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【专题讨论】什么是TALEN？TALEN的原理是什么？
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一、TALENTALE (Transcription Activator-Like Effector) 是由植物致病细菌Xanthomonas分泌的一类具有转录激活功能的蛋白，该种蛋白通过其内部保守的重复氨基酸序列（即DNA结合域）与植物宿主基因启动子区的相应核苷酸序列发生特异性结合，并激活基因表达。TALE的DNA结合域由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成，每个模块一般包含33~35个氨基酸（aa），其第12,13位氨基酸种类可变且决定了TALE与DNA结合的特异性。因此称这种重复可变的双氨基酸序列为RVD (Repeat Variable Diresidue)。TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 是一种人工改造的限制性内切酶，是将TALE的DNA结合域与限制性内切酶 (FokⅠ) 的DNA切割域融合而得到。由于TALE的DNA结合域中的重复氨基酸序列模块可以与单碱基发生特异性结合，因此理论上可以任意选择靶DNA序列进行改造，是一种非常有效的基因组改造工具酶。二、利用TALEN进行基因组编辑的原理TALEN在细胞中与基因组的靶位点结合，形成二聚体发挥内切酶活性，导致左右TALEN的spacer区域发生双链DNA断裂（DSB，Double-Strand Breaks），从而诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过非同源性末端接合机制（NHEJ, Non-homologous End Joining）修复DNA。NHEJ修复机制并不精确，极易发生错误（缺失/插入），从而造成移码突变，因此可以达到基因敲除的目的。(Fig.1- TALEN原理)
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火车二场 最近又出了一种新技术cas9/RNA,操作起来更简单，效率与TALEN和ZFN相当这个技术还只刚刚冒了个头，最鼓舞人心的是，最近两篇science文章已经证明这个技术在细胞里可行，虽然效率还不高。如果将来成熟的话，Cas9 system 绝对可以取代 siRNA 或者 shRNA。拭目以待吧。
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莫非TALEN还没有普及，就要被取代了？
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TALEN基因编辑技术
前言转录激活样效应因子核酸酶（TRANSCRIPTIONACTIVATORLIKEEFFECTORNUCLEASE,TALEN）技术与锌指核酸酶（ZINCFINGERNUCLEASE,ZFN）技术组成了一大类强有力的基因组编辑工具，这一大类技术的发展重新划定了生物学研究的边界。这些嵌合核酸酶由两部分组成一个可编码的序列特异性DNA结合模块与一个非特异性的DNA切割结构域。通过诱导DNA双链断裂（DNADOUBLESTRANDBREAK）来刺激容易出错的非同源末端连接或在特定基因所在的位置进行的同源定向修复，TALEN和ZFN能够完成一系列遗传学编辑修饰操作。成簇规律间隔短回文重复（CLUSTEREDREGULATORYINTERSPACEDSHORTPALINDROMICREPEAT,CRISPR）技术是最新出现的一种基因组编辑工具，它能够完成RNA导向的DNA识别及编辑。与其它基因组编辑工具相比，CRISPR技术更易于操作，具有更强的可扩展性。