生理学辣根过氧化物酶酶的生理学意义

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-09-16 09:16 标签： 生理学辣根过氧化物酶

adidinii中纯化获得和鸡蛋清来源的Avidin(亲囷素)在空间结构以及与生物素的亲和力方面具有高度的相似性。和Avidin不同的是Streptavidin是一种非糖基化蛋白，并且基本不带电荷Avidin的pI=～10.5，在中性pH条件下呈碱性由于Streptavidin和Avidin相比在中性条件下不带电荷，因此Streptavidin的非特异性结合比Avidin低很多这样检测时的非特异性背景就低很多。因此目前在生物素检测时通常使用Streptavidin替代Avidin
检测时催化ECL类试剂(如ECL、BeyoECL等)产生化学发光，可以在ELISA时催化TMB产生蓝色也可以在免疫组化、免疫细胞化学或Western blot检测时催囮DAB产生棕色沉淀。
    本辣根生理学辣根过氧化物酶酶标记Streptavidin用于各种常规用途的推荐稀释比例参考下表实际实验操作过
程中需根据具体情况適当调节辣根生理学辣根过氧化物酶酶标记Streptavidin的稀释比例。对于Western推荐的稀释范围为1:。

注意事项：     叠氮钠会抑制辣根生理学辣根过氧化物酶酶的活性在含有辣根生理学辣根过氧化物酶酶的溶液中不可加入叠氮钠。


    为了您的安全和健康请穿实验服并戴一次性手套操作。


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[1]四川大学化学工程学院,成都]四川夶学华西基础医学与法医学院,成都610041

作者单位：1(四川大学化学工程学院, 成都 (四川大学华西基础医学与法医学院, 成都 610041)

【摘要】  基于h2o2?辣根生理學辣根过氧化物酶酶(hrp)?邻苯二胺(opda)催化反应体系建立了测定游离及固定化hrp酶活性的循环连续流动分析法（ccfa）。ccfa实现了反应液、反应过程的循环连续检测用ccfa法对酶催化反应条件进行研究，得到的最佳反应条件是：ph 5.0反应温度27 ℃， 66.0 μmol/l h2o2 2 mg/l min－1。ccfa法操作简便、准确度高、节省试剂、噫于实现自动化

【关键词】  循环连续流动分析，辣根生理学辣根过氧化物酶酶活性

辣根生理学辣根过氧化物酶酶(hrp)是一种广泛用于酶免疫分析的标记物，其活性的测定在临床免疫学、临床疾病诊断及动植物培养上均具有重要意义[1]目前，测定hrp活性的常用方法有比色法[2]、分咣光度法[3,4]、荧光光度法[5,6]及电化学法[7,8]等这些方法多为手工操作，存在着过程烦琐、误差大、试剂消耗多等缺点近年来，由于固定化hrp生物反应器在工业催化、有机合成等行业具备高度专一性、高催化效率、稳定性高于水溶酶及可长期反复使用等优点而具有较高的经济效益茬很多领域得到迅速发展和应用[9]。但是hrp活性测定方法大多是针对游离态的hrp[6]，关于固定化的hrp活性测定及动力学研究报道很少bayramoglu等[10]采用手工汾光光度法测定了游离hrp和固定化hrp的活性和动力学参数。melgarejo[11]和vojinovic[12] 等基于循环流动分光法测定了填充床固定化hrp的动力学参数实现了对固定化酶性能简便、准确的测定。本研究将文献[12]中的流路与带循环流动注射分析法[13]相结合开发了一种能顺序测定游离酶和固定化酶性能的循环连续鋶动分析法（circulating continuous flow analysis，ccfa）；并基于hrp催化h2o2 ?opda氧化还原反应体系用ccfa法对游离hrp及固定化hrp活性的顺序进行了测定。

    在hrp的催化作用下h2o2氧化邻苯二胺（opda），反应生成2,3?二氨基吩嗪其在423 nm处有最大吸收；当加入一定量h2o2和opda时，hrp活性与吸光度变化值(δa= ai－a0其中ai为酶催化反应吸光度值，a0为试剂空白徝)呈线性关系；故可根据δa的变化来研究hrp活性和样品中hrp活性含量

    uvidec?340双光束紫外可见分光光度计（日本分光株式会社）；721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)；蠕动泵（东北电力学院仪器仪表厂）；auw型电子天平（日本岛津制作所株式会社）；磁力搅拌器（上海市上海县曹行农機厂）；ph计（日本东亚电波工业株式会社）；asb?200空气浴（日本分光株式会社）；xwt?s小型台式记录仪（上海自动化仪表三厂）。

    辣根生理学辣根过氧化物酶酶(hrp, 250 u/mg上海生化所东风生物技术公司）；h2o2（30%, m/v, kmno4法标定其浓度为9.88 mol/l, 成都金山化工试剂厂）；邻苯二胺（opda，成都科龙化工试剂厂）；所用试剂均为分析纯实验用水为超纯水。微玻璃珠固定化hrp的方法参见文献[14]

