1构建慢病毒侵染细胞过程荧光素酶记者

哺乳动物的昼夜記者的结构通常包含一个表达盒，其中一昼夜的荧光素酶基因启动子的融合双方结扎和重组基于策略通常用于DNA克隆。作为一个例子在這里，我们描述了一个重组的Gateway克隆方法产生一个P（Per2基因 ）-D 吕克慢记者在不稳定的荧光素酶 （D 吕克 ）的小鼠Per2基因启动子的控制下。

1. 克隆的D 呂克 的d 吕克含有萤火虫荧光素酶基因的C-末端的病虫害如先前描述的²¹序列的快速蛋白质降解。使用PCR扩增的d 吕克的DNA片段并克隆到pENTR / D-TOPO载体（Invitrogen）嘚生成pENTR / Dd的吕克 。
2. 报告载体的构建混合使用这两种pENTR的质粒，pENTR5'-P（Per2基因 ）和pENTR / Dd的吕克与慢病毒侵染细胞过程的目标向量pLV7-BSD的（BSD的 ，杀稻瘟菌素抗性基因）并执行使用Clonase生成pLV7-BSD的 -P的重组反应（Per2基因 ）的-d 吕克记者（ 图1）。 pLV7-BSD是一个修改后的版本（在我们的实验室）pLenti6/R4R2/V5-DEST（Invitrogen公司）的土拨鼠肝炎病蝳转录后调节元件（WPRE）序列^22个直接插入下游的表达CA ssette以增强基因的表达

1。种子293T细胞（1天）

1. 90-100％汇合在定期的DMEM补充有10％FBS和1x青霉素 - 链霉素-谷氨酰胺（PSG）的10厘米培养皿上培养人类胚胎肾（HEK）293T细胞 （快速生长的细胞与低通道数的高效转染的关键。）
2. 之前通过添加0.001％聚-L-赖氨酸在PBS中的1毫升到各孔中，并在室温下孵育20分钟转染，涂层6孔培养板中接种细胞吸取溶液，并在使用前用1×PBS冲洗一次
3. 游离293T细胞，用胰蛋白酶和種子0.75×10 ^6个细胞的各孔上的预涂层钢板用2ml的DMEM定期旋流板彻底的各孔中的细胞，以获得均匀的分布在孵化器中于37℃培养过夜的细胞成长。

TEP“> 2瞬时转染，通过投诉警察课

1. 观察从第1天的种子细胞细胞应达到80％至90％的汇合点。
2. 准备质粒转染混合物在1.5 ml离心管中加入2微克记者质粒DNA的慢病毒侵染细胞过程（ 例如，pLV7-P（Per2基因 ）-D 吕克·刘实验室）和3个包装载体（1.3微克的加格/波尔0.5微克牧师和0.7微克VSVG Invitrogen公司）。另外作为对照轉染和随后的感染，我们通常包括一个额外的井慢病毒侵染细胞过程GFP表达载体的转染pLV156-CMV-EGFP（ 图1A），窝藏增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的CMV启动子的控制下如前所述²⁰
_4，PH值为6.95）轻轻地混合，但彻底的DNA混合，在室温下孵育15分钟
3. 在等待过程中，从293T细胞吸出培养基并更改为2毫升新鲜培养基。板返回到至少10分钟平衡介质的pH值在转染前的孵化器。
4. 染293T细胞一滴一滴从第3步组合轻轻旋转板，并在显微镜下观察颗粒的形成孵育，5％CO _237℃培养过夜。 （投诉警察课₄ / DNA沉淀物细粒子形成的高效转染的关键）

3。收获病毒颗粒（天3-4）

1. 关于转染后16小时（3天）细胞应達到100％汇合，从细胞中吸出培养基，更换2毫升新鲜定期DMEM孵育，37℃培养过夜
2. 第4天，通过观察EGFP表达的转录评估转染效率sfection对照组（转染效率90-100％高EGFP表达的是一个病毒准备好一个可靠的预测）
3. 收集培养基中分泌，感染性病毒颗粒离心> 2,000 xg离心5分钟以除去残留的293T细胞，并收集含病蝳上清液可替代地，介质也可以用0.45μm的膜过滤器清零准备用于在感染的病毒颗粒。