本文将以上述三种技术为例，介绍并探讨新一代位点特异性基因组工程技术的生物学原理、未来发展趋势，及其在遗传学研究领域的作用和潜在的医学应用前景。一、TALEN技术TAL效应因子（TALEFFECTOR,TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（XANTHOMONASSP）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的。这些TALE通过细菌III类分泌系统（BACTERIALTYPEIIISECRETIONSYSTEM）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FOKI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。近年来，TALEN已广泛应用于酵母、动植物细胞等细胞水平基因组改造，以及拟南芥、果蝇、斑马鱼及小鼠等各类模式研究系统。2011年自然方法（NATUREMETHODS）将其列为年度技术，而2012年的科学（SCIENCE）则将TALEN技术列入了年度十大科技突破，针对该文的评论更是给予它基因组的巡航导弹技术的美誉。1TALEN结构及技术原理11TALEN的典型结构如前文所述，典型的TALEN由一个包含核定位信号（NUCLEARLOCALIZATIONSIGNAL,NLS）的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FOKI核酸内切酶功能的C端结构域组成。不同类型的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度有很大区别。一般来说，天然的TALEN元件识别的特异性DNA序列长度一般为1718BP；而人工TALEN元件识别的特异性DNA序列长度则一般为1420BP。图1TALEN的结构。（A）与靶点DNA（灰色显示，PDBID3UGM）结合的TALE蛋白。每一个独立的TALE重复序列元件包含33到35个氨基酸残基，这些TALE重复序列元件能够通过两个高变异度的残基（即重复可变双残基，RVD，棍状显示）来识别一个单一的碱基对。（B）TALE核酸酶（TALEN）形成二聚体结合DNA的动画演示。TALEN目标位点由两个TALE结合位点组成，这两个位点间通过不同长度的间隔区序列（1220BP）分开。TALE可以被设计成仅仅识别左半侧位点或右半侧位点。图片来源THOMASGAJ,CHARLESAGERSBACH,ANDCARLOSFBARBASIII2013ZFN,TALEN,ANDCRISPR/CASBASEDMETHODSFORGENOMEENGINEERINGTRENDSINBIOTECHNOLOGY,TALEN技术的原理与步骤TALEN技术的原理并不复杂，即通过DNA识别模块将TALEN元件靶向特异性的DNA位点并结合，然后在FOKI核酸酶的作用下完成特定位点的剪切，并借助于细胞内固有的同源定向修复（HDR）或非同源末端连接途径（NHEJ）修复过程完成特定序列的插入（或倒置）、删失及基因融合（图2）。图2TALEN进行基因组编辑的原理。利用位点特异性核酸酶可以进行基因组编辑，而核酸酶诱导的DNA双链断裂（DSB）可由同源定向修复（HDR）或非同源末端连接途径（NHEJ）来修复。（A）在供体质粒（DONORPLASMID）暴露出延长的同源臂（HOMOLOGYARM）的情况下，HDR可能导致插入的单个或多个转基因发生改变或取代原有的基因。（B）在缺失供体质粒的情况下，NHEJ介导的修复会产生小的插入或删失突变，并可能导致目标基因被破坏；在有双链寡核苷酸或线状供体质粒存在的情况下，这些DNA片段可能通过NHEJ介导的连接反应插入；同时诱导两个DSB的产生则会引起删失、插入和易位突变。