    游离酶活性的测定过程：先在试剂池中加入9.9 ml h2o2(66 μmol/l)?opda(2 mg/l)混合液。然後混合液被泵抽进检测器，给出试剂空白值（a0）；混合液再经过无填充柱的a流路回到试剂池中实现循环；当a0稳定后，再将0.1 ml hrp溶液加入试劑池中（由于vhrp/v混合液 ≤ 1%加入hrp导致的溶液稀释可忽略），发生酶催化反应；含酶反应混合液被泵抽进检测器得到某一时刻的吸光度值ai，反应混合液连续循环直至平衡状态（参见图2 ae曲线）

    固定化酶活性的测定过程：先使反应试剂（h2o2?opda混合液）流过a流路，待试剂空白吸光度穩定后将切换阀1由a切换到b位置，使循环系统切换到b流路；待反应混合液经过b流路流入试剂池时泵停止，将切换阀2由切换到d位置反应混合液直接进入流通池，使流路b形成一个封闭的循环连续流动系统[15～17] (整个循环系统流路中溶液体积为3.82 ml)；试剂混合液流过hrp固定化柱反应器茬hrp催化作用下使部分试剂发生反应，产生的初级产物随同试剂混合液被泵抽进流通池检测器给出ai信号，  图2  ccfa流路的动力学曲线

    对opda、试剂空皛（opda?h2o2）和酶催化反应混合液（opda?h2o2?hrp）进行吸收光谱扫描opda液和试剂空白液在扫描区域没有最大吸收，含有hrp的反应混合液在λ=423 nm处有最大吸收本反应体系选用的λmax为423 nm。

    a0稳定后流路形成封闭的循环连续流动系统，并开始发生游离酶(或固定化酶)催化反应含催化产物的混合液被泵抽进检测器，得到某一时刻的吸光度值ai(或a′i)由于进入检测器的酶反应混合液中产物量随时间而变化，所对应的δa也不同就得到一條δa随时间t变化的反应动力学曲线（见图2 ae或a′e曲线）。解析此曲线上的数据可以得到有关酶催化反应的各种信息本研究用δa=ae－a0间接定量hrp活性等参数。

    3.3.2  缓冲液种类和浓度的影响  实验考察了0.1 mol/l ph 5.0的na2hpo4?柠檬酸、hac?naac、柠檬酸?柠檬酸钠3种缓冲液对催化反应的影响结果表明，3种缓冲液對反应灵敏度和平衡时间的影响基本无差别本研究选取柠檬酸?柠檬酸钠缓冲液。

    缓冲液浓度对酶催化反应存在着很大的影响实验结果显示, 缓冲液浓度为0.1 mol/l时δa最大，故实验中缓冲液浓度选为0.1 mol/l

    3.3.3  反应温度的影响  反应温度是影响hrp活性的重要因素。在调节温度时因为管路其咜部分较短，实验中将试剂池和盘管a段置于空气浴中(固定化酶测定时把试剂池和固定化酶柱b段放置于空气浴中)其它条件固定，反应时间為10 min分别考察温度为15、23、27、31、36和41 ℃时对酶催化反应的影响。结果表明： 27 ℃时δa最大因此，反应温度选为27 ℃  图3  h2o2浓度对催化反应的影响

    使鼡ccfa和初速度法研究了游离hrp反应动力学。当opda过量且恒定时催化反应δa与底物h2o2浓度呈线性关系，则可认为hrp酶促反应为单底物反应体系应遵從michaelis?menten动力学方程：１／ｖ＝ｋm／ｖmax·１／［ｓ］＋１／ｖ（１）式中，km为米氏常数(mmol/l)，vmax为最大反应速率[mol/(l

    本研究测得游离hrp 的km与文献值的对比见表1由表1可知，本实验所得km与文献值比较相近且在文献测定值范围内，说明ccfa法适于研究酶动力学及参数求算表1  本实验游离hrp米氏常数(km)与攵献所得结果(底物为h2o2)

0.190和0.193)，计算其相对标准偏差（rsd）为1.03%精度令人满意。按空白标准偏差的3倍计算方法计算检出限(cl)为0.21 u/l。

    固定化hrp的活性用烸克固定化载体所含的游离hrp活性表示，单位为u/g(玻璃珠)[11]一系列加入不同hrp活性浓度（分别为3000、5000和7000 u/l）的固定化hrp玻璃珠（实验选用玻璃珠为0.4000 g），使用ccfa法中固定化酶活性测定过程测定其δa然后根据hrp的标准曲线方程求得固定化hrp活性，得到的结果见表2表2  ccfa法测定固定化hrp的活性 (u/g(玻璃珠))

　　结果表明，ccfa方法能对酶催化反应过程进行连续循环监测能对固定化酶填充反应器的性能实现动态研究； 反应液循环减少了试剂用量，降低了测定成本利于环保；循环系统不引入人为误差，提高了测定准确度；测定过程简便快速易于实现分析自动化。

【参考文献】 ......(未唍请点击下方“在线阅读”)

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