1种子3T3细胞（第3天）

第二天分割和种子适当的数字（12000）的3T3细胞在12孔板中获得20％至30％汇合。孵育37℃培养过夜。

2感染3T3细胞（第4天）

1. 观察种子细胞。合流的20-30％（小于50％）所需的感染
2. 加入聚凝胺（polybrene）至终浓度为5微克/毫升到所收集的培养基中病毒颗粒。移液拌匀
3. 吸液介质从3T3细胞，上述病毒的混合物每孔加入1毫升。孵育37℃培养过夜。 （聚凝胺的使用以提高感染效率，但不是绝对必需的正如它可能是有毒的一些细胞，建议事先测试）

3。选择受感染的细胞（第5天及以后）

1. 二十四小时感染后，吸出含有从受感染的细胞的病毒和聚凝胺（polybrene）的培养基中用1×PBS洗一次，并改变到新鲜培养基孵育在37°C过夜复苏和增长。
2. 当汇合（一般1-2天）分裂的细胞，在37°C过夜孵育
3. 翌日，吸出培养基细胞（<50％汇合需要的话）和含10μg/ ml的杀稻瘟菌素选择稳定地用新鲜培养基更换转导的细胞。 （杀稻瘟菌素杀曲线需要凭经验确定为特定的细胞系）

4。记者细胞的生物发光的记录

傳播稻瘟素抗性记者细胞分裂到35毫米的培养皿在37°C孵育，直至汇合我们通常准备≥3个菜，每一个记者的细胞在各种条件下昼夜表型

2。同步和变更记录介质

1. 吸出培养基从汇合记者细胞用PBS洗一次，更换含10μMforskolin的（或200 nm地塞米松）在37℃下孵育1小时，以同步的细胞 （或者，細胞可以通过温度循环²³或血清休克²⁴同步）
2. 在等待时，作好记录3T3细胞如下：1倍DMEM（HyClone）的含有10％FBS1×笔/链霉素/谷氨酰胺，1μM福斯克林1mM的荧光素，25mM的HEPESpH值7.4的介质。血清和毛喉素浓度可以凭经验确定对于非常暗淡的细胞，无酚红培养基也可使用
3. 毛喉素治疗结束时，吸出培养基並更换新鲜配制的记录介质

3。记者细胞的生物发光记录

1. 介质的变化包括培养皿，用40毫米的无菌盖玻片和密封的地方真空润滑脂，以防止水分蒸发
2. 加载到的LumiCycle光度计，这是保持在36°C孵化器内无H _{2 O}或CO ₂的菜
3. 启动实时生物发光的记录。我们通常记录的节奏每周1次其次是介质嘚变化和第二周的连续记录（见，萨韦利耶夫等人 详细信息^）25。 （96我们的记录会板协同SL2被用作记录装置，请参阅详细讨论1.1）

记者细胞促进高清晰度的定量发光记录，确定表型的影响生物钟功能的关键为了获得昼夜参数包括相位，周期长节奏振幅，和阻尼率我们使用的LumiCycle分析的程序（Actimetrics）分析生物发光数据^5,14。简言之原始数据是基线拟合的第一，和基线减去的数据被装配到一个正弦波从该参数被确萣。表明持久性的节奏善良的拟合>通常达到90％的样品。由于高瞬态生物发光换液时我们通常不包括数据分析的第一个周期。

有关数据顯示我们通常绘制原始数据（生物发光，计数/秒）对TI我（天）在必要时，可以绘制基线减去数据用来比较的振幅和相位

1。特定相位嘚昼夜记者

生物钟是根据上的生化负反馈机制¹核心的反馈环路的转录激活因子BMAL1，CLOCK和阻遏市盈率及晶体，产生有节奏的基因表达（早晨階段 例如 ， 牧师雇员再培训局α）作用于昼夜E / E'箱的增强子元件的核心循环调节和集成所述至少两个其它的昼夜顺式元素，DBP/E4BP4结合元件（D-盒;天的阶段 例如，Per3的 ）和ROR / REV-ERB结合元件（RRE;晚相例如^{BMAL1）17。}规管的多个昼夜元素的组合可以产生新的中间阶段例如，转录因子CRY1tion是介导的所有彡个昼夜的元素（ 即 E / E'框和D-BOX元素中的第一个内含子的CRY1基因的启动子和RRES）从而引发不同的CRY1晚上的时间第¹³期。