图片来源THOMASGAJ,CHARLESAGERSBACH,ANDCARLOSFBARBASIII2013ZFN,TALEN,ANDCRISPR/CASBASEDMETHODSFORGENOMEENGINEERINGTRENDSINBIOTECHNOLOGY,TALEN技术的核心原理就是在同一个蛋白（TALEN）上有序地实现引导进入细胞核、靶位点DNA的特异性识别和靶位点DNA的切割这三个不同的功能，这一点在上述TALEN典型结构一节中已作了较为详细的描述。在具体操作中，例如在实验室条件下，实现TALEN的关键就在于完成DNA的特异性识别功能，一般说来分为两个步骤。图3与图4分别以“铂金门”TALEN构建系统（PLATINUMGATETALENCONSTRUCTIONSYSTEM）和商业化的EASYT体系为例，展示了实验操作中TALEN元件的构建。图3“铂金门”TALEN构建系统TALEN元件构建操作示意图。步骤一，四个或更少的组件被连接到阵列质粒（ARRAYPLASMID）上；步骤二，构建好的阵列随后被连接到哺乳动物表达载体中；白色和粉色的长方形分别表示在BSAI和ESP3I限制性内切酶切割后留下的粘性末端；蓝色字母代表RVD，红色字母代表NONRVD变化，黄色长方形代表后一半重复。图片来源TETSUSHISAKUMA,HIROSHIOCHIAI,TAKEHITOKANEKO,TOMOJIMASHIMO,DAISUKETOKUMASU,ETAL2014REPEATINGPATTERNOFNONRVDVARIATIONSINDNABINDINGMODULESENHANCESTALENACTIVITYSCIENCEREPORT,“EASYT”TALEN构建系统TALEN元件构建操作示意图。（A）包含一个长度为185个组件的TALE重复元件的TALEN体系示意图。该TALE重复元件由20个单体单位（MONOMERUNIT）组装而成。单体单位的边界在组装过程中发生了移位。（B）TALEN克隆示意图。第一步，由四个单体通过连接反应组装成4聚体；第二步，4聚体（4MERS）进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，胶回收并浓缩；最后，在第二次连接反应中，4聚体被组装到TALEN骨架质粒（BACKBONEPLASMID）上；黄色和蓝色箭头分别表示4聚体扩增时的正向引物与反向引物。图片来源TOMONORIKATSUYAMA,ARSLANAKMAMMEDOV,MAKIKOSEIMIYA,SAMUELCHESS,CEMSIEVERSANDRENATOPAR2013ANEFfiCIENTSTRATEGYFORTALENMEDIATEDGENOMEENGINEERINGINDROSOPHILANUCLEICACIDSRESEARCH,21构建TAL靶点识别模块TAL的DNA特异性识别单位是间隔32个恒定氨基酸残基的二联氨基酸。二联氨基酸与AGCT这4个核苷酸碱基有一一对应的关系腺嘌呤（A）由NI识别、胸腺嘧啶（T）由NG识别、鸟嘌呤（G）由NN识别，而胞嘧啶（C）则由HD识别。实验操作中，我们通过靶位点的DNA序列可以反推能特异性识别这一序列的二联氨基酸序列，从而构建TAL靶点识别模块。122TAL靶点识别模块的克隆与表达根据之前对TALEN结构的介绍，我们需要将上一步骤中根据目标DNA序列构建好的一对TAL靶点识别模块与N端的核定位序列、C端的FOKI酶连接起来，才能得到一个完整的TALEN元件。一般来说，我们可以采用专门用于构建TALEN的真核表达载体体系，将一对特异性的TAL靶点识别模块克隆进该载体中，再通过转染等方式导入细胞内。这种体系一般由供体质粒（DONORPLASMID，提供单基、二联及三联等类型的TAL模块）和骨架质粒（BACKBONEPLASMID，用于构建TALEN并表达构建好的TALEN）两类质粒构成，常用的TALEN体系有RCISCRIPTGOLDYTALEN和PCGOLDYTALEN、TAL5BB和PTAL6BB及PCS2TAL3DD和PCS2TALERR等。2TALEN技术的应用及近期发展虽然TALEN技术的基本原理并不难理解，但其发现过程却较为曲折。从1989年首次发现TAL起，研究者前后历时近21年才研究清楚TAL的工作原理。