有参考基因组的转录组测序
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编号：#1183
发布时间： 20:29:07
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简介：&&&&目前转录组测序是指利用第二代高通量测序技术进行cDNA测序，全面快速地获取某一物种特定器官或组织在某一状态下的几乎所有转录本。在真核生物中mRNA具有poly A的结构，因此可直接利用oligo dT将mRNA纯化出来；而在原核生物中，mRNA并不像真核生物的mRNA那样具有poly A的结构，因此无法直接利用oligo dT将mRNA纯化出来，而是通过有效去除rRNA的方式来提升原核生物mRNA的量，从而用于后续的高通量建库和测序。一、技术路线Illumina Nextseq 500、Illumina MiSeq、Illumina HiSeq 2500和Ion Proton二、生物信息分析?&真核生物信息分析流程图&&标准信息分析1.&原始数据整理、过滤及质量评估2.&与参考基因组比对& 2.1& Reads与参考基因组比对情况统计& 2.2& Reads在参考基因组不同区域的分布情况& 2.3& Reads在染色体上的密度分布情况& 2.4& Reads比对结果可视化3.&蛋白编码基因的表达量分析&& 3.1&&基因覆盖度统计& 3.2&&样品间相关性分析4.&蛋白编码基因的表达量差异分析(样本数≥2)5.&差异表达基因的富集分析(GO、KEGG)(样本数≥2)6.&差异表达基因的聚类分析(热图)(样本数≥3)7.&可变剪切分析&8. UTR分析9.&新转录位点预测10. cSNP分析11. Indel分析高级信息分析1.&给出样品中ncRNA的分布状态；&&2.&融合基因分析（仅限物种是人，建议15对以上&control+case）；3.&主成分分析（五个或五个以上样品）；4.&条件特异表达分析（五个或五个以上样品）5.&样本特异表达及共有表达基因维恩图；6.&生物学重复分析；7.&蛋白互作网络分析（CytoScape出图，需要针对有uniprot注释的物种，并且只针对特定的某些基因）；8.&转录本定量；9.&外显子定量；&10. RNA编辑。&?原核生物信息分析流程图&&标准信息分析1.&原始数据整理、过滤及质量评估2.&与参考基因组比对& 2.1& Reads与参考基因组比对情况统计& 2.2　Reads在参考基因组不同区域的分布情况& 2.3　Reads在染色体上的密度分布情况& 2.4　Reads比对结果可视化3.&蛋白编码基因的表达量分析&& 3.1基因覆盖度统计& 3.2样品间相关性分析4.&蛋白编码基因的表达量差异分析(样本数≥2)5.&差异表达基因的富集分析(GO、KEGG)(样本数≥2)&6.&差异表达基因的聚类分析(热图)(样本数≥3)7. SNPs的分析8.&基因结构分析& 8.1转录起始位点& 8.2终止位点分析9. UTR分析&& 9.1预测和长度分布&& 9.2 5’UTR SD序列预测& 9.3 3’UTR不依赖σ因子的终止子预测10.&操纵子预测分析11. CRISPRs RNA分析12. antisense RNA预测高级信息分析1.&启动子预测，针对10个以内差异基因进行预测2. sRNA分析&& 2.1 sRNA预测和长度分布&& 2.2 sRNA二级结构预测&& 2.3 s RNA&靶基因预测(限于10条以内)&三、结果展示&&&四、样品要求1.&总RNA：针对Ion proton测序平台，浓度≥100 ng/ul，要求总量≥12 μg；针对Illumina测序平台，浓度≥80 ng/ul，总量≥12 μg；OD260/280介于1.8-2.2之间，OD260/230值应≥2.0。电泳检测28S:18S至少大于1.5；并确保RNA无降解，无污染。2.&组织样品：动物、植物、微生物总量大于500 mg的新鲜样品(植物材料应尽量选取幼嫩部位)。采样后将样品立即用RNAlater和液氮速冻，保存于-80℃(保存期不超过一个月)，送样时使用干冰运输(不超过72 h)；提取RNA后经变性电泳，保证各RNA条带清晰、比例适中、完整性好、无降解。