这些基因表达调控的机制的基础仩我们产生了四种不同的报告结构：P（ 肺癌 ）-D 吕克·P（CRY1）-D吕克记者的E / E'框和D-box元件在监管区^{17， 26,27}P（CRY1） - 内含子 -D 吕克所有三个元素的组合调控（

2通过RNA干扰基因敲除和药理学激活已经化合物

当转染效率是高的，合成的siRNA可以瞬时转染到细胞中基因表达击倒当转染在技术上是困难的，鈳以是一个shRNA表达载体稳定转导通过慢病毒侵染细胞过程感染的细胞这样的shRNA处理由细胞产生的基因敲除（KD）的siRNA。在这里我们介绍KD CRY1和CRY2基因嘚siRNA在U2OS细胞（ 图3A）和shRNA使用pLL3.7网关表达载体（ 图3B）在3T3细胞的影响。除了??3T3细胞，U2OS模式已成为另一个卓越的细胞时钟模型主要是因为它符合市售的人siRNA库（ 例如 ，人类的起源能够产生强大的昼夜节律，验证功能的高通量筛选的关键要求所有已知的时钟基因可以高效转染和定量的发光录制）。在这两种类型的细胞中RNA干扰介导KD导致的时钟表型符合先前的小鼠基因敲除（KO）和细胞KD研究^{5,10,11,28。}例如的CRY1 KD缩短周期长度和降低节奏持久性，而CRY2 KD延长期此外，选定的小分子可以使用药理学目标和干扰的蛋白质的功能（ 图3C）

图1。慢病毒侵染细胞过程载体介导嘚基因传递系统 （A）示意图2慢P（ 肺癌 ）-D 吕克记者载体和CMV-EGFP。只有整合到宿主细胞的基因组的区域被示出在这两个记者的结构，直接控制丅的Per2基因启动子转录的D 吕克 在pLV7-BSD-P（Per2基因 ）-D 吕克载体（重新的组合为基础的克隆），共表达的杀稻瘟菌素抗性基因（bsd）促进感染的细胞的选擇 -D： 吕克向量（基于结扎的克隆）在pLV156-P（Per2基因 ），绿色荧光蛋白翻译是由一个内部核糖体进入位点（IRES）的d 吕克下游介导的允许的视觉观察和感染细胞的FACS分类。此外使用SV40启动子/终止子（P / T）作为绝缘体（见讨论1.3）。在CMV-EGFP的对照载体一个强大的CMV启动子控制下的EGFP表达（B）感染与轉染表达GFP的细胞的荧光图像。通常情况下我们实现了高效率，无论是在瞬时转染293T细胞在慢病毒侵染细胞过程感染的细胞株，我们的利益在这些细胞中的GFP表达。

图2。第一阶段特异性表达的3T3细胞中的生物发光记者记者的慢病毒侵染细胞过程载体在这个实验中pLV7-BSD-P（Per2基因 ），P-D 吕克（CRY1）-DP（CRY1） - 吕克内含子 -D 吕克 ，和P（BMAL1）-D吕克 每个记者表现出明显的振荡相位，如箭头所指示的虽然肺癌和 cry1发起人驱动器峰值生物發光早上天相和BMAL1子在夜间阶段，组合调整的P（CRY1） - 内含子窝藏的E-boxD-BOX，和RRE元素的赋予晚上阶段的峰值生物发光

图3。记者的昼夜生物发光的节奏在细胞遗传学和药理学的扰动 （A）CRY1和CRY2击倒siRNA对细胞节律的U2OS记者细胞的影响。 LumiCycle光度计用于在35 mm培养皿中的细胞生物发光的记录图适用 blot分析（数据未示出）所确定的效率比shRNA1击倒。和合光度计用于生物发光记录细胞在96孔板中记录的设置如下：孵化温度33°C;积分时间，15秒间隔时間30分钟。（C）的小分子抑制剂的影响CEL的U2OS记者细胞的lular的节奏 Chir99021和roscovitine处理，分别针对GSK-3和CDK抑制剂用于生物发光的细胞录音ViewLux的系统（Chir99021测定）和Tecan公司咣度计（roscovitine处理测定）在384孔板中。图改编自“参考编号＃19（版权2008年美国国家科学院美国），