自2010年正式发明TALEN技术以来，全球范围内多个研究小组利用体外培养细胞、酵母、拟南芥、水稻、果蝇及斑马鱼等多个动植物体系验证了TALEN的特异性切割活性。21TALEN技术的应用2011年北京大学（PEKINGUNIVERSITY）的ZHANG等人首次使用TALEN技术在斑马鱼中成功实现了定向突变和基因编辑；而爱荷华州立大学（IOWASTATEUNIVERSITY）的WANG等人则在2012年，也以斑马鱼为模式动物，并首次使用TALEN技术在活体内完成了特定DNA的删除、人工DNA插入等较为复杂的操作。随后TALEN技术在植物、大小鼠的基因组改造等方面的应用也顺利完成。而2013年ZHANG使用TALEN诱导了DNA双链断裂，提高同源定向修复效率，在斑马鱼中实现了同源重组基因打靶。22TALEN的近期发展如前所述，经典的TALEN体系已经广泛应用，越来越多的实验室以及实验外包公司均能很好地完成TALEN相关实验，但是基本限于单基因的插入或敲除操作，而且主要用于单个基因功能的研究。2013年，首尔国立大学化学系和国家基因工程创新举措研究中心的KIM课题组建立了一个全基因组规模（GENOMESCALECOLLECTION）的TALEN体系，他们系统地选取了人类基因组中高度特异性的序列作为靶位点以避开脱靶（OFFTARGET）效应，通过一种高通量克隆体系，一次性构建了18,740个编码蛋白的基因的TALEN质粒。在这项研究中，研究者以一种巧妙的方式优化了TALEN质粒的结构，以检测插入靶位点后质粒对应位置上EGFP的表达的方式检测了T
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魏文胜：基因组编辑平台技术及未来产业运用发展趋势
“基因组编辑未来产业运用发展是如今的热点，利用这个技术，不管做动植物转化改造还是医药领域应用，可以做的事情非常多，但是具体怎么落地？我跟大家一样，有的时候会觉得无从下手，所以今天我会更多从技术层面给大家做一个简单的介绍。”
以下是正文：
各位下午好！谢谢组委会邀请我来参加这次会议。我今天分享的是基因组编辑平台技术及未来产业运用发展趋势。
基因组编辑未来产业运用发展是如今的热点，利用这个技术，不管做动植物转化改造还是医药领域应用，可以做的事情非常多，但是具体怎么落地？我跟大家一样，有的时候会觉得无从下手，所以今天我会更多从技术层面给大家做一个简单的介绍。
通俗来说，基因组编辑就是用一把分子剪刀对基因进行准确的编辑。
最近两三年特别是这一两年，大家说的更多的是CRISPR，而不是基因组编辑，我想跟大家强调一下基因组编辑技术不仅仅只CRISPR，CRISPR只是基因组编辑多种实现技术中的一种。
首先，我们来回顾下整个技术发展过程
在CRISPR出现以前，也有很多可以做基因组编辑的工具，特别是以ZFN为代表的，就是zinc&finger&nuclease，它其实是已经有专门公司产品化的这样一个技术，但是它有非常多的问题，我在中间就不展开讲了。之后就是TALEN或是TALE技术，然后才是最新的CRISPR。
CRISPR其实是相对低等的原核生物中存在的一种获得性免疫机制，细菌也有天敌，我们叫它们噬菌体，这些噬菌体本质上属于病毒。在噬菌体和细菌不断斗争的过程中，细菌进化出一套机制，能够让细菌记住是谁侵犯过它，它把噬菌体基因编码区的片段整合到它特殊的CRISPR序列里面，当下一次这种病毒侵染的时候，细菌能够根据这些片段产生一些小RNA，这些小RNA能准确识别噬菌体的基因组，并且通过细菌内的一个核酸酶，cas9，将噬菌体的基因组切断，所以这是一种天然存在的，能够识别并且切断DNA的机制。&这套系统工作原理的发现，是CRISPR能够运用到基因组编辑上的基础。搞明白CRISPR这个系统是怎么工作以后，我们迅速把它应用到基因编辑上去，这个应用最重要里程碑的是Science在2012年夏天发表的文章，证明这个可以做编辑。2013年出的两篇science文章包括其他一些文章进一步坐实在在人源或真核动物细胞里面可以做这个事情。
