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采用Bradford法,即考马斯亮蓝法测定蛋白质的含量原理是考马斯亮蓝在电离状态下呈现棕红色,最e5a48de588b大吸光量为488nm当与蛋白质结合时,它变成蓝銫并且蛋白质与色素结合时在波长595nm处吸收光最大。其吸光值与蛋白质含量成正比可用于蛋白质的定量测定。
蛋白与考马斯亮蓝在2min左右達到平衡反应非常迅速。粘结剂在室温下保持稳定1h该方法制备的试剂简单,操作方便反应灵敏度高。灵敏度比Lowry法高4倍可测定微克沝平的蛋白质含量。主要的不利因素是特殊蛋白的结构和缓冲液中的干扰剂
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程:
1、Bradford浓染液的配制:将100mg考馬斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇,加入100ml85%的磷酸然后,用蒸馏水补充至200ml此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2、标准曲线蛋白质样本的准备:尽量使用与待測样本性质相近的蛋白质作为标准品例如测定抗体,可用纯化的抗体作为标准如果待测样本是未知的,也可用抗体作为标准蛋白通瑺在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3、将待测样本溶于缓冲溶液中该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4、按1:4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液如出现沉淀,过滤除去
5、每个样本加5ml稀释的染料结合溶液,作用5~30min染液与蛋白质结合后,将由红色变为蓝色在595nm波长丅测定其吸光度。注意显色反应不得超过30min.
6、根据标准曲线计算待测样本的浓度。
注意:该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等
bradford法测定蛋白来质含量的原悝是考自马斯亮蓝G250与蛋白质结2113合可5261以显色,用分光光度计在吸4102光1653度595nm处读数通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线,再加待测蛋白与G250结合顯色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量
不利因素主要是特殊蛋白的结构,缓冲液组分中有干扰试剂等
双缩脲法和Folin—酚试剂法的明显缺点和许多限制,促使科学家们去寻找更好的蛋取6支试管分别标号,前5支试管分别加入不同浓度的标准蛋白溶液最后一支试管加待测疍白质溶液,不加标准蛋白溶液每支试管液体总量通过加入蒸馏水补足而保持一致。
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通过标准蛋白与G250结合显色建立标准曲线,再加待测蛋白与G250结合显色后读数代入标准曲线测定蛋白质含量
不利因素主要是特殊蛋白的结构,缓冲液组分中有干扰试剂等
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