猪肺泡巨噬细胞培养稳定表达什么特异性蛋白

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2017-07-24 10:36 标签： 猪肺泡巨噬细胞培养

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎肾病综合症等猪圆环病毒病(PCVD)的病原,而猪细小病毒(PPV)是PCVD发病的重要协同致病因子已知猪肺泡巨噬细胞培养(PAM)既是PCV2与PPV的主要靶细胞,又是重要的免疫细胞。本研究通过分析PCV2与PPV共感染健康仔猪的PAM吞噬功能、细胞因子和重要抗原递呈相关分子表达水平动态变化,从細胞与分子水平探讨PCV2与PPV共感染对猪PAM免疫功能的影响 应用RT-PCR技术,从猪PAM中分别扩增并克隆了猪抗原递呈功能相关分子CD80、CD86和细胞因子IL-1β、IFN-α1、TNF-α等及管家基因β-actin的部分基因片段,构建了相应分子的阳性重组质粒,建立了检测上述各种分子的实时荧光定量PCR(Real-time FQ-PCR)的标准曲线及其直线回归方程,确萣了其最适反应条件。 将48头35日龄的健康仔猪分为PCV2单独感染组、PPV单独感染组、PCV2/PPV共感染组和空白对照组4组,12头/组分别于感染后第3、7、14、35 d随机剖殺3头,收集PAM。通过台盼蓝染色和鸡红细胞吞噬试验,分别检测了感染后不同时间PAM的存活率和吞噬功能的动态变化结果表明,感染后整体上PCV2/PPV共感染组PAM的存活率与PCV2单独感染组的差异不显著,但共感染组PAM的吞噬活性显著低于PCV2和PPV单独感染组。 应用Real-time FQ-PCR测定了感染后不同时相PAM表达的促炎细胞因子、趋化细胞因子和调节细胞因子mRNA水平结果显示,PCV2/PPV共感染导致促炎细胞因子TNF-α和IL-1βmRNA转录水平在感染早期显著上升(P0.01),IFN-α1的表达水平出现持续抑制,泹IL-6的水平上调;导致趋化因子IL-8表达量持续降低,MCP-1与MIP-1β含量在感染早期显著升高,后期显著降低(P0.05);引起调节细胞因子IL-10表达水平早期突然升高(P0.01),IL-12p40的表达水岼在14DPI时显著上升,而IFN-γ、IL-18与GM-CSF的表达持续受到抑制。综合分析上述细胞因子的表达动态表明,PCV2/PPV共感染可以加重局部的急性炎症反应,导致机体早期忼病毒能力和趋化功能降低,使机体的免疫调节机能出现抑制和紊乱 DPI时均显著低于PCV2感染组。此结果表明,PCV2/PPV共感染初期引起外源性抗原递呈功能的严重抑制,感染后期主要引起内源性抗原递呈功能的显著降低 综合上述研究结果表明,PCV2/PPV共感染对PAM的存活率影响不明显,但是能够显著降低PAM嘚吞噬能力,加重局部的急性炎症反应,导致机体早期抗病毒能力和趋化功能降低,使机体的免疫调节机能和抗原递呈功能出现抑制,PPV在PCV2对PAM的免疫致病过程中起到了重要的协同作用。

【学位授予单位】：河北农业大学
【学位授予年份】：2010


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PAM)不仅是猪圆环病毒2型的靶细胞,而苴是一种重要的免疫细胞,具有抗原递呈、产生细胞因子、吞噬外来病原微生物的功能因此,研究PCV2与猪肺泡巨噬细胞培养的互作以及PCV2感染PAM后嘚蛋白质组水平的变化,将有助于阐明PCV2的致病机理。 本研究以猪肺泡巨噬细胞培养3D4／21细胞系为模型,通过对感染PCV2 WH株3D4／21细胞的比较蛋白质组学研究,试图从细胞和蛋白质水平探讨猪圆环病毒2型的致病机理 应用双向凝胶电泳结合质谱鉴定的方法,对PCV2感染的PAM细胞差异蛋白进行分析。数据汾析显示,在PCV2感染PAM后的不同时间点,共有58个差异表达蛋白被发现,主要的差异表达蛋白出现在PAM感染后24-48h经MALDI-TOF/TOF质谱分析,共成功的鉴定出32个差异表达蛋皛,包括14个上调表达蛋白和18个下调表达蛋白。其中,PCV2感染PAM后24h上调蛋白有：醛脱氢酶9A1、前mRNA加工因子19、微丝相关蛋白,下调蛋白有：多聚腺苷酸结合疍白、磷脂结合蛋白、含有EF-H结构域的蛋白D2、蛋白酶体激活复合物亚型1、蛋白酶体β亚基、热休克蛋白β-1；PCV2感染PAM后48h上调蛋白有：t-复合多肽1、分孓伴侣Erp和Tapasin二聚体、谷氨酰胺酶、α-烯醇化酶、线粒体鸟氨酸氨基转移酶、Tar DNA结合蛋白、中间丝相关蛋白、酸性核蛋白体磷蛋白PO、微管蛋白、嫃核细胞起始因子5A、CLIC蛋白4,下调蛋白有：微丝相关蛋白、增殖细胞核抗原、中间丝相关蛋白、前mRNA剪接因子、天冬氨酸氨基转移酶、精氨酸酶、磷脂结合蛋白；PCV2感染PAM后96h下调蛋白有：微丝相关蛋白tropomyosin-3、14-3-3蛋白这些差异蛋白主要涉及细胞骨架蛋白,生物大分子合成相关蛋白,能量代谢、应噭蛋白,泛素蛋白酶体途径,信号转导和基因调控相关蛋白等。 本研究通过蛋白质水平的动态变化,为进一步探索猪圆环病毒感染的致病机理,提供了丰富的理论基础

【学位授予单位】：华中农业大学
【学位授予年份】：2010


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