早一代的技术叫TranscriptionActivator-Like&Effector，TALE。TALE也是我们从细菌学到的一个小小的花招，在89年的时候大家就已经发现有一些类细菌有第三类的分泌系统，它可以把自己的蛋白跨界送到自己的宿主，比如说植物的宿主或者动物宿主里面去。这些蛋白有非常重要的特点就是这些蛋白中间有非常多的蛋白重复区域，这些重复区域可以结合到操纵子上然后影响一批基因的表达。为什么会有重复？
09年的时候这个问题被搞清楚了，这些重复差不多是34个氨基酸的重复，这些氨基酸中12、13位的地方是高度可变区，其它部分都是一样的。这么多重复是利用可变区的2个氨基酸，我们给它名字叫RVD。RVD决定是否可以识别或识别什么样的DNA碱基，大家知道4个碱基ATCG来决定它的序列变化，也就是如HD识别C。两篇science第一次把它解码出来后大家非常兴奋，因为大家可以按照意愿来直接识别一段DNA序列。这是基因编辑技术开始起飞的时候。这就是从TALE变成TALEN的由来。
TALE和CRISPR各有特点，CRISPR用RNA来识别DNA，TALE或TALEN是用protein蛋白来识别DNA，这就涉及到了分子克隆的问题，使得定制和使用TALE的门槛比较高。单纯从针对一个基因的编辑效率、脱靶率这些实用性来说，其实很难比较出CRISPR和TALE谁更优秀，甚至更多的研究认为TALE有更高的效率和更低的脱靶率。
那么TALE确实有些不能干的事情，比如它做不了高通量的筛选，说到这个早上阎海教授举了例子。功能性的基因筛选广泛的被应用于生物医药领域中，其实大部分实验室整天都在干这件事情，功能性的基因筛选广泛应用在生物医药领域里，是一项非常重要的基础性工作，它能帮我们基因与功能之间的关系应用。如果用它来研究疾病，就能帮我们找出基因与疾病之间的关系。之前有一个平台叫RNAi，我们大概五六年前结合生物测序建立一个体系。我们用RNAi这种方法找到了抗生素引发腹泻的一个关键因素。临床上经常发现，服用抗生素的病人很容易引发腹泻，这种腹泻大部分是由一种叫艰难梭菌的细菌造成的，在美国CDC发布的报告了，每年因为艰难梭菌感染造成的医疗花费，超过10亿美金，我们一直在研究这其中的机制，并且用RNAi技术找到了。在这个过程中，我们意识到RNAi有非常多的问题，假阳性非常高，所以我们一直在寻找一个更好的方法，结合CRISPR这个工具，我们做成了更好的筛选平台。&它的假阳性非常非常低。从它的理论来讲，也是合理的，因为通过CRISPR，我们修改了基因组，直接让基因的功能消失了，而RNAi只是在部分减弱了基因的功能。
当我们建立这样一个方法学之后，就用两种毒素蛋白来验证，因为我们知道这两种毒素入侵细胞的关键因子是什么，也就是我们知道阳性对照。也就是我们可以用基因组编辑的方法高通量的迅速的建立因果关系。更加重要的是我们在前边筛选的基因，我们逐一做了验证，发现他们确实未被发现的，在毒素入侵细胞过程中发挥关键作用的新因子。
这个方法有非常多的应用，当年所有用RNAi平台所做的工作，都可以回到CRISPR来，用同样的方法做高通量筛选，我举一个非常典型简单的例子，我们做的HCV丙型肝炎病毒，利用这个方法，我们迅速就发现了三个已知的关键因子。，它给我们非常明确的因果关系。这件事情新药研发有很重要的意义，因为药物靶点的确定是整个下游的研发的基石，有非常大的需求，我们对编码基因可以用CRISPR方法进行迅速的筛选。
大家越来越关注非编码的区域有什么作用
在这个平台的基础上，我们进一步发展了双gRNA筛选系统，这个系统通过直接在基因组上删掉大片段的方式，不仅能找出编码基因与疾病之间的关系，也可以用来研究现在很热门的miRNA，lncRNA，我们已经用这种方法找到一些lncRNA，并且能够证明这些lncRNA跟前列腺癌细胞转移有紧密的因果关系的，它们可能都是对抗癌细胞转移的新的靶位点。