特别要求样品分成3份，方便后续提取，避免同一份样品反复冻融造成样品降解。3.&细胞样品：先使用TRIzol试剂进行处理，每0.25 mL样品(5-10×106个细胞)加入0.75 mL TRIzol试剂(可参考TRIzol试剂说明书)，于-80℃保存，并提供2-3份该样品。原则上不接收未经TRIzol处理的细胞样品。4.&样品保存期间切忌反复冻融。5.&送样管务必标清样品编号，管口使用Parafilm膜密封。&五、派森诺优势1.拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台Illumina Nextseq 500、Illumina MiSeq、Illumina HiSeq 2500和Ion Proton，实验周期短，质量可靠。2.技术人员经验丰富，可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。&3.拥有专业的生物信息团队和完整的生物信息分析服务体系，除提供标准化生物信息服务外，还可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。&4.拥有标准的、实时更新的项目进展流程，有助于合作伙伴及时了解项目进展最新情况。&5.派森诺免费提供文章写作指导服务和文章润色服务。转录组测序分析脑神经脊基因网络调控背景：神经系统是生物体内起主导作用的功能调节系统。高等动物的结构与功能均极为复杂，体内各器官、系统的功能和各种生理过程都不是各自孤立地进行，而是在神经系统的直接或间接调节控制下，互相联系、相互影响、密切配合，使其成为一个完整统一的有机体，实现和维持正常的生命活动。目的：本文通过Illumina HiSeq2000平台分析鸡胚胎脑神经脊基因的调控网络，同时结合荧光定量PCR、原位杂交、抗体标记验证实验，挖掘差异表达基因以及神经调控通路的差异。结果：通过转录组测序共得到1558个差异表达的基因，1301个上调的基因和257个下调的基因。对上调的基因进行分析发现：和酶调控相关基因所占比例为41%，转录调节相关基因所占比例为17%，转运蛋白和激酶相关基因所占比例均为11%等。同时对脑神经脊与调控通路、生物过程、疾病相关性进行分析，脑神经脊与整合蛋白信号通路（integrin signaling)&、CXCR4&信号通路相关、RNA加工和骨骼发育不良有关，并在整合蛋白信号通路中、RNA加工过程和骨骼发育不良中表现出上调的现象，在CXCR4信号通路中既有上调的也有下调的，但上调的占主导的位置。该研究为神经脊基因网络调控的研究奠定了坚实的理论基础。原文索引：[Marcos Simo~es-Costa, et al. Transc riptome analysis reveals novel players in the cranial neural crest gene regulatory network. Genome Research, -.]水稻和真菌(已知)互作的混合转录组分析&背景：稻瘟菌所引起的稻瘟病是造成水稻减产的重要病害之一，每年因为稻瘟病造成10%-30%的产量损失，严重的时候甚至造成颗粒无收，俗称水稻的癌症。随着水稻和稻瘟菌全基因组测序计划的完成，水稻-稻瘟菌相互作用的分子机制研究已成为植物-病原物互作研究的模式系统。&目的：利用Illumina平台对正常水稻叶片、稻瘟菌及感染24小时后的水稻叶片进行转录组测序，研究在稻瘟菌侵染早期水稻和稻瘟菌的基因表达情况，从而全面了解侵染早期水稻-稻瘟菌相互作用的分子机制。&&& &&&结果：通过序列同源比对，发现61.5%–62.4%的reads比对到水稻基因组上，只有0.1%–0.2%的reads比对到真菌基因组上，这是由于侵染早期(24h内)真菌还没有大量侵入植物细胞。通过分析真菌侵染水稻前后的基因表达情况，发现大量基因表达上调，其中有编码分泌蛋白的240个基因，说明它们在侵染早期起着重要的作用。进一步研究发现相对于亲和互作菌株，非亲和互作菌株对水稻的影响更大。原文索引：[Kawahara Y, Oono Y, Kanamori H, et al.&Simultaneous RNA-seq analysis of a mixed transc riptome of rice and blast fungus interaction.