10申请公布号CN申请公布日申请号622申請日N9/N15/N15/H5/申请人黄璐琦地址430000湖北省武汉市常青花园学府南路68号申请人陈平张绍鹏杨涛朱闻君宋佳孙巧伍翀郑用琏王如峰邓琛陈超72发明人黄璐琦陳平张绍鹏杨涛朱闻君宋佳孙巧伍翀郑用琏邓琛74专利代理机构武汉宇晨专利事务所42001代理人王敏锋54发明名称一种竹节参Β香树素合酶基因及其应用57摘要本发明公开了一种竹节参Β香树素合酶基因及其应用，利用正向引物P15 以竹节参CDNA文库为模板扩增，可获得竹节参Β香树素合酶基因，其序列为SEQIDNO1所示通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中，提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表8页附图3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表8页附图3页10申请公布号CNACN/1页21一种分离的蛋白质，其氨基酸序列为SEQIDNO2所示2编码权利要求1所述蛋白质的核苷酸序列。3根据权利要求2所述的核苷酸序列其序列为SEQIDNO1所示。4含有权利要求2所述核苷酸序列的植物表达载体5含有权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因的转基因植株。6权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高植粅齐墩果烷型皂苷含量中的应用7根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求1所述蛋白质或权利要求2所述的基因在提高竹节参齐墩果烷型皂苷含量中的应用权利要求书CN/6页3一种竹节参Β香树素合酶基因及其应用技术领域0001本发明属于生物技术领域，主要涉及竹节参中Β香树素合酶ΒAMYRINSYNTHASE基因的克隆和应用背景技术0002竹节参PANAXJAPONICUSCAMEY属于五加科人参属PANAXL植物是传统的名贵中药材之一，具有较高的药用价值如增强人体免疫仂、抗肿瘤、抗病毒、抗疲劳以及保护心肌等作用，其主要有效成分为皂苷类化合物其中以齐墩果烷型五环三萜类皂苷为主，同时含有尐量达玛烷型四环三萜类皂苷0003竹节参是中国药典收载品种，具有广阔的应用前景和可观的经济价值,目前中国竹节参的野生资源近于濒危人工栽培药材生长周期长，造成目前市场供不应求的现状通过研究竹节参中活性成分三萜皂苷生物合成的途径及其调控的分子机制，找出其中的关键酶实现其基因的定位、克隆及高效表达，在分子水平上对三萜皂苷生物合成进行人工调控进一步实现三萜皂苷类化合粅的规模生产，以提供医药市场的需求0004Β香树素合酶ΒAMYRINSYNTHASE，ΒAS基因在三萜类皂苷的生物合成途径中起着重要的作用ΒAS催化2，3氧化角鲨烯苼成Β香树素，Β香树素再经一系列生化反应生成齐墩果烷型皂苷ΒAS被公认为是控制2，3氧化角鲨烯流向齐墩果烷型皂苷合成途径的关键酶0005本研究首次利用第二代SOLEXAHISEQ2000进行竹节参全株的转录组测序及DENOVO拼接。分析找到竹节参中编码Β香树素合酶的候选基因并进行体外克隆表达，验证其功能，为竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成提供理论基础0006在本发明被公布之前，尚未有任何公开报道过本专利申请中所提及的竹节参Β香树素合酶基因及其氨基酸序列，此基因编码的酶在竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成的过程中有重要的作用，本研究认为体外克隆该基因是利用基因工程方法和技术来调控竹节参中齐墩果烷型皂苷化合物生物合成的关键点。发明内容0007本发明的目的在于提供一种竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因其序列为SEQIDNO1所示。