1.1记录装置和吞吐量的考虑

由于其商用中，LumiCycle（Actimetrics）已成为最常用的自动光度计设备实时记录^{4,5,9,19,29-31的} LumiCycle采用光电倍增管（PMT）作为光探测器，它提供了极高的灵敏度和低噪声¹⁴因此特别适合于数據采集极其暗淡的基于荧光素酶发光。其他相似的PMT的设备（ 例如

或什至1152孔板格式的高通量筛选（HTS）的实验高通量药物开发主要集中在以丅两个方面：1）更好记者细胞与亮的荧光素酶和/或更高的报告基因表达的（见下文），和2）的高度敏感的记录设备可容纳多孔板。我们囷其他人使用几个酶标仪如协同SL2（BioTek的）无限M200（Tecan公司^{）19，TOPCOUNT（}珀金埃尔默^）28和的EnVision（Perkin Elmer公司制^）34。在我们的实验室中同时LumiCycle和Synergy设备被放置在一個温度控制的和不透光的孵化器。或者如果资源许可，记录单元可以被放置在一个温度受控室对于HTS，必须根据经验来确定关键的设置如集成/曝光时间之间的间隔时间点，对于一个给定的记者和录音设备

在单细胞分辨率的的LumiCycle试验并不提供空间信息。 Yamaguchi 等人 ³⁵和威尔士语等 ^4,5率先由int实时生物发光成像egrating一个特别设计的显微镜和一个高灵敏度低噪声CCD相机实现单细胞分辨率。近年来更敏感的成像系统已成为市售，包括LV200（奥林巴斯）和CellGraph（AB3000-B阿托）与一个超灵敏的冷却的和背照式电子倍增CCD和多色滤波器^36,37。成像也被用于在更复杂的高温超导实验 例如 ，一个ViewLux CCD成像器（Perkin-Elmer公司）的GNF自动化机器人系统（GNF系统）的结合该系统启用新的基因和小分子的影响时钟功能^10,12,19的大型屏幕。

首次使用的荧光素酶在20世纪90年代初在植物和蓝藻昼夜节律基因表达的实时荧光记录，自2000年以来^{29,35,38-40（}已被广泛使用在哺乳动物系统莱索托评论^14,15）。荧光素酶记者一般毒性更小，更敏感比如GFP的荧光记者，由于低得多的背景⁴¹最常用的是生物发光记者萤火虫（Photinus pyralis）荧光素酶（ 吕克+）构造对pGL3矢量系列（Promega）中，在其中的本机吕克的编码区被修改为优化的转录和翻译用于长期记录的萤火虫荧光素酶和其高度稳定和细胞可渗透基板，D-荧光素是理想的组合。 ? 吕克是修改后的版本吕克+用PEST序列在其C-末端融合，以便快速蛋白质降解进一步的改进版，Luc2是可pGL4向量系列（Promega）的更高和较少的异常表达。然而我们没有观察到显着的性能差异之间吕克·+和Luc2的在瞬时转染 3T3和U2OS细胞（数据未示出）。在最近的一份報告显示巴西的叩头虫荧光素酶（E 吕克 ）表现出一个更加光明的信号不是吕克+，适合于单细胞成像⁴²

最近许多研究已利用的mPER2 :: LUC融合基因敲除记者鼠标^{4,5,9,19,25,29-31,43}中。这是记者系统允许昼夜表型的细胞和组织的外植体包括SCN。在我们以前的研究中我们穿过了记者许多行为特点的时钟基洇敲除小鼠，SCN肝，肺组织体外培养中的动态生物发光的节奏并在分离的SCN神经细胞和成纤维细胞体外培养^{， 5,9,31}这些研究使我们获得了重偠的见解的分子细节在细胞和有机体水平的时钟。

e_content“>基于矢量的时钟记者提供了很大的通用性因为他们可以引入不同类型的细胞，通过瞬时转染

虽然繁琐重复的，瞬时转染细胞的连续存在的抗生素产生稳定的细胞系中也可以生长慢病毒侵染细胞过程载体都仍然优选的洇为他们的稳定整合到细胞的基因组，以及更大的效率和通用性除了的pLV7载体上面介绍中，感染的细胞可以是外抗生素的选择我们已经使用其他载体例如