那么哪些是实现以上畅想的最关键的因素呢?&我看来，安全性，系统导入或者说给药方法，以及效率，是急需解决的问题。安全性不需要多说，肯定是最重要的，目前整个领域都在研究如何控制基因组编辑工具的脱靶效应，在这方面，TALE有可能更有优势。系统导入方法方面，目前倾向于使用病毒工具的依然居多，考虑到病毒载体本身的限制，由于TALE的个头更大，CRISPR确实有一些优势。但是如果把基因组编辑与细胞治疗相结合，在体外进行编辑，这个问题就会简单很多。我们把基因组编辑的这些工具，比如CRISPR或者TALE导入到细胞以后，并不是所有细胞都会乖乖的被修改的。这就有一个效率的问题。从这个角度说，，如果用于科研目的，目前很多人还是满意的，但如果未来真的用于医疗，那肯定还不够好。你可以向做过这项工作的人求证，想完成一项基因组编辑工作并不是非常容易的，对此我们做了非常特殊的报告系统，对于基因组编辑的效率有巨大的提升，可以提升到90%。甚至可以同时高效率的编辑5个基因。
我用这个简单的例子来告诉大家，其实基因编辑有非常多需要提高提升的空间，效率提升在医药领域里面显得至关重要。
回到CRISPR和TALEN两大技术，用谁呢
回到TALEN或TALE，它通过RVD识别，蛋白识别DNA其实是比较严谨的。大家不用或者避免用TALE或者TALEN，它最大瓶颈是蛋白组装非常困难，构建一个基因组编辑所需的TALEN，大概需要几个星期的时间。由于我们很早就进入到这个领域内，我们拥有一套独特的方法，可以快速大量的获得TALE，所以这个门槛对我们来说是不存在的。
还有另外一个事情，前面说的RVD，自然界中天然存在的大概有25种左右，但我们依靠我们独特的TALE快速组装方法，尝试了两种氨基酸所有的400中组合，并找到了天然并不存在的，能够特异性识别有表观遗传修饰碱基的RVD。如甲基化修饰，甲基化修饰对蛋白识别碱基的影响是巨大的。我们同样的方法把修饰的筛了一遍，发现非常有趣非常好用的新的RVD。未来对于一些医疗有一些特殊的应用。
前面我讲了很多科研的东西，回过头了，如果把基因组编辑拿过来用于治疗领域，哪些领域是最容易捏的软柿子呢？
举例来说明一个基因组编辑应用的巨大潜力
单基因遗传病，比如地中海贫血症。这是最容易想到的疾病，因为这些疾病发病的原因就是单个基因出错了，我们用基因组编辑的方法，把错误的地方改过来，不就可以了吗?&这是目前大家广泛发力的一个领域。感染性疾病，用基因组编辑的方法治疗感染性疾病，这个里面的关系好像不是很直接，我举个例子，HIV是威胁巨大的感染性疾病，早在TALE之前，就有公司使用历史更为悠久的基因组编辑工具ZFN，使用ZFN可以把T细胞上一个HIV侵染的关键因子CCR5基因去除，没有了CCR5的T细胞就不会再被HIV攻击了。通过这种方式，可以制造出一些对HIV免疫的特殊T细胞，并通过这些T细胞来维持病人一定的免疫能力。目前这个疗法，已经做到了II期临床。基因组编辑技术不但单独可能作为一种疗法，也可以与很多其他的治疗方法相结合。比如现在很热门的免疫治疗。单单是与T细胞相关的方面，我们就可以畅想，利用基因组编辑的方法，去除掉T细胞上与排斥反应相关的基因，就可以实现T细胞的异体移植，这个想法已经由一个法国公司实现了。我们还可以考虑用基因组编辑的方法，将CAR高效且定点插入T细胞的基因组中，这样就使得CAR的导入更加可控，摆脱由于慢病毒导致的问题，我们甚至可以考虑直接将T细胞表面的PD-1去除，用来直接对抗癌症。
当然我们还会面临伦理挑战，使用基因组编辑技术，我们真的可以部分扮演上帝了。那么我们的底线是什么？或许所有条条框框都是等着人类突破的，但是我们的确有这个责任要提前想这个事情。
最后我想和大家分享一下产业的信息
我上网搜了一下国际知名的专注于基因编辑的公司，这里面大部分公司还都处于研发阶段，但它们中有的公司已经在纳斯达克上市了，有些也即将上市，这是因为人们看好他的前景。在这股浪潮中，我想中国也不会缺席，基因组编辑技术的确是革命性技术、革命性机会，之前很多不能想的事情，现在突然感觉到有着力点，这让我们这些一直做这个领域的人非常兴奋。当然具体实践起来需要非常多的积累和参与，我就说到这里，谢谢！
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