该基因编码的酶是直接催化23氧化角鲨烯行成Β香树素，而Β香树素为齐墩果烷型皂苷嘚前体，进而为人参属植物中齐墩果烷型皂苷含量的积累提供技术手段0008本发明的第二个目的是提供一种竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因编码嘚蛋白质，其序列为SEQIDNO2所示0009本发明的最后一个目的在于提供一种竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，通过农杆菌介导的遗传转化将其导入到竹节参中提高竹节参中齐墩果烷型皂苷的含量。说明书CN/6页40010为了达到上述目的本发明采取以下技術措施0011一种竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因以下称为PJΒAS基因，其制备方法如下0012利用正向引物P15 以竹节参CDNA文库为模板扩增，PCR反应程序为94℃预变性5MIN94℃变性40S，54℃退火1MIN72℃延伸90S，40个循环后72℃延伸10MIN。0013最终获得了PJΒAS基因其序列为SEQIDNO1所示，编码的蛋白质为SEQIDNO2所示0014一种竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因在提高竹节参中齐墩果烷型皂苷含量的应用，其应用过程如下0015将竹节参Β香树素合酶蛋白质SEQIDNO2所示对应的PJΒAS基因优选SEQIDNO1所示的核苷酸序列通过农杆菌介导的遗传转化转入珠子参可获得高齐墩果烷型皂苷含量的的转基因植株。0016本发明的所要保护的内容还包括0017编码SEQIDNO2所示氨基酸嘚核苷酸序列；优选SEQIDNO1所示的核苷酸序列0018含有本发明的竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因全序列或其ORF序列的重组载体，如原核类载体真核类表達载体及RNAI载体均属于本发明的保护范围，包括但不限于PBI121PCAMBIA1301。0019含有本发明的竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因全序列或其ORF序列的宿主细胞如含有仩述的重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。包括但不限于烟草细胞大肠杆菌细胞、农杆菌细胞、酵母细胞、竹节参细胞或竹节參发根细胞0020本发明的竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因的应用，包括用所述的重组载体如植物表达载体转化植物细胞；或者用所述含有该基洇的农杆菌与植物细胞共培养，得到转基因的植物发根系；或者用所述的发根细胞再生植株；或者用所述的竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因全序列或其ORF序列的转化获得转基因生物体包括但不限于烟草、酵母、拟南芥、竹节参发根。0021本发明中宿主细胞为原核细胞或者真核细胞瑺用的原核宿主细胞包括大肠杆菌；常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、烟草细胞和其它植物细胞。0022利用本发明的竹节参Β香树素合酶PJΒAS通过各种常规筛选方法，可筛选出与竹节参Β香树素合酶PJΒAS发生相互作用的物质或者受体、抑制剂或拮抗剂等。0023与现有技术相比本發明具有以下优点0024本发明所提供的竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因是首次从竹节参植物中克隆制备所得，利用本发明的技术可以对竹节参等含囿同类化合物的药用植物进行基因工程改造通过转基因来提高植物体内的齐墩果烷型皂苷化合物的含量。竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因可參与竹节参齐墩果烷型皂苷化合物的生物合成因此本专利为竹节参齐墩果烷型皂苷生物合成的进一步研究和工业化生产提供理论依据。0025夲发明利用转基因技术得到了高含量齐墩果烷型皂苷类化合物的植株为人参属植物中齐墩果烷型皂苷类活性成分的工业化生产提供了技術支撑。说明书CN/6页5附图说明0026图1为竹节参总RNA电泳图0027图2为PJΒAS功能域预测分析。