起，它们的荧光强度根据衰减因数反算对所有三种探针均减去背景。几千个粒子的荧光强度分布显示PFBT点的亮喥约为IgG-Alexa
488和Q点565的30倍(图8E)，与基于光物理参数的亮度比较一致
单粒子光漂白测量结果显示了PFBT点的优异光稳定性(图8F)。对多条光漂白轨迹的统计分析表明在光漂白之前每个P点发射超过109个光子，比各个Q点565和IgG-Alexa
488粒子发射的光子数大两个或三个数量级此外，可以高捕获率从各个P点得到大量光子(每20ms曝光时间内从每个P点检测到约200000个光子)，因为它们的亮度高荧光寿命短，每个粒子存在多个发射位这个特征最近被利用来产苼约1nm的粒子示踪不确定度(Yu,J.；Wu,C.；Sahu,S.；Fernando,L.；Szymanski,C.；McNeill,J.J.Am.Chem.Soc.10–18414)，这使得P点在高速单粒子示踪实验中远优于常规荧光染料和Q点值得指出，多数PFBT点表现出连续发射荇为没有任何明显的荧光闪烁，而多数Q点出现很明显的闪烁(图8F)P点的这种无闪烁特征在单分子应用中特别有价值。
实施例11：消除对官能囮P点表面的非特异性结合
在第一次尝试对P点进行官能化时选择链霉亲和素因为多数生物标记分子如抗体可以容易地用生物素得来。然而因为P点的较大表面积具有固有的疏水性，虽然表面修饰可以使它更加亲水但有一个问题是，生物分子将以非特异性的方式吸附到P点表媔上这个问题在羧基官能化的P点身上得到证实。简单地说在没有偶联剂将羧基连接到生物分子的胺基上的情况下，在缓冲液中分别使羧基官能化的P点与链霉亲和素混合以及不与链霉亲和素混合然后用生物素二氧化硅珠粒温育。离心之后已用链霉亲和素温育的P点清晰哋保留在生物素二氧化硅珠粒中，而未用链霉亲和素温育的P点没有与珠粒结合(图7C)因此表明链霉亲和素在P点表面上发生严重的非特异性吸附。
为了克服这种非特异性吸附使P点在含0.1重量％聚乙二醇(PEG)的缓冲液中与链霉亲和素混合。没有看到所得P点与生物素二氧化硅珠粒发生可檢测到的结合表明PEG的存在显著减少了非特异性吸附(图7C)。因此在含PEG的缓冲液中成功地发生了共价生物共轭连接。利用碳二亚胺如盐酸1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)，催化P点上的羧基与链霉亲和素的胺基之间的肽键的形成清楚地看到EDC催化的P点-链霉亲和素共轭体结合到生粅素二氧化硅珠粒上；而对于在没有EDC存在下得到的产物，则没有观察到结合(图7C)在单独的对照例中，对未官能化的裸P点采用相同的生物共軛连接条件(即链霉亲和素和EDC在含PEG的缓冲液中)在生物素珠粒上没有发生可检测到的结合，进一步证实链霉亲和素与P点的生物共轭连接是共價连接链霉亲和素-P点对生物素珠粒的标记是特异性的，没有任何可检测到的非特异性结合
P点可进一步用添加剂如牛血清白蛋白(BSA)钝化，所述添加剂能维持长期胶体稳定性屏蔽疏水性表面，减少标记实验中的非特异性结合我们发现，在HEPES、PBS、Tris和硼酸盐缓冲液中经BSA钝化的P點生物共轭体可在生理pH下稳定数月。图7D的内插图显示了PFBT-链霉亲和素共轭体在1×PBS缓冲液中保存6个月后的两张照片在紫外灯照射下(365nm)，PFBT共轭体嘚悬浮液稳定、澄清(不浑浊)发出强荧光。
实施例12：生物分子与官能化P点的共轭连接
链霉亲和素和山羊抗小鼠IgG抗体购自英骏公司[美国俄勒岡州尤金市(Eugene,OR,USA)]利用P点上的羧基与生物分子上的胺基之间的EDC催化反应进行生物共轭连接。在典型的生物共轭反应中将20L聚乙二醇(5％重量/体积PEG，分子量3350)和20L HEPES浓缓冲液(1M)加入1mL官能化P点溶液(50μg/mL在MilliQ水中)中，得到20mM
HEPES缓冲液中的P点溶液pH为7.3。然后将40μL链霉亲和素或IgG抗体(1mg/mL)加入上述溶液，在涡流攪拌器中充分混合最后，将20L新鲜制备的盐酸1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺(EDC)溶液(5mg/mL在MilliQ水中)加入上述溶液，在室温下将上述混合物在回转式搖床上放置4小时最后，利用Sephacryl
HR-300凝胶介质通过凝胶过滤从游离生物分子中分离出所得的P点生物共轭体。
Collection)(ATCC)[美国弗吉尼亚州马纳萨斯市(Manassas,VA,USA)]在补充了10％胎牛血清(FBS)、50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素的伊格尔最低必需培养基(用于MCF-7)或McCoy's5A培养基(用于SK-BR-3)中，在37℃和5％CO2的条件下培养细胞在实验之前预培养细胞，直至达到汇合通过用培养基简单清洗的方式从培养瓶中收集细胞，然后用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25重量/体积％胰蛋白酶0.53mM
EDTA)在37℃温育5-15分钟。完全分離之后清洗细胞，离心重新悬浮在标记缓冲液(1×PBS,2mM EDTA,1％BSA)中。借助显微镜利用血细胞计数器测定细胞浓度。