表达盒，其中EGFP的词条是介导的内部核糖体进入位点（IRES）的d

允许目视观察和荧光激活细胞分选（FACS）细胞与INTEGRAT编载体

见下文）。为了屏蔽记者从整合位点的影响组成型启动子和终止子（P / T）可被引入作为绝缘体或诱饵的紧邻上游侧的

中的底部构造），Brown

以前的研究建立了基础为探索组织特异性遗传扰动在体内和/或体外 ^44-48。例如病毒颗粒可以注入其次按照SCN片制备区域到SCN。随后通过体外测定在体内莋为一种替代SCN切片可以被解剖的第一和培养体外孵育，随后用高滴度病毒然而，由于低的感染效率的相对厚的组织切片高度一致的體外协议还有待开发。

1.4细胞株和拍摄条件的选择

根据我们所知道的生物化学和细胞生物学的时钟机制的细 ??胞模型：3T3小鼠成纤维细胞^16,17U2OS骨肉瘤细胞^{10,11,19,28，}和小鼠成纤维细胞来自小鼠^{9,13 34。}的慢病毒侵染细胞过程载体系统允许高效的送货和稳定整合到宿主基因组的除法和非分割的哺乳动物细胞并因此，并不限定在瞬时转染中的某些类型的细胞鉴于在广泛的细胞和生理反应的调节生物钟的角色，今后的研究肯定會扩展到各种各样的细胞类型无论是市售的细胞系或来自小鼠的原代细胞。这些细胞自主时钟的研究将有助于发现组织ubiquitous以及组织特异性，属性的生物钟

它是值得注意，生成记者细胞可能需要不同记者的经验性测试（ 例如 不同的载体和启动子的类型），和有时进一步優化并非所有类型的细胞都具有细胞自主的节奏。为了改善细胞的健康和持久性的细胞的节奏优化的记录介质通常是必要的。例如莋为一种替代的3T3的记录介质，记录介质用于U2OS细胞是如下：1倍DMEM（Invitrogen公司）2％B-27，1μM福斯克林1mM的荧光素14.5 mM的碳酸氢钠，10mM的HEPES （pH值7.2） 1mM的荧光素通常昰足够的，但可以被确定为每个小区/记者类型的最终浓度（0.1-1毫米）福斯克林可能没有必要，每种细胞类型的它的浓度可以凭经验确定。

1.5转染效率慢病毒侵染细胞过程准备

高数293T细胞ansfection效率的一个良好的病毒的准备是至关重要的主要考虑的因素包括健康的293T细胞和转染试剂的選择。 293T细胞可以很娇气需要小心处理。因此细胞生长速度和形态必须仔细监测。为了保持一致性我们建议血清进行测试和测试的一批其后维持细胞。我们测试新的2倍BBS和CaCl ₂股票的解决方案和优化工作浓度的_氯化钙约0.25 M.细胞中的高通道数和/或显示缓慢的增长速度不应该使用嫆易地用数量的转染试剂转染的293T细胞。除了 ??向投诉警察课₄我们也取得了优异的使用FuGENE 6（罗氏公司或Promega）或“脂质体-2000（Invitrogen公司）的转染效率。这些脂质体转染试剂（脂质体）都比较昂贵但提供更好的转染投诉警察课的一致性比_4。佛山?大型的慢病毒侵染细胞过程税号，我们建议您使用CaPO4转因为较低的成本。

未浓缩的原油是相对低的滴度（10 ^6个病毒颗粒/ ml）的病毒颗粒和报告基因表达的转导的细胞中的低。虽然對于大多数应用如LumiCycle记录，这是足够的明亮的记者常常需要， 例如 在使用较不敏感的记录装置的高通量的检测。报告基因表达可以增加通过使用高滴度的病毒税号要做到这一点，我们建议使用大文化转船等的AS15厘米的菜肴媒体，并收集两次在第4天第5天。对于10倍的浓喥（10 ^7个病毒颗粒/ ml）中执行使用离心过滤装置（Millipore公司）过滤。对于100倍或更多的浓度（≥10 ⁸病毒粒子/ ml）执行超离心如前所述^5,18。如果需要的话均匀的细胞群体克隆细胞系，可以通过以下方式获得基于FACS-单电池在96 - 孔板中进行排序。然而这是必要的，这些克隆细胞进行仔细检查从亲代细胞的细胞形态应该是没有什么区别的，和时钟性能如周期长度和幅度应该是代表感染的细胞群。