&PLoS One, ): e49423]1、Q:&什么是mRNA测序(RNA-seq)&&&&&&A：转录组学(transc riptomics)是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA(包括mRNA和非编码RNA)的类型与拷贝数。Illumina提供的mRNA测序技术可在整个mRNA领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品制备和数据分析软件支持在所有物种中的mRNA测序研究。2、Q:&如何进行原核生物转录组分析？& & &&A：针对原核生物的mRNA没有poly A尾巴的情况，需要提供去除rRNA后经过纯化的原核生物mRNA或cDNA样品。3、Q:&转录组测序与基因表达芯片相比有哪些优势？& &&&&A：与基因表达芯片相比，转录组测序具有如下优势：首先，应用范围广。转录组测序无需预先设计探针或了解物种的基因组信息，同样适用于基因组序列未知物种；第二，准确性高。基因芯片原理是基于核酸单链间的互补杂交，当杂交条件不同时，或者丢失低拷贝转录本信息，或者假阳性率高。而转录组测序是基于对转录本序列的测定，准确性很高，而且当测序深度足够时，能够检测到极低低丰度表达的转录本信息。第三，信息丰富。转录组测序除了可以用于基因组注释和基因转录表达分析，而且能发现新基因，检测可变剪切，SNPs，融合基因等。因此，转录组测序在诸多方面优于基因表达芯片，已经成为基因注释、表达检测和发现新基因等方面的主流技术。4、Q:&转录组测序和数字表达谱测序有什么区别？& & &&A：转录组测序和数字表达谱测序相比，主要有以下不同：第一，测序目标不同。转录组测序可以测定特定组织中全部mRNA，而表达谱测序只是测定mRNA的酶切标签序列(21 bp)；第二，代表性不同。数字表达谱测序只测定21 bp序列，而转录组测序测定转录本全长，因而可以更准确地代表样品转录表达情况；第三，应用范围不同。转录组测序应用范围广泛，不仅可以检测表达量差异，而且可以发现新的转录本和可变剪切等。而表达谱测序只能粗略检测表达量差异，不能反映基因转录表达的特点和规律；第四，参考序列要求不同。转录组测序不仅可以适用于基因组序列已知的物种，而且也适用于基因组序列未知的物种。而表达谱测序只适用于基因组序列已知的物种。因此，对于想要检测表达量差异的客户，我们推荐进行转录组测序，以获知更精确的转录组信息。5、Q:&转录组测序需要多少测序量？&&&&&&A：转录组测序所需的测序量随物种转录组大小的不同而有所差异。而转录组的大小受基因数目和丰度双重影响，不同物种间变化很大。因此在测序之前，需要对转录组的大小进行评估。①针对有参考基因组的物种，可通过分析基因组信息，统计编码基因个数及其碱基数来评估转录组的大小，同时也可参考相近或相关物种转录组研究的文章；②针对无参考基因组的物种，只能参考相近物种的转录组大小。目前，为保证数据分析结果的可靠性和准确性，对于Illumina Hiseq 2000平台，派森诺生物推荐对有参考基因组的转录组采用最低3-4 Gb clean data进行后续分析，如果想检测到低丰度的转录本推荐采用6-8 Gb clean data。如果没有参考基因组，需要进行转录本的拼接组装，为了拼接组装的完整性，派森诺生物推荐最低6-8 Gb clean data的转录组测序。对于Illumina Miseq平台，目前读长可以达到2×250 bp，针对没有参考基因组的物种，长读长拼接可以得到更加完整的转录组结果，建议至少测2.5 Gb的数据量。6、Q: Raw data如何读取？为什么不提供原始图像数据和中间过程文件？&&&& A：数据文件以txt文本格式为主。对于Windows用户，推荐使用Editplus&或UltraEdit作为浏览程序，否则会因文件过大造成死机。Unix或Linux系统比较适于浏览较大的文本文件。由于Illumina更新了pipeline，测序过程中生成的图像文件将实时转化为中间过程文件，这一步完成后图像文件将自动删除，得到中间过程文件(此文件为二进制文件，只有在Illumina机器上才能读取，通常不保留)，在Illumina分析软件下将转化为序列文件。即所说的raw data。目前各公共数据库接受fastq文件，所以我们提供的raw data都是fastq文件。地址：上海市徐汇区银都路218号聚科生物园区2号楼总机： 021-传真：021-市场部：　　过去，人类常见病的研究主要是利用全基因组关联研究（GWAS）来筛查共有的变异体。近年来，测序技术的蓬勃开展以及个性化医疗的目标让科学家们从共性转移到个性，努力发现稀有的变异体。