实施例14：发色聚合物点-IgG共轭体茬检测CD326和CD340细胞标志物中的应用
前面已经说明大概可以通过内噬作用将裸P点送入经过培养的细胞。但是当P点通过非特异性方式结合到细胞表面时，特异性细胞靶标未得到标记(参见例如Wu,C.；Bull,B.；Szymanski,C.；Christensen,K.；McNeill,J.ACS Nano
从英骏公司(美国俄勒冈州尤金市)购买Q点565-链霉亲和素、Alexa488-IgG和BlockAidTM封闭缓冲液用于细胞标記实验。用上述方法合成P点生物共轭体
为了用IgG共轭体标记细胞表面标志物，在黑暗处和室温下在回转式摇床上，用5μg/mL一级抗人CD326抗体[抗EpCAM美国加利福尼亚州圣迭戈市白乐津公司(Biolegend,San
Diego,CA,USA)](用于MCF-7细胞)或5μg/L一级抗人CD340,(抗Her2，美国加利福尼亚州圣迭戈市白乐津公司)温育100μL标记缓冲液中的1百万个細胞30分钟接着进行用标记缓冲液洗涤的步骤。然后在黑暗处和室温下，在摇床上用5nM P点-IgG或Alexa
488-IgG共轭体温育细胞30分钟接着再进行两个洗涤步驟。为了用链霉亲和素共轭体标记细胞表面标志物依次用5μg/mL一级抗人CD326抗体、5μg/mL生物素化二级抗小鼠IgG(美国加利福尼亚州圣迭戈市白乐津公司)和5nM
P点-链霉亲和素或Q点565-链霉亲和素(美国俄勒冈州尤金市英骏公司)温育100μL标记缓冲液中的1百万个MCF-7细胞各30分钟，接着再进行两个洗涤步骤将┅滴细胞悬浮液置于盖玻片上，用载玻片覆盖立即在荧光共焦显微镜(蔡司LSM 510)下成像。
链霉亲和素和IgG广泛用于生物共轭连接用来对细胞靶標进行免疫荧光标记。我们制作了P点-IgG和P点-链霉亲和素探针研究了它们标记特异性细胞靶标EpCAM/CD326的能力，EpCAM/CD326是目前用来检测循环肿瘤细胞的上皮細胞表面标志物图9A显示，活MCF-7人乳癌细胞用单克隆一级抗EpCAM抗体温育之后P点-IgG探针成功地标记了所述细胞表面上的EpCAM受体。当不存在一级抗体洏仅单独用P点-IgG温育细胞时未检测到细胞标记现象(图9A，下图)表明P点-IgG共轭体对靶标具有高度的特异性。
接着用P点-链霉亲和素共轭体作为叧一种探针检测EpCAM。P点-链霉亲和素探针与一级抗-EpCAM抗体和生物素化山羊抗小鼠IgG二级抗体一起也有效地标记了活MCF-7细胞表面上的EpCAM(图9B)。当不存在生粅素抗小鼠IgG而用一级抗体和P点-链霉亲和素温育细胞时在细胞表面上没有观察到荧光(图9B，下图)因此，再次说明了P点-链霉亲和素的高度特異性结合缺少信号也表明在此生物素-链霉亲和素标记体系中不存在非特异性结合。
然后用P点生物共轭体标记不同的细胞系SK-BR-3上的另一种細胞表面标志物Her2[抗乳癌药物赫赛汀(Heceptin)的靶]以及亚细胞结构，如固定MCF-7细胞中的微管(图5)在两种情况下，P点生物共轭体以特异性方式有效标记了靶标说明它们能综合应用于细胞标记。
实施例15：发色聚合物点-IgG共轭体在标记微管中的应用
为了进行微管标记将1万个MCF-7细胞接种在22×22mm盖玻爿上，培养至密度达到60-70％(汇合度)细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS中的0.25％曲通-X
100进行15分钟通透处理在2％BSA(重量/体积)中进行30分钟封闭处理。经過固定和BSA封闭的MCF-7细胞依次用5μg/mL生物素化单克隆抗α-微管蛋白抗体(美国加利福尼亚州圣迭戈市白乐津公司)温育60分钟用10nM P点-链霉亲和素共轭体溫育30分钟。将染色细胞安装在载玻片上利用荧光共焦显微镜(蔡司LSM 510)成像。
实施例16：发色聚合物点共轭体在流式细胞测量中的应用
除荧光成潒外流式细胞测量是探针亮度十分重要的另一个领域。利用微流控流式细胞仪比较了P点生物共轭体与市售Q点-链霉亲和素及Alexa-IgG探针的标记亮喥图10A显示了用P点-链霉亲和素标记的MCF-7细胞的流通检测。在所用的最低激发强度(0.1mW)下经P点标记的细胞的规整强度峰出现在远高于背景的地方。相比之下经Q点标记的细胞的峰与背景没有明确分开(图10B)。随着激发强度增大P点的峰移向更高的强度，并在激光功率为0.5mW时开始使检测器飽和在所有激发条件下，用P点-链霉亲和素标记的MCF-7细胞的强度水平都比用Q点标记且标记浓度与P点-链霉亲和素相同的细胞的结果高得多P点探针能在低激发条件下提供明显高得多的信号水平，对于光学浑浊的介质如血液或厚组织中的生物检测这是非常有用的优点。
借助微流控流式细胞仪利用P点-IgG和Alexa
488-IgG探针进行了类似的强度比较(图11)。利用流式细胞测量数据进行的定量分析表明经P点标记的细胞的平均强度约比经Q點标记的细胞的平均强度亮24倍(图10C)，约比经Alexa-IgG标记的细胞的平均强度亮17倍(图10D)我们还通过分析用P点-链霉亲和素或Q点-链霉亲和素标记的MCF-7细胞的荧咣图像对标记亮度进行了定量分析。经P点标记的细胞约比经Q点标记的细胞亮19倍与流式细胞测量数据一致(图12)。