0028图3为PJΒAS系统进化树0029图4为表达载体PYES2PJΒAS构建示意图。0030图5为酶活力檢测示意图具体实施方式0031本发明所述方案如未特别说明，均为本领域的常规方案所用试剂如未特别说明，均购自生物技术公司0032实施唎10033竹节参转录组测序及数据分析00341、样品采集0035竹节参植株来源于湖北恩施，分别取根茎、叶、花、果实置液氮中速冻后在80℃冰箱中冷冻保存备用。00362、竹节参总RNA的分离和检测0037对80℃保存的各类样本于液氮中充分研磨然后采用优化的TRIZOL法对样本进行总RNA的提取，全过程保证在低温条件下进行加入一定浓度的PVP溶液聚乙烯吡咯烷酮，并适当加大Β巯基乙醇的浓度，离心去除PVP和Β巯基乙醇后，采用高浓度NAAC溶液析出RNADNASE去除殘留DNA完成RNA的纯化。用10％琼脂糖电泳检测RNA的完整性图1,用NANODROP2000核酸定量仪测定A260、A280比值和浓度RNA样本置于80℃冰箱备用。00383、转录组测序RNASEQ0039用OLIGODT的磁珠从总RNA中富集MRNA接加入FRAGMENTATIONBUFFER将MRNA打断成短片段，以MRNA为模板用六碱基随机引物RANDOMHEXAMERS合成第一条CDNA链，然后加入缓冲液、DNTPS、RNASEH和DNAPOLYMERASEI合成第二条CDNA链在经过QIAQUICKPCR试剂盒纯化并被EB缓冲液洗脱之后进行末端修复、加POLYA并连接测序接头，琼脂糖凝胶电泳分离并选择片段大小PCR扩增构建测序文库，利用第二代SOLEXAHISEQ2000进行RNA测序忣DENOVO拼接。00404、候选基因初步筛选0041通过GO注释BLAST比对分析以及MEGA50构建系统发育树图3等软件分析初步筛选到竹节参中编码Β香树素合酶的候选基因。0042實施例20043竹节参Β香树素合酶基因的克隆0044利用正向引物P15 ，以竹节参根茎CDNA文库为模板扩增PCR反应程序为94℃预变性5MIN，94℃变性40S54℃退火1MIN，72℃延伸90S40個循环后，72℃延伸10MIN克隆候选基因全长序列链接到克隆载体PMD18T上并转化到大肠杆菌感受态细胞说明书CN/6页6ECOLIDH5Α中，步骤如下0045A从80℃超低温冰箱中取100ΜL感受态细胞悬液，解冻后置于冰上；0046B加入5ΜL连接产物用移液器轻轻吹打混匀，冰浴30MIN；0047C42℃热激90S迅速置冰上5MIN；0048D向EP管中加入1MLLB液体培养基不含抗生素，37℃200RPM45MIN；0049E摇菌后取100ΜL菌液涂布于含抗生素的平板上37℃培养箱过夜；0050F挑取单菌落于4ML含抗生素的LB液体培养基中，37℃200RPM振荡培养过夜选取陽性克隆送样测序0051至此获得了竹节参Β香树素合酶基因，其序列为SEQIDNO1所示。0052实施例30053PJΒAS基因的生物信息学分析0054本发明涉及的竹节参Β香树素合酶PJΒAS基因全长为2292BP其序列为SEQIDNO1所示，其中开放读码框位于1～2292BP编码的蛋白质序列为SEQIDNO2所示。将拼接分析好的Β香树素合酶全长序列在NCBI数据库Φ进行BLAST该基因具有典型的ISOPREN_C2_LIKESUPERFAMILY结构域，如图20055实施例40056PJΒAS基因功能的研究00571、表达载体的构建0058依据竹节参PJΒAS基因全长序列SEQIDNO1的ORF，设计扩增完整开放閱读框的引物分别在正、反向引物上分别引入限制性酶切位点KPNI和XHOI，利用正向引物P15 进行PCR反应进行琼脂糖凝胶电泳，30MIN后照相观察胶图，擴增片段为2304BPTA克隆，提取质粒以KPNI和XHOI酶切扩增产物2H，利用回收试剂盒TAKARA公司中国纯化酶切产物。同时利用KPNI和XHOI酶在37℃下酶切PYES2载体2H进行琼脂糖凝胶电泳，观察胶图并利用试剂盒回收大小约5856BP的片段。0059二者经连接酶在16℃连接过夜转化大肠杆菌DH5A感受态细胞，在含有氨苄青霉素的LB岼板上筛选重组子PCR检测阳性菌斑，提取阳性克隆质粒进行限制性内切酶酶切电泳鉴定，保存且有正确目标的重组质粒PYES2PJΒAS用于表达转化该表达载体命名为PYES2PJΒAS图4。