尽管新一代测序平台的出现让测序费用迅速下降，然而每个碱基的费用仍然阻碍了更多完整测序的基因组出现。除了经济上的限制，人们还普遍意识到很难从如此多的变异体中鉴定出真正起作用的位点。基于这些原因，研究人员通常一开始就关注编码区的变异体。这也就催生了外显子捕获技术。罗氏NimbleGen于去年初最先推出了外显子捕获芯片，从基因组DNA中抓出外显子部分，然后测序。这一步也是价格不菲，于是人们退一步，以转录组测序（RNA-Seq）作为替代。尽管这种方法无疑将错过一些低表达基因，但它的优势是产生了更多的信息，比如基因表达水平和剪接模式。
这些方法究竟孰优孰劣？美国杜克大学医学院人类基因组变异中心以及国家癌症研究所的研究人员将高覆盖度全基因组测序和RNA-Seq所鉴定出的变异体进行了比较，来系统研究RNA-Seq在鉴定人类编码变异体方面究竟效果如何。这个研究结果发表在5月28日的《Genome Biology》上。
研究人员从同一个个体的外周血单核细胞（PBMC）中提取出DNA和RNA，并利用Illumina的对cDNA和gDNA分别测序。gDNA的测序产生了14.5亿个读数，每个读长75 bp。cDNA的测序产生了2.8亿个读数，一半读长75 bp，一半读长68 bp。
之后，研究人员利用SAMtools来检出两个序列中的单核苷酸变异体（SNV）。插入缺失和大的结构变异体不包括在内。在gDNA中，SAMtools检出了外显子中的51,055个SNV，在cDNA中则检出了64,128个。其中，gDNA的48,740个和cDNA中的40,605个通过了质量控制过滤。
他们还直接评估了RNA-Seq在鉴定变异体上的灵敏度和特异性，并评估了覆盖度和基因的表达水平这些关键因素如何相互作用，影响表现。研究人员发现，在全基因组测序中所鉴定出的外显子变异体中，只有40%被RNA-Seq所捕获，然而，若只集中在PBMC表达的基因，这个数字就上升到81%。研究人员还发现，在处理RNA-Seq数据时，假阳性率高可能是个问题，特别是当覆盖度水平高时。
作者认为，只要有高表达基因的组织来源，并执行了适当的质量控制筛选，在发现高水平表达基因的编码变异体时，RNA-Seq是一种快速廉价的替代方法。（生物通 余亮）
原文摘要：
Screening the human exome: a comparison of whole genome and whole transcriptome sequencing
Genome Biology
doi:10.1186/gb--r57
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联系信箱：在转录组测序分析中,对于没有参考基因组信息的序列怎样进行注释,差异分析
在转录组测序分析中,对于没有参考基因组信息的序列怎样进行注释,差异分析 此外,在转录组结果分析中,转录本有没有通俗一点的解释,或者,转录本有没有一个固定的含义还是说不同情况下含义不同?
转录本是一个基因序列通过一种剪切后所得的能RNA.以前说转录本都是说表达蛋白的.现在LncRNA的研究多了,也说是一个转录本了.还有没有参考基因组序列的,一般是不可能去GO功能注释的.因为去功能注释的时候要有一个背景.
与《在转录组测序分析中,对于没有参考基因组信息的序列怎样进行注释,差异分析》相关的作业问题
Unigene其实没有一个标准的定义.大体的概念是经过去冗余之后得到的基因序列,这条序列和其他的序列是非冗余的,也就是理论上其他序列都和此序列代表的不是同一个基因.或者是经过聚类后得到的不同的类,类和类之间是非冗余的,每个类可以认为唯一的代表一个基因.不同的去冗余和聚类的方法得到的结果都可以称为unigene.另外NC
你先设计一段前半段的引物看看到底有没有正确的那部分序列吧.