2的细胞自治记者时钟模型Φ的应用

不同组织或动物模型，细胞模型是适合的遗传和药物扰动的必要时，也可以使用在高温超导格式可以通过过度表达或利用RNA干擾技术敲除基因功能的摄动。可以使用选择性的小分子干扰蛋白质功能在这里，我们简要地?iscuss的一些使用细胞自治的时钟模型在昼夜节律的研究

2.1内核时钟机制的研究

极大地促进细胞自主的时钟模型的机理研究。 Hogenesch和他的同事们使用的的3T3模型显示反馈镇压晶体所需的时钟功能^16，和U2OS模型的探测系统时钟功能¹¹级属性。我们采用的CRY1-/ - ：CRY2-/ -成纤维细胞来自小鼠模型表明延迟反馈抑制是必要的时钟功能^13，和BMAL1-/ -成纤维细胞模型表明REV-erbα和β多余的角色调节RRE-介导的节奏的基因的表达，该BMAL1节奏不会受到严重所需的核心时钟功能⁹此外，化学品筛选在记者的细胞中允许的身份证明文件和/或澄清GS的功能K-3β（周期缩短扰动^{）19，CK1σ}和ε（期延长扰动^）49和^CK1α12。正如下面所讨论的这些模型便于确定額外的时钟分量。从战略上讲这些细胞模型更易于处理的基本机制，然后在体内的验证和探索提供了新的入口点的快速发现

除了核心嘚反馈回路，时钟机制还集成了不同的信号和监管因素识别额外的的时钟组件和修饰，细胞自治的时钟模型有利于对基因筛选的小鼠由於固有的杀伤力多效性，发育遗传补偿与突变动物模型⁵⁰细胞为基础的屏幕，在结合功能基因组学欧普罗酸痛有效地进行标识的小说嘚时钟因素^，10,28利用高通量的记录系统屏幕全基因组siRNA和shRNA库。同样人们可以采用生化方法和屏幕不同的小分子，研究它们对时钟功能^12,19,34,49虽嘫主要的时钟基因和它们的功能已经确定，这些发现屏幕上有额外的组件或改性剂中所涉及的规例或调制的时钟这些修饰符表示特别的方式整合同步或异步的线索（时钟输入）的信号转导。

虽然几乎所有的细胞在体内的生物钟 在体外培养的细胞并不一定显示明显的昼夜節律。在这种情况下记者的做法提供了一个有用的工具，以测试是否时钟机制中存在特定的细胞类型存在下，细胞自治时钟机制保证茬这些细胞中的时钟输出以及在体内组织中，包括微阵列或RNA测序^51,52转录调控网络，蛋白质组和代谢组的转录研究。这些研究探讨全基洇组RNA和蛋白质的表达模式从而，补充细胞为基础的发光记者分析并不一定反映的内源性表达。

3意义的细胞自主的时钟模型

的昼夜函數内的SCN和在不同细胞和组织类型的协调是正常生理³⁰的一个重要方面。中央SCN和外设时钟都是必不可少的部分的整体的昼夜组织 SCN接收光输入矗接从视网膜夹带的光/暗周期，作为一名协调员通过神经和激素的连接外设的时钟同步。除了内部同步外周组织和细胞内的分子发条還编排了无数的的转录输出网络，最终治理明显的昼夜节律生理和行为。

因此全身和局部的信号调节昼夜节律的生理，有必要发现生粅钟基因直接调控与间接调节全身发出的信号从SCN细胞自主的时钟外设时钟的作用，可以研究在细胞自治的时钟模型其中去除全身的影響。在肝脏的情况下组织特异性基因调控网络产生在生理^51,53本地的节奏。通过比较 在体外和体内的昼夜节律，我们将可以区分细胞自主性和全身提示驱动的时钟功能事实上，朱金庆科技研究已经开始揭示了显着的作用对肝脏肝脏基因表达的时钟在^6,51,52。今后在该领域的研究认股权证发展的各种组织和细胞类型的特定的时钟模型代表不同的生理产出。

以往的研究在很大程度上依赖于有限数量的细胞和组织類型特别是3T3，U2OS小鼠成纤维细胞和肝脏的生物化学和细胞生物学的时钟机制。在大多数昼夜研究一个隐含的假设是时钟的工作方式相同在所有细胞和组织类型，并确定基因的功能在一个细胞或组织类型中通常被认为是普遍适用于所有细胞⁷然而，更多的细胞自主的时钟模型的建立和特征预计未来的研究发现当地昼夜生物学基础的组织特定的时钟性能。