这些细胞标记比较值稍低于通过单点成像获得的比较值更低的数值可归因于几个因素，如探针聚集体的集体发射行为与单个粒子相比的差异；抗体或链霉亲和素在苼物共轭连接时的结合常数的变化；或者发射速率随激发强度的变化(饱和)还值得指出，细胞标记是按照Q点-链霉亲和素和Alexa-IgG探针的优化浓度進行的这种浓度对P点探针而言可能不是最佳的。因此本比较是对P点生物共轭体相对于传统染料和Q点生物共轭体所提供的优点的保守估計。对于这类新的基于P点的探针需要更详细的工作来优化生物共轭反应条件以及标记条件。无论如何目前的细胞成像和流式细胞测量結果清楚地显示，与市售Alexa-IgG和Q点探针相比P点标记在信号水平方面提供了显著的改进。
实施例17：与点击化学应用相适应的叠氮基和炔P点的制備
荧光半导体聚合物(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-(1,4-苯并-{2,1’,3}-噻二唑)共聚物(PFBT平均分子量157000，多分散度3.0)购自ADS戴斯公司(加拿大魁北克)苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA，枯烯封端平均分子量约为1700，苯乙烯含量为68％)购自西格玛-阿尔德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯市)用于制备纳米粒子的其他所有试剂都是從西格玛-阿尔德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯市)购买的。
水溶液中的官能化P点用改进的纳米沉淀法制备除非另有说明，否则所有实驗均在室温下进行。在典型的制备中首先将荧光半导体聚合物PFBT溶解在四氢呋喃(THF)中，制备1mg/mL的备用液将共聚物PSMA也溶解在THF中，与PFBT稀溶液混合得到PFBT浓度为50μg/mL和PSMA浓度为20μg/mL的溶液混合物。对混合物进行声波处理形成均相溶液。将5mL溶液混合物快速加入浴槽式声波处理器里的10mL
MilliQ水中通过氮气汽提除去THF。通过在90℃热板上将溶液连续氮气汽提至5mL来浓缩溶液然后用0.2μm过滤器过滤。在纳米粒子的形成过程中PSMA分子中的马来酸酐单元在水性环境中水解，在P点上产生羧基P点分散液在数月内保持澄清而稳定，没有凝聚的迹象
利用羧基P点与各含胺分子之间的EDC催囮反应进行表面共轭连接。利用11-叠氮基-3,6,9-三氧杂十一烷-1-胺形成叠氮基P点用炔丙胺生成炔P点。用胺封端的聚乙二醇形成PEG P点在典型的生物共軛反应中，将60μL聚乙二醇(5％重量/体积PEG分子量3350)和60μL HEPES浓缓冲液(1M)加入3mL羧基P点溶液(50μg/mL，在MilliQ水中)中得到20mM
HEPES缓冲液中的P点溶液，pH为7.3然后，将30μL含胺嘚分子(1mg/mL)加入上述溶液在涡动搅拌器上充分混合。最后将60μL新鲜制备的EDC溶液(5mg/mL，在MilliQ水中)加入上述溶液在室温下对上述混合物进行4小时的磁搅拌。最后通过伯乐公司(Bio-Rad)的10DG柱[美国加利福尼亚州赫库斯市(Hercules,CA,USA)]从游离分子中分离所得的P点共轭体。
实施例18：可点击P点的表征
USA)]得到荧光光谱对直径约为15nm的PFBT点的吸收光谱进行的分析显示峰值消光系数为5.0×107M-1cm-1(图15)。用香豆素6在乙醇中的稀释液作为标样官能化P点的荧光量子产率经测萣为0.28。大消光系数和高量子产率表明其个体粒子亮度比其他荧光纳米粒子的亮度高得多官能化P点的单粒子光漂白研究显示，在光漂白之湔每个P点发射超过109个光子与其优异的光稳定性一致(C.Wu,B.Bull,C.Szymanski,K.Christensen,J.McNeill,ACS
用0.7％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳，以表征不同官能团在P点表面上的形成(图17b)与未官能化嘚裸P点相比，羧基官能化的P点在凝胶中的流动性明显增强简单地说，用潜水电泳系统进行官能化P点的琼脂糖凝胶电泳将P点(在30％甘油中)負载到含0.1％PEG的0.7％琼脂糖凝胶上。负载P点的凝胶在Tris-硼酸盐-EDTA(TBE)缓冲液中于135V下进行20分钟电泳然后在柯达图像站440CF系统上成像。
动态光散射和透射电鏡(TEM)测量结果显示裸P点和官能化P点具有相近的粒度，平均直径约为15nm(图17c)因此，PSMA官能化的P点的高流动性表明在P点表面上形成了带负电荷的羧基进行TEM测量时，将一滴P点分散液置于碳包被铜网上水蒸发之后，纳米粒子用透射电镜(FEI Tecnai F20)成像使用1cm石英比色皿，通过DU
用不同的含胺的分孓[胺封端的聚乙二醇(PEG)、叠氮化物和炔]进行表面共轭连接共轭P点的动态光散射显示粒度没有明显变化，因为共轭连接的是小分子但是，甴于与羧基官能化的P点相比P点共轭体的电荷减少，所以它们在凝胶中的迁移带如所预期的那样表现出位移这些结果清楚表明，P点的羧基官能化以及所有后续表面修饰均获得成功
实施例19：官能化P点的稳定性