所谓关联参考方向是指流过元件的电流参考方向是从元件的高电位端指向低电位端,即是关联参考方向,否则是非关联参考方向.这是邱关源老师最地道的回答!
华大基因. 具体价格要跟对方的工程师谈.我们实验室做过一株细菌的全基因组测序和转录组测序分析.其实测序不是主要问题,注释才是主要问题…… 以及最近几年测序的价格掉得很快,华大也是发了二十几点文章的大公司,我们平时测序列也在华大,还是可以信一下的.具体网址我就……不知道了,是老板联系的.
RNA-seq程序的话,你看下tophat和cufflink吧,一般都用这个的!要是不知道,可以搜索我名字的网站上看!
之后的分析就要根据研究目的,分析转录组之间的差异与相关性了.这后面的分析应该是因人而异了.可以看看相关文献中是如何分析的.
因为在我们不知道电流真实方向的时候,需要通过一个参考方向来分析问题.就是说我们假设一个电流的方向,根据这个假设来计算,比如应用kcl来计算,最后得到的结果是正的呢,就说明电流的真实方向和我们假设的一样,否则则相反.你是要问这个吗.
你要根据什么进行分析?
与参考基因比,可以确定你的序列是否是基因序列及内含子的分布情况（如果你的基因序列是cds序列的话）与基因组比,可以知道序列的拷贝情况说白了就是基因组序列与基因序列的区别 再问： 那意思是，比对到基因组 就是，和一个完整的基因组序列比对，是验证样本是否和基因组重合度高，检验样本的准确性 而和基因比对是，和基因片段的map
电路分析我们一般考虑模型图,以结点分析法中的接地为例,谈一下为什么要画接地线,其实很简单,一句话就能说清楚,结点分析法需要测结点电压,而在现实生活中,用电压表测量电子电路各元件端钮间电压时,常将底板或机壳作为测量基准,把电压表的公共端或“-”端接到底板或机壳上,而电压表的另一端依次测量各元件端钮上的电压.测出各端钮相对
看你的问题,估计是用illumina的高通量测序,进行RNA-seq的研究吧.这个问题其实比较简单：现在的高通量测序,一般分为单端测序（single-end read）和双端测序（paired-end reads）.单端测序只测模板DNA的一端,一般有36SE、50SE两种.而双端测序需要讲模板的两端（3‘ 和 5’）
In shotgun DNA sequencing projects,a contig (from contiguous) is a set of overlapping DNA segments derived from a single genetic source.a single gene or marker
问题一:书上教的分析方法,是先假设每个网目的电流都是顺时针,我能不能一个网目假设顺时针,另两个网目又假设逆时针?这样能算出答案吗?------------------------------------------------------答：可以,只是注意如果最后算出的电流是负的,就说明你设的电流方向反了.------
是有参考基因组的还是de novo的结果,如果有参考基因组的,那么可以通过这个基因名称在注释结果中查找是否有这个基因,序列信息需要在参考基因组中查找,如果是没有参考基因组的,那么拼接结果是一个fasta格式的文件,可以用blast软件进行比对.
转录组测序和数字表达谱测序相比,主要有如下不同：\x0d第一,测序目标不同.\x0d转录组测序可以测定特定组织中全部mRNA,而表达谱测序只是测定mRNA的酶切标签序列（21 bp）；\x0d第二,代表性不同.\x0d数字表达谱测序只测定21bp序列,而转录组测序测定转录本全长,因而可以更准确地代表样品转录表达情况；\
产生套峰原因：假若为菌或者质粒为双位（引物结合位点不单一）建议换引物测序实验,另外一个是由于存在污染重新挑单克隆进行测序实验即可.若为PCR一个是由于存在非特异扩增.一个是引物特异性不好.另外一个原因是引物为兼并引物.'假若套峰小峰为前或后的主峰说明是由于移码造成既引物合成存在问题.可以把测序结果发给合成公司重新合成.
长期决策线,有说法一些主力看的是72,144；但要明白,股价离的远,短期就没参考意义了,只是一条线,看你自己怎么分析.按平常的也能分析出一些规律.