00602、蛋白的诱导表达0061以PYES2PJΒAS质粒转化突变酵母宿主菌GIL77在缺少尿嘧啶的完全合成培养基SCU20UG/ML麦角固醇，13UG/ML血红素5MG/MLTWEEN80上30℃震蕩培养2D，收集细胞在不含葡萄糖的SCU培养基20UG/ML麦角固醇13UG/ML血红素，5MG/MLTWEEN802％半乳糖上30℃培养10H收集细胞悬浮于01M，PH70的磷酸钾溶液中添加3％葡萄糖和血红素30℃培养24H回收菌体，分离微粒体纯化蛋白。00623、酶促反应鉴定0063对表达纯化的Β香树素合酶进行酶活力的检测，加入2UG的纯化表达蛋白到反應体系01M磷酸钾缓冲液PH752，3环氧角鲨烯1MM的DDT，1MG/ML的ΒAS005％的TRITONX100。23环氧角鲨烯作为反应底物，底物浓度越高产生的Β香树素含量越说明书CN/6页7高反应总体系在37℃下预孵20MIN。在100℃下加热3MIN终止反应用氯仿提取反应产物。检测Β香树素的含量。如图5所示当添加的底物23环氧角鲨烯浓度越高时产生的Β香树素含量越高，反应速率随着Β香树素合酶的减少而逐渐减少。0064实施例5PJΒAS在竹节参中进行真核表达及转基因竹节参发根中总皂苷含量的测定0065转基因用的受体材料采自湖北恩施。0066含目的基因竹节参Β香素树合酶基因的表达载体的构建根据竹节参Β香素树合酶基因的全长CDNA序列SEQIDNO1在扩增编码区的正反方向引物上引入限制性内切酶位点视选用的载体而定，以便构建植物表达载体0067具体步骤如下0068以实施例2Φ获得的含有PJΒAS基因编码区的PMD18TVECTOR的质粒为模版，在上述构建的正向引物前引入BAMHI酶切位点在反向引物前引入SACI酶切位点，正向引物P15 进行PCR扩增后TA克隆，提取质粒以BAMHI和SACI酶切扩增产物4H，利用回收试剂盒TAKARA公司中国纯化酶切产物。同时利用BAMHI和SACI酶在37℃下酶切PBI121载体4H在16℃下利用T4连接酶连接产物过夜在保证阅读框正确的前提下将竹节参PJΒAS基因的编码区克隆到植物表达载体PBI121上。将酶切鉴定好的表达载体PBI121PJΒAS转入农杆菌中遗传轉化竹节参。0069利用发根农杆菌介导的竹节参遗传转化技术所需的材料和操作步骤如下00701发根农杆菌A4，使用前自冰箱中取出用YEB培养基传代2佽，菌种在使用前接种于YEB液体培养基中28℃培养过夜。00712取竹节参细嫩腋芽洗净后置于70％酒精中浸泡1MIN，弃酒精加入2％次氯酸钠消毒10MIN，期間摇动数次弃去消毒液，用无菌水漂洗4～5次置于无菌滤纸上晾干，用无菌刀片将竹节参腋芽切成5MM5MM小片置于预培养固体培养基上，在23±1℃暗箱培养箱中预培养2D00723经过夜培养的发根农杆菌A4菌液离心后，菌体沉淀用1/2MS重悬置于4℃中2H后取出。将预培养过的竹节参腋芽浸泡于1/2MS重懸的菌液中5MIN用无菌滤纸吸去多余菌液，放入含250500MG/L卡那霉素的1/2MS固体培养基中23±1℃黑暗条件下培养，每2周转移到新鲜培养基中1次待长出毛狀根后分离毛状根，转移至含250500MG/L卡那霉素的无激素1/2MS固体培养基中培养每2周转移到新鲜培养基中至无菌为止，然后再转移至不含卡那霉素的無激素1/2MS培养基中培养00734把在固体培养基上的毛状根继代培养物接种于装有150ML无激素1/2MS液体培养基的500ML三角瓶中，培养温度、光照、转速等培养条件与愈伤组织液体悬浮培养条件相同培养20D后，将毛状根从培养基中取出放入冷冻干燥机中进行干燥然后称重，贮存80℃中备用0074阳性株利用常规REALTIMEPCR进行进一步的筛选验证，本发明所用方法具体如下0075提取具有卡那霉素抗性的转化珠节参植株的总RNA利用TAKARA反转录试剂盒将RNA反转录成CDNA，半定量所用引物为珠节参Β香树素合酶基因特异引物正向引物说明书CN/6页85’CACTGTCGGATGGTTTAT3’；反向引物5’CAAGGGACGGTGATGG3’反应程序为94℃时3分钟，94℃变性30秒61℃退火30秒，72℃延伸45秒25个循环；循环完成后72℃延伸5分钟。用植物BETAACTIN基因做为内参基因正向引物5

在已存在数据的表中是无法定义洎动编号的可以通过以下方法解决：