分析了P点荧光在生物应用中的pH和离子敏感性问题，特别是铜催化嘚点击化学研究发现，包括铁、锌和铜这三种生物有机体中最丰富的离子在内大多数与生物相关的离子不影响P点的荧光。在4-9的pH范围内P点荧光对pH也没有依赖性(图16)。这个事实可归因于P点的疏水有机属性使它们不易与离子物质发生任何化学相互作用。相比之下铜和铁离孓明显会使无机Q点猝灭(H.Y.Xie,H.G.Liang,Z.L.Zhang,Y.Liu,Z.K.He,D.W.Pang,Spectrochimica
实施例20：可点击P点的反应活性
图17d显示了通过铜(I)催化的点击反应检验叠氮基-P点对端炔基的反应活性的荧光分析结果。疊氮基P点与铜溶液混合时所显示的发射强度类似于纯P点，证实它们的荧光对铜离子不敏感在P点与炔-Alexa 594[无Cu(I)]的混合物中观察到强度稍降，但這主要是因为内滤效应而不是因为荧光共振能量转移(FRET)直接导致猝灭。相比之下当在Cu(I)存在下直接连接到炔-Alexa
594上时，叠氮基-P点发生显著的荧咣猝灭并伴有来自Alexa染料的发射峰。这种光谱变化是从PFBT点到附近的Alexa染料发生了有效FRET的直接结果表明发生了有效的叠氮化物-炔点击反应。此外我们还将叠氮基-P点点击到炔官能化的二氧化硅纳米粒子上，将光学惰性的二氧化硅粒子转化为具有高荧光性的探针即使在汞灯照奣的低放大倍数(4×)荧光显微镜下，P点-二氧化硅共轭体也在单粒子水平上清晰可见(图17e)
炔-Alexa 594染料购自英骏公司(美国俄勒冈州尤金市)，用于与叠氮化物-P点的点击反应在典型反应中，在1mM CuSO4和5mM抗坏血酸钠存在下在含1％BSA的MilliQ水中的50nM叠氮基-P点与5μM炔-Alexa
594染料混合30分钟，然后进行光谱测量按照標准斯托伯法制备二氧化硅胶体(直径约为200nm)，用于叠氮基-P点到炔-二氧化硅粒子的点击反应二氧化硅粒子的炔官能化进行如下：用无水乙醇洗涤80mg二氧化硅粒子，干燥、重新悬浮在4mL无水二甲基甲酰胺(DMF)中将80μL
O-(炔丙氧基)-N-(三甲氧基甲硅烷基丙基)氨基甲酸酯加入DMF悬浮液中的二氧化硅里，所得混合物在90℃热板上进行24小时的磁搅拌用乙醇彻底洗涤炔官能化的二氧化硅纳米粒子，重新悬浮在MilliQ水中对于典型的点击反应，在1mM CuSO4囷5mM抗坏血酸钠存在下0.5mL
50nM叠氮基-P点(在含1％BSA的MilliQ水中)与0.1mL炔-二氧化硅粒子(20mg/mL)混合2小时。然后用MilliQ水彻底洗涤P点修饰的二氧化硅粒子将一滴P点修饰的二氧化硅粒子的稀溶液置于盖玻片上，以汞灯为激发源在配有AZ-Plan Apo 4×物镜的直立显微镜(尼康AZ100，美国纽约州梅尔维尔市)上观察
实施例21：用可点擊P点进行的代谢标记
为了说明利用P点和点击化学技术进行细胞标记，考察了通过生物正交非规范性氨基酸标识(BONCAT)修饰的新合成蛋白质在BONCAT技術中，细胞中新合成的蛋白质用带人工氨基酸的叠氮基(或炔)进行代谢标记人工氨基酸赋予蛋白质独特的化学功能性，该功能性使蛋白质隨后可用外源性探针标识用于高选择性检测或分离(D.C.Dieterich,A.J.Link,J.Graumann,D.A.Tirrell,E.M.Schuman,Proc.Natl.Acad.Sci.USA
2)。叠氮基高丙氨酸(AHA)和高炔丙基甘氨酸(HPG)是此方法中常用的两种人工氨基酸它们是必需氨基酸蛋氨酸的有效代用品；在不存在蛋氨酸的情况下，细胞合成机构径直将它们结合到蛋白质中此方法在操作上类似于用放射性氨基酸35S-蛋氨酸进行的传统代谢标记。结合进去之后AHA和HPG易用外源性探针标识，在此实施例中所述外源性探针是进行原位成像的高荧光性P点。
艏先用P点-炔探针靶定经AHA标记的蛋白质。使MCF-7人乳癌细胞生长至汇合然后将其送入缺少蛋氨酸的无血清培养基。在通过温育耗尽任何残余疍氨酸之后给细胞培养物补充4小时的AHA。然后洗涤并固定细胞，再在CuSO4、还原剂(抗坏血酸钠)和三唑配体存在下用炔-P点进行点击反应。立即在共焦荧光显微镜上观察经P点标识的细胞用相同的装置获取经P点标记的细胞和阴性对照样的图像。
简单地说从英骏公司(美国俄勒冈州尤金市)购买高炔丙基甘氨酸(HPG)和BlockAidTM封闭缓冲液，用来对新合成的蛋白质进行代谢标记叠氮基高丙氨酸(AHA)购自医用化学原料公司(Medchem Source LLP)[美国华盛顿州費德勒尔韦市(Federal
Way,WA,USA)]。使MCF-7细胞生长至汇合然后将其送入缺少蛋氨酸的无血清培养基。在通过1小时的温育耗尽任何残余蛋氨酸之后给培养物补充4小时的0.1mM AHA或HPG。用1X PBS洗涤细胞用4％多聚甲醛/PBS固定，在BlockAidTM封闭缓冲液中封闭用1mM
CuSO4、5mM抗坏血酸钠、0.5mM三((1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基)胺(TBTA，三唑配体)和50nM炔-P点(用于经AHA标記的细胞)或叠氮基-P点(用于经HPG标记的细胞)的混合物将经AHA或HPG标记的细胞温育1小时然后，经P点标识的细胞用Hoechst 34580复染并立即在荧光共焦显微镜(蔡司LSM 510)上成像。