固有频率和振型是结构固有的,你要改变的话,可通过增减质量的方法来改变. 再问： 您好，我还想问一下，通过增减质量的方法改变振型的话，有没有什么规律可言，有没有哪方面的书籍可以参考，谢谢！
可能是,你选择的控制变量个数只有一个,用单因素方差分析,不需要用多因素方差分析.但更可能是你的观测变量不是定距型及以上变量,软件不接受.选择与变量有关系的因素,通常参考别人的研究经验和自己的经历.转录组测序相关问题（二）
Solexa进行转录组测序，测序文库的制备方法及质控标准？
答：首先会样本进行质量检测，检测合格后，对样本进行测序前处理，构建测序文库，构建步骤为：（1）首先利用oligo
dT微珠纯化mRNA；（2）将纯化得到的mRNA进行片段化处理；（3）利用逆转录酶反转录合成cDNA第一链；（4）以cDNA第一链为模板合成双链cDNA；（5）对双链cDNA进行末端修复并在3’末端加’A”；（6）在DNA片段的两端连接上特定的测序接头；（7）割胶纯化连接好的cDNA片段（一般回收200-500bp之间的片段）；（8）利用高保真聚合酶扩增测序文库；（9）检测测序文库。对于测序文库，需要进行质量控制，一般通过
Aligent Technologies 2100分析仪和电泳观察两种方法检测测序文库的大小，纯度及浓度。
转录组测序结果的影响因素？
答：RNA的降解严重影响测序的质量，RNA降解后，加入poly-A后无法捕获纯化mRNA，因此，随机引物反转录无法得到全部的cDNA，导致测序结果出现明显的3‘-和5’-偏向。文库中的poly-A多聚物的存在会对测序信号产生干扰，影响测序结果的准确性；同时由于转录组中转录本的丰度不一致，实验前需要对样本进行均一化处理，否则高丰度的表达基因会掩盖低丰度表达基因，导致寻找新基因失败或者是获得大量无意义的重复序列。
转录组测序需要多大的测序量才能得到有意义的结果？
答：转录组测序前，需要对物种转录组的大小进行评估，评估方法如下：
（1）对于有reference
genome的物种，可以分析基因组信息，统计编码基因的个数，及其碱基数，从而估计物种转录组的大小，另外可以查询相关或相近物种转录组研究的文献，作为参考。
（2）对于无reference genome的物种则只能参考相近物种的转录组大小。
由于转录组需要进行表达量的分析，因此在转录组测序中不推荐覆盖度，在进行不同基因和不同实验间的基因表达差异分析时，人们提出了RPM和RPKM的概念。
RPM（Reads Per Million
reads）即每百万reads中来自于某基因的reads数，考虑了测序深度对读段计数的影响。RPKM（Reads Per Kilo
bases per Million
reads）是每百万reads中来自于某基因每千碱基长度的reads数。因此，在确定转录组的测序量时，最好以产生的读长数目做依据，参照转录组大小，估计需要的读长数目，来确定转录组需要的测序量。
如何处理转录组测序中存在的系统噪音和偏差？
答：虽然深度测序技术的准确性较以前的技术有了很大提高，但仍然存在错误和噪声。比如内含子区内有一些不连续的reads，很可能由系统噪声造成，如样品污染、测序错误和不恰当的read定位策略等。另外，外显子区域内的read信号分布有时也很不均匀。有文献报道，序列组成尤其是GC含量、RNA二级结构等也有可能是导致read不均匀分布的原因。这些噪声和分布偏好将影响新基因的识别和对剪接异构体形式和表达水平推断。
合理地建模RNA-seq数据中的系统噪声和偏好是解决上述问题最有效的办法。基本的思路可以是：首先根据实验原理寻找可能产生系统噪音或偏差的因素，并尽可能将这些因素转化成可量化的特征，如序列特征、二级结构等；然后，将用实验数据对这些特征做统计分析，构造和训练模型，用模型来对数据进行校正。需要注意的是，某些偏好是由当前的测序技术和分析方法共同造成的，难以完全消除。在这种情况下，后续处理和解释时需要充分意识到这种偏好可能对生物学结论带来的影响，必要时通过补充其他实验来验证和修正通过高通量测序得到的生物结论。
来源：Public Library of Bioinformatics
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