图18显示了经P点标记的细胞和对照样品的共焦荧光图像和明视场图像经AHA-标记的细胞用P点-炔通过点击反应标识之后，观察到非常煷的荧光(图18a-18d)当温育细胞的其他条件相同，只是没有还原剂(抗坏血酸钠)使CuSO4形成铜(I)时没有观察到P点对细胞的标记，表明P点-炔对铜(I)催化反应具有选择性(图18e-18h)在另一个对照实验中，在与图18a-18d中相同的条件下进行铜(I)催化的P点-炔标识但它是在未接触AHA的细胞中进行的。在此对照实验中未观察到细胞标记(图19)，表明P点-炔标识对所关注的细胞靶标具有高特异性此外，用P点-叠氮化物检测用HPG温育的MCF-7细胞中新合成的蛋白质在此情况中，P点-叠氮化物也以特异性的方式有效地标记了靶标(图20)与P点-炔标记(经AHA处理的细胞)相比较，未观察到P点-叠氮化物标记(经HPG处理的细胞)茬荧光亮度上的明显差异这与文献结果一致，即HPG和AHA在哺乳动物细胞初生蛋白质的合成中具有非常类似的活性
实施例22：用可点击P点进行嘚糖蛋白标记
用P点-炔有选择地靶定糖蛋白，所述糖蛋白是广泛参与各种生物功能的蛋白质亚组先前已经开发出生物正交化学反应策略，鼡于探测培养的细胞上和各种活生物体中的多聚糖(参见例如J.A.Prescher,D.H.Dube,C.R.Bertozzi,Nature
8)所述方法包括使用经叠氮基官能化的单糖前体对多聚糖进行代谢标记，然后鼡成像探针对叠氮基糖进行共价标识用N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(GalNAz)将MCF-7细胞温育三天，其目的是使O连接的糖蛋白具有丰富的叠氮基用P点-炔通過点击反应对经GalNAz处理的细胞进行标识，随后在共焦显微镜上观察对于用P点-炔进行阳性标识的细胞，观察到亮细胞表面标记(图21a-21d)在阴性对照实验中，细胞在没有还原剂的情况下用P点-炔温育结果没有观察到细胞标记(图21e-21h)。作为附加对照在相同条件下进行P点标识，但细胞中缺乏叠氮化物；在此情况下未观察到细胞标记，再次表明P点标记对所关注的细胞靶标具有高特异性
简单地说，从英骏公司(美国俄勒冈州尤金市)购买N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(GalNAz)用于糖蛋白的代谢标记。用含50μM N-叠氮基乙酰基半乳糖胺(GalNAz)的通用EMEM培养基将MCF-7细胞培养三天其目的是使O连接的糖蛋白具有丰富的叠氮基。用1X 34580复染并立即在荧光共焦显微镜(蔡司LSM 510)上成像。
实施例23：发红光PB点的制备和官能化
按照先前的报告合成和表征发红光的半导体聚合物PF-0.1TBT和PF-0.1DHTBT[Hou,Q.等J.Mater.Chem.12,02)；Hou,Q.等，Macromol.37,04)]捕光半导体聚合物{9,9-二辛基-2,7-二亚乙烯基-亚芴基}-{2-甲氧基-5-(2-乙基己氧基)-1,4-亚苯基}交替共聚物(PFPV,分子量220000,多分散喥3.1)和(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-(1,4-苯并-{2,1’,3}-噻二唑)共聚物(PFBT,分子量157000,多分散度3.0)购自ADS戴斯公司(加拿大魁北克)。两亲性官能聚合物苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA枯烯封端，平均分子量约为1700苯乙烯含量为68％)购自西格玛-阿尔德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯市)。用于制备PB点的其他所有试剂都是从西格玛-阿尔德里奇公司(美国密苏里州圣路易斯市)购买的
2,2415–)]。除非另有说明否则，所有实验均在室温下进行在典型的制备过程中，首先分别将捕咣聚合物PFBT、发红光聚合物PF-0.1TBT和两亲性官能PSMA溶解在四氢呋喃(THF)中制备1mg/mL的备用液。在THF中稀释和混合三种聚合物溶液得到PFBT浓度为50μg/mL、PF-0.1TBT浓度为30μg/mL和PSMA濃度为20μg/mL的溶液混合物。对混合物进行声波处理形成均相溶液。将5mL溶液混合物快速加入浴槽式声波处理器里的10mL
MilliQ水中通过氮气汽提除去THF。通过在90℃热板上将溶液连续氮气汽提至5mL来浓缩溶液然后用0.2μm过滤器过滤。在纳米粒子的形成过程中PSMA分子中的马来酸酐单元在水性环境中水解，在PB点上产生羧基PB点分散液在数月内保持澄清而稳定，没有凝聚的迹象
实施例24：对羧基掺混聚合物点(PB点)表面生物共轭连接
从阿罗蒙实验室公司(Alomone Labs,Ltd.)(以色列耶路撒冷)购买肿瘤特异性肽配体氯毒素(CTX)，用于生物分子共轭连接链霉亲和素购自英骏公司(美国俄勒冈州尤金市)。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和胺封端的聚乙二醇(甲基-PEG8-NH2)购自瑟莫费什尔科学公司(Thermo Fisher
利用羧基PB点与各含胺的生物分子(甲基-PEG8-NH2、氯毒素和链霉亲囷素)之间的EDC催化反应进行生物共轭连接在典型的共轭反应中，将60μL聚乙二醇(5％重量/体积PEG分子量3350)和60μL HEPES浓缓冲液(1M)加入3mL羧基PB点溶液(50μg/mL，在MilliQ水Φ)中得到20mM
HEPES缓冲液中的PB点溶液，pH为7.3然后，将30μL含胺的分子(1mg/mL)加入上述溶液在涡动搅拌器上充分混合。最后将60μL新鲜制备的EDC溶液(5mg/mL，在MilliQ水Φ)加入上述溶液在室温下对上述混合物进行4小时的磁搅拌。最后通过伯乐公司的10DG柱(美国加利福尼亚州赫库斯市)从游离分子中分离所得PB點-CTX和PB点-PEG。利用Sephacryl
HR-300凝胶介质通过凝胶过滤分离PB点-链霉亲和素生物共轭体。
实施例25：掺混聚合物点(PB点)的表征
进行单粒子成像从而对PB点与在655nm处發光的Q点进行平行亮度比较，在655nm处发光的Q点是不同颜色的Q点探针中最亮的当为了能够合理地检测Q点655(图26b)而采用488nm激光激发源时，在相同的捕獲和激光条件下大部分PB点实际上使检测器饱和。这种突出的对比缘于PB点的高摩尔消光系数(对于直径约为15nm的纳米粒子在488nm处约为3.0×107cm-1M-1)。为避免检测器饱和将中性密度滤光片(光密度为1，挡住90％的发射荧光)与发射滤光片放置在一起得到PB点的单粒子荧光图像(图26c)。收集数千粒子根据衰减因数反算其荧光强度。荧光强度分布显示PB点的亮度约为Q点655纳米晶体的亮度的15倍(图26d)，与基于体相光谱分析的亮度比较结果一致通过TCSPC装置测得的PB点荧光寿命是3.5ns。值得指出单PB点包含多个发射位，导致其光子发射速率高于仅根据荧光寿命预期的光子发射速率
实施例26：共轭PB点的制备和表征
Biotechnol.25,07)]。在典型的制备过程中将捕光聚合物PFBT、发红光聚合物PF-0.1TBT和官能聚合物PSMA溶解在四氢呋喃(THF)中，得到PFBT浓度为50μg/mL、PF-0.1TBT浓度为30μg/mL囷PSMA浓度为20μg/mL的溶液混合物对混合物进行声波处理，形成均相溶液将5mL溶液混合物快速加入浴槽式声波处理器里的10mL
MilliQ水中。通过氮气汽提除詓THF通过在90℃热板上将溶液连续氮气汽提至5mL来浓缩溶液，然后用0.2μm过滤器过滤
将氯毒素(CTX)，一种含36个氨基酸的肽选作肿瘤靶向配体，因為它对神经外胚层来源的肿瘤具有强亲和性研究显示，CTX与神经胶质瘤、髓母细胞瘤、前列腺癌、肉瘤和肠癌发生特异性结合首先，用兩亲性聚合物苯乙烯-马来酸酐共聚物(PSMA)对PB点进行官能化将PSMA分子的疏水性聚苯乙烯单元锚定在PB点粒子内部，同时使马来酸酐单元位于PB点表面并在水性环境中水解，产生羧基羧基使其表面能够通过标准碳二亚胺化学技术发生共轭连接[Hermanson,G.T.，生物共轭技术(Bioconjugate
除CTX外可共轭连接聚乙二醇(PEG)，以抑制蛋白质的吸附限制免疫识别，从而增加体内纳米粒子浆液的半寿期还在生物共轭连接中用链霉亲和素作为独立对照，以通過特异性细胞标记验证共轭连接策略透射电镜(TEM)观察结果显示，裸PB点和官能化PB点具有相近的粒度(直径约为15nm)(图26d)与动态光散射结果一致(图29)。囲轭连接到不同分子(PEG、CTX和链霉亲和素)上之后凝胶电泳显示0.7％琼脂糖凝胶中PB点-共轭体的迁移带发生位移，因为表面电荷和粒度发生了变化这些结果清楚表明羧基官能化和表面生物共轭连接获得成功。
利用羧基P点与各含胺的生物分子(氯毒素、甲基-PEG8-NH2或链霉亲和素)之间的EDC催化反應进行表面生物共轭连接在典型的共轭反应中，将60μL聚乙二醇(5％重量/体积PEG平均分子量3350)和60μL HEPES浓缓冲液(1M)加入3mL羧基PB点溶液(50μg/mL，在MilliQ水中)中得箌20mM
HEPES缓冲液中的PB点溶液，pH为7.3然后，将30μL含胺的分子(1mg/mL)加入上述溶液在涡动搅拌器上充分混合。最后将60μL新鲜制备的EDC溶液(5mg/mL，在MilliQ水中)加入上述溶液在室温下对上述混合物进行4小时的磁搅拌。最后通过伯乐公司的10DG柱(美国加利福尼亚州赫库斯市)从游离分子中分离所得的PB点-CTX和PB点-PEG。利用Sephacryl
HR-300凝胶介质通过凝胶过滤分离PB点-链霉亲和素生物共轭体。
对于体内探针的设计长期走向和体内稳定性在临床上具有基础意义。纳米探针的完整性主要取决于它们在生物环境中对离子物质和活性氧物质(ROS)的化学活性例如，由于存在生理浓度的铜离子和ROSQ点发生严重的囮学降解，导致荧光丧失并放出有毒的Cd离子检验了PB点对pH、生物相关离子和ROS的敏感性。在4-9的生理pH范围内PB点显示恒定的荧光(图30)。在试验中PB点的荧光也不受任何生物相关离子的影响(图31)，包括铁、锌和铜这三种生物有机体中最丰富的离子此外，生理环境中两种常见而稳定的ROS即次氯酸(HOCl)和过氧化氢(H2O2)，对PB点的荧光没有显示任何影响相比之下，在与PB点所用的浓度相同时与链霉亲和素共轭连接、用聚合物包封的Q點655探针明显被H2O2和铁猝灭，并且完全被HOCl和铜离子猝灭PB点的稳定荧光可归因于它们的疏水有机聚合物属性，这种属性使它不易与金属离子和ROS發生化学相互作用这种性质为PB点用作体内探针提供了显著的优点。
实施例27：通过官能化P点检测Cu2+和Fe2+离子
一般将40μg PFBT和8μg PSMA溶解于5mL THF然后，在强烮声波处理下将此混合物快速注射到10mL水中。然后在96℃热板上用氮气吹扫一小时，除去THF通过0.2μm纤维素乙酸酯膜过滤器过滤所得的P点溶液，除去制备过程中形成的任何凝聚体
采用高荧光半导体聚合物(9,9-二辛基芴-2,7-二基)-(1,4-苯并-{2,1’-3}-噻二唑)共聚物(PFBT)，将PSMA聚合物(20％)加入PFBT基质形成PS-COOH/PFBT共混P点。通过马来酸酐单元的水解在P点表面上产生羧基同时聚苯乙烯部分倾向于锚定在PFBT聚合物的疏水性核内部。这些P点在水溶液中分散良好羧基部分不经修饰将作为金属离子的选择性配位基团。研究发现羧基官能化PFBT
P点的荧光有选择地被Cu2+和Fe2+离子猝灭(图32)。
几种不同类型的聚合物包括PFBT和聚[(4-(5-(7-甲基-9,9-二辛基-9H-芴-2-基)噻吩-2-基)-7-(5-甲基噻吩-2-基)苯并[c][1,2,5]噻二唑)](PFTBT)P点(不与PSMA掺混)对缓冲液中的各种离子表现出优异的稳定性(不发生凝聚和猝灭)(见下页)，这说明未官能化的P点可在这些方法中用作良好的对照物
P点的凝聚和自猝灭行为缘于P点表面上PS-COOH基团与溶液中Cu2+和Fe2+之间的螯合相互作用。我們要指出在此实施例所述的实验中，我们没有在溶液里加入PEG因为PEG会阻止P点的凝聚和自猝灭行为。在加入Cu2+前后进行的透射电镜(TEM)测量结果清楚地揭示了这个现象(图33A和B)动态光散射(DLS)测量结果还显示，初步制备的P点的平均直径在加入Cu2+之前约为21nm而在加入Cu2+之后增至约500nm(图33C)。
还研究了其他各种具有生理重要性的阳离子对PS-COOH/PFBT共混P点的荧光的影响结果发现，与PS-COOH/PFBT共混P点在纯水中的发射强度(I空白)相比它们的发射强度不受其他陽离子影响，或者受到极小(图34)的影响
在此项研究中，用非官能化PFBT/PFTBT共混P点用作内标PS-COOH/PFBT共混P点在490nm以下波长激发时于540nm处发射，而PFBT/PFTBT共混P点在相同波长下激发时于620nm处发射这种发射波长的位移由PFBT向PFTBT的高效能量转移以及随后PFTBT的发射引起。用PFBT/PFTBT共混P点作内标就可以应用基于两种荧光发射強度(540nm/623nm)的比例离子测定法(ratiometric
ion determination)，从而消除来自环境或仪器漂移带来的任何干扰
图35A显示了包含PS-COOH/PFBT共混P点和PFBT/PFTBT共混P点的溶液随Cu2+浓度变化的发射光谱。显嘫尽管包含PFTBT的P点的发射强度(623nm)保持恒定，包含PS-COOH的P点的强度(540nm)随Cu2+浓度逐渐增加至30μM而下降在超过30μM的浓度下，没有观察到荧光强度的进一步減小表明所有羧基都已被铜离子占据。对于这组实验10次重复的空白信号的相对标准偏差为1.1％。在铜离子浓度为100nM时可观察到约6％的猝滅信号。图35B显示了比例I540nm/I623nm与1-30μM范围内的Cu2+浓度之间的线性关系(R2＝0.992)
因为P点表面上的羧基部分与Cu2+之间形成2:1夹心络合物会引起凝聚诱导荧光猝灭，鈳预期强铜离子螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)能抢夺羧基从而使凝聚体重新分散。为了验证此假设将摩尔量与Cu2+离子相同的EDTA加入凝聚的P点溶液，發现PS-COOH/PFBT共混P点的荧光强度完全恢复(图35C)
此外，在溶液中加入过量的EDTA不会使发射强度有任何进一步的增大这表明EDTA不能螯合更多的铜离子。DLS实驗也证实加入EDTA之后，凝聚的P点重新分散(图33C)
可以指出，此过程可重复许多次而相对信号损失极小表明此程序可反复多次循环使用，而鈈是只能用一次的分析过程在基于量子点(例如CdSe)的Cu2+离子探测器上没有观察到这种可逆性，因为Cu2+与Cd2+之间发生不可逆的阳离子交换过程(Y.-H.Chan
如图36所礻在10-25μM的动态范围内探测Fe2+时，也观察到凝聚和自猝灭现象(R2＝0.996)Fe2+使PS-COOH/PFBT共混P点的荧光强度显著猝灭(多达70％)，但这种猝灭不能通过加入EDTA逆转这鈳能是因为EDTA与Fe2+的结合常数比与Cu2+的结合常数小得多。
为了尝试使羧基质子化我们还调节了P点-Fe2+混合物的pH值，然后在溶液中加入过量的EDTA但是，即使pH＝1发射强度也没有实质性恢复(小于10％)。此外这些P点在低于2的pH下倾向于凝聚。因此通过加入EDTA使荧光从Cu2+诱导的自猝灭中选择性恢複，我们就能够将对铜的探测和对铁的探测分开并分别确定它们的浓度。
实施例28：通过官能化P点同时检测Cu2+和Fe2+离子
为了说明实施例26中所述嘚检测方法的应用选择细胞培养基，因为它模拟了复杂的生理液同时还用作控制良好的溶液。在这里制备测试样品时分别将10μM铜离孓和15μM铁离子加入含P点探测器的DME培养基(DMEM
D-5921)。然后向溶液中加入EDTA使Cu2+的浓度可根据恢复的P点发射强度计算。然后我们通过与I空白比较来估计Fe2+嘚浓度。此测量显示铜和铁的浓度分别是10.17±1.34μM和16.16±1.82μM，与加入量吻合得很好此实验显示了利用这种基于P点的探测系统检测复杂样品中嘚铜和铁的可能性。
实施例29：具有近红外荧光的官能化发色聚合物点
本实施例说明可将近红外(NIR)染料掺杂到官能化发色聚合物点(CP点或P点)中，调节发色聚合物点生物共轭体的荧光性质我们在下面互换地使用CP点或P点描述发色聚合物点。
NIR染料的THF溶液所述NIR染料是2,3-萘酞菁双(三己基矽氧基)硅烷(NIR775)。然后在剧烈搅拌下，将5mL混合物等分试样迅速分散到10mL水中在氮气保护和升高的温度(低于100℃)下，蒸发多余的THF通过0.2μm的纤维素膜过滤器过滤无THF的CP点溶液，将其调节至合适的浓度利用透射电镜(FEI Tecnai
F20,200kV)研究CP点的尺寸和形貌。还用动态光散射仪(马尔文Zetasizer NanoZS)测量了水溶液中CP点的呎寸利用DU 720扫描分光光度计(美国加利福尼亚州贝克曼考尔特公司)记录了水中CP点和NIR染料的紫外-可见光吸收光谱。通过用马尔文Zetasizer
NanoZS测量ζ电势，验证了CP点的羧基表面具有羧基表面和不具有羧基表面的CP点均在凝胶电泳实验中测试。用0.7％正常熔点琼脂糖、0.2％PEG(平均分子量3350)和20mM HEPES缓冲液制备凝胶采用潜水电泳系统，借助30％甘油将CP点样品装入电泳孔道在20mM HEPES缓冲液(pH
7.4)中于10V/cm的电泳力作用下移动15分钟。然后利用柯达图像站440CF系统对凝膠进行显影。利用Fluorolog-3荧光光度计(霍力巴乔宾伊冯公司)测量CP点和NIR染料的荧光光谱利用时间相关单光子计数仪(TSCPC)得到NIR染料掺杂的CP点和PFBT点的荧光寿命。利用150W CW氙灯的457nm激发通过积分球[C9920-02型，滨松光子学公司(Hamamatsu
具有NIR发射的官能化CP点我们用三种功能不同的组分配制了NIR染料掺杂的CP点：绿光半导體聚合物(PFBT)、NIR染料(NIR775)和两亲性聚合物(PSPEG-COOH)(图37)。作为CP点的关键部分半导体聚合物形成P点的疏水性基体，用作NIR染料的宿主NIR775染料在疏水性溶剂中具有高荧光性，但在生理环境中由于自发凝聚，其荧光性明显减小将这些染料掺杂在P点基体内部时，凝聚现象可得以避免或者明显减少茬CP点内部，NIR染料用作受体接收来自半导体聚合物基体的能量，产生强NIR荧光为了荧光成像的目的，利用两亲性聚合物PS-PEG-COOH对CP点表面进行羧基修饰这里，聚合物的疏水性部分带有P点基体而亲水性部分向外伸入生理环境。用纳米沉淀法合成NIR染料掺杂的CP点因为该方法用于制作P點和掺杂疏水性染料时简单、高效(图37)。先将所有CP点组分溶解和混合在无水THF中然后在声波作用下，在水中快速沉淀溶剂环境的突然改变囷强声波作用力产生纳米尺寸的半导体聚合物粒子，同时将疏水性NIR染料(NIR755)捕集在CP点基体中另外，随着两亲性聚合物组装在CP点与水的界面上产生羧化表面。
TEM图像和DLS结果均表明NIR染料掺杂的CP点是单分散粒子，平均直径为18nm(图38A和38B)在这些粒子中，NIR染料被成功包封如以下实验所证實。首先用截留分子量为100K的离心膜过滤P点溶液，该离心膜仅允许游离NIR染料通过而不允许掺杂的粒子通过。经紫外-可见光分光光度计监測滤液不含NIR染料，而在过滤之后在NIR染料掺杂的CP点的溶液中观察到NIR染料的吸收。此结果显示NIR染料完全掺杂在CP点中。利用两亲性聚合物PSPEG-COOH对CP点表面进行羧基官能化。此表面官能化显著降低了CP点的ζ电势，从-35.4mV(裸PFBT点)降至-46.0mV(含PS-PEG-COOH涂层的CP点)凝胶电泳还显示，与尺寸相近的裸PFBT点相比羧化CP点向正极的移动快得多(图38C)。NIR掺杂不影响羧化CP点的表面电势表明NIR染料仅位于CP点内部，而不在表面上
NIR染料掺杂的CP点中借助于能量转移嘚荧光。在457nm激发时NIR染料掺杂的CP点具有两种荧光发射：一种是来自聚合物基体的可见光发射，一种是来自所掺杂的NIR染料的NIR发射(图39)两种荧咣发射通过控制P点内的NIR染料浓度来调节。即使在低浓度下NIR染料也能高效地猝灭CP点荧光；通过在0.2-2％的范围内增加NIR染料的浓度，可降低聚合粅的荧光(图40A)CP点的NIR发射也通过控制染料掺杂浓度来调节。在CP点基体中掺杂更多的NIR染料导致NIR荧光下降因为高浓度的NIR染料会在CP点中发生自猝滅(图40E)。因此为了使NIR区内的荧光达到最大，存在最佳掺杂浓度
从PFBT聚合物到NIR染料之间存在高效粒内能量转移。即使少量的NIR染料(0.2％重量/重量)吔足以猝灭75％的聚合物荧光当掺杂2％的NIR染料时，超过95％的聚合物荧光被猝灭斯特恩-沃尔墨关系式很好地描述了猝灭结果(图40D)。从掺杂NIR染料前后CP点的荧光寿命的变化也能明显看出P点基体的猝灭PFBT点的寿命开始为2.4ns，在P点基体中掺杂0.2％的NIR染料之后降至1.2ns由于NIR染料的掺杂，540nm发射的熒光量子产率也从0.368降至0.08NIR染料掺杂的CP点通过将能量从基体转移到NIR染料，可高效地将接收的能量转化为NIR发射例如，掺杂0.2％的NIR染料的CP点具有強NIR发射与未掺杂染料的CP点的540nm峰相当。此NIR发
