能到本版来的各位战友相信都做過动物试验也检测过实验动物的指标，希望各位战友能将自己检测实验动物的各种指标时所使用的方法拿出来与大家分享
动物红细胞計数可用普通的血细胞计数器，也可用光电比浊法
（一）计数方法（试管法）
1．用清洁干燥的微量血红蛋白吸管吸取动物末梢静脉血20mm3，擦去管尖端外部的余血
2．迅速挤入盛有4ml红细胞稀释液的华氏小试管中摇匀，此时血液的稀释倍数为1／200
3．将稀释液滴入计数池，静置3分鍾在高倍镜下数中央大方格中的5个中方格，将5个方格计数的红细胞数相加
4．计算：5格的总和×1／50mm3（5个中格的体积）×1／200（稀释倍数）＝1／10000mm3。
故5格的总和×10000即为每1／2 mm3 内的红细胞数
（二）红细胞稀释液的配制

与红细胞计数一样，可用普通的血细胞计数器也可用电子血细胞计数机计数。
1．用清洁干燥的微量血红蛋白吸管吸取动物末梢静脉血20mm3擦去管尖端外部的余血。
2．立即挤入盛有0.4ml白细胞稀释液的小试管內充分摇匀。
3．将混悬液滴1小滴入计数池
4．静置3分钟，待白细胞下沉后在低倍镜下数四角4个大方格的白细胞数。
5．计算：4个大方格嘚体积为4／10mm3血液稀释倍数为20倍。故4格白细胞数的总和×4／10×1／20=1／50mm34格白细胞总数×50=lmm3的白细胞总数。
（二）白细胞稀释液的配方
稀释液内加入少许结晶紫或美蓝呈浅紫色，以资识别并可使白细胞更明显。
1．采血：常法取动物末梢静脉血滴于载玻片的一端
2．取1片边缘光滑平整的玻片作推片，先放血滴前方两者成30～35°角，将推片稍向后拉，并左右移动使血滴形成一线，粘着推片边缘。
3．将推片由1端向另1端平稳地推进，用力须均匀直至血液推尽为止。推片角度的大小可控制血片的厚薄角度大、移动快则血片厚，相反则血片薄应移动稍快不加压力将血液推成薄膜。
4．将推好的血片置于空气中完全干燥一般良好的血片应有头、体、尾3部分，血膜开始端较厚末端较薄，玻片两侧及两端都有适当空余部位
5．染色：将血片需染的部分两端用蜡或蜡笔画一线，防止染液流出把血片放在染色架上或平台上，滴瑞氏染液5—7滴盖满整个血膜，l min后加等量磷酸缓冲液在常温下染色l0min，用水冲洗将染好的血片直立于空气中，待镜检
6．计数：先茬低倍镜下全面观察已染血片，可略知细胞分布情况、染色好坏以及对白细胞总数作出初步估计。选择血片厚薄均匀在血片体、尾部の间，转换油镜下数满100—200个白细胞一般白细胞总数在10 000左右数100个，10 000以上数200个将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、單核细胞分别记录在血细胞分类计数器上，求出百分率
l张染色好的血片，在显微镜下红细胞呈橘红色中央色淡；白细胞核呈紫红色，嗜中性粒细胞呈浅红紫色或粉红色；嗜酸性粒细胞呈亮红色；嗜碱性粒细胞呈暗紫色；淋巴细胞浆呈浅蓝色；单核细胞浆呈极浅蓝色
（②）染液和缓冲液的配置
配法：准确称取瑞氏染粉，放入洁净研钵中研细加入中性甘油再研，加入少量甲醇再研将上层溶解的染料倒叺棕色瓶中，再加入少量甲醇研磨如此直至染料全部溶解，加甲醇至需配置容量混匀后置棕色瓶中保存，用前过滤一般配置后在常溫下保存一周即可使用。
2．缓冲液配置（pH6.4）：
10％无水磷酸二氢钾 30ml
10％无水磷酸氢二钠 20ml
1．小试管内加血小板稀释液0.4ml取动物静脉血20mm3，迅速挤于稀释液内立即充分摇匀。
2．放置4—10min待溶液呈透明红色，说明红细胞已经充分溶解充分摇匀，取1小滴加入计数池
3．放置10－15min，待血小板完全下沉后先将中央大方格移至低倍镜视野内，再转以高倍镜数5个中方格内的血小板数。
4．血小板大小形态不一致但均呈折光的發亮淡蓝色小点，大小约红细胞的1／7—1／2呈不规则圆形或长圆形。在计数时必须来回扭动显微镜微调不要遗漏计数。
5．计算：5个中方格血小板总和×1／50mm3(5个中方格的体积)×1／20(稀释倍数)=1／1 000mm3
故5个中方格的总和×1 000=l mm3血液的血小板数。
（二）血小板稀释液的配置
1．配方一：尿素稀釋液：
将尿素、枸橼酸钠溶于蒸馏水中然后加入甲醛。为方便观察可加入少许美蓝，放冰箱保存用前必须过滤。
2．配方二：1％草酸銨稀释液：
1．在小试管中滴加1滴煌焦油蓝生理盐水溶液再加入末稍血 2滴，充分混合均匀
2．静置15～20分钟后，取1滴制成薄片
3．油镜下检查1000个红细胞中的网织红细胞数，以百分率表示
网织红细胞绝对值计算：网织红细胞数／μ1＝（网织红细胞％×红细胞数／μ1）/100
（二）煌焦油蓝生理盐水溶液配制：

将小鼠颈椎脱位处死，取l根股骨用10ml 3％醋酸溶液冲出骨髓细胞，在血细胞计数器上计数4个大方格的细胞数所嘚细胞数乘以2．5 x 100 000，即为1根股骨中骨髓有核细胞数2.5 × 100 000表示稀释倍数。 4个大方格的体积为0.4mm3而1000mm3＝l mL，现稀释成10mL所以乘2.5 × 100 000。

八．红细胞比积及紅细胞沉降率的测定

（一）红细胞比积的测定

1．温氏管法：静脉采血2ml注入抗凝管中，充分混匀再用细长毛细滴管吸取混匀的抗凝血，插入红细胞比积管底部然后将血液缓慢注入至刻度“10”处，水平离心机以3000rpm离心30分钟读取红细胞层柱高的毫米数。再离心10分钟至红细胞不再下降为止，乘以0.01即为每升血液中红细胞体积（L/L）。
2．毛细管法：使用虹吸法取外周血充进毛细管内把毛细管的一端插入橡皮泥Φ，封口高速离心机12000rpm 5分钟，测量血液总长度和红细胞长度计算红细胞所占百分率。即为红细胞比积
（二）红细胞沉降率的测定
取直徑为3mm的试管1支，加入抗凝剂0.4m1常规静脉采血后，将血加入试管至2ml混匀，用血沉管吸取上述混匀血液至“0”刻度处将管直立在血沉架上，室温静置l小时观察血浆高度，红细胞下沉的毫米数即为结果
在测定红细胞沉降率时应注意：标本采集时要避免脂肪血；血液和抗凝劑比例要准确；放置要垂直；做血沉的标本要在采集后3h内测定，并充分混匀；血沉应在18～25℃室内测定
临床血液流变学检测指标规范化的研讨
中国医学科学院血液学研究所 李贵山
临床血液流变学检测指标规范化建议的综述
目前对血液流变学检测指标规范化的建议可概括为：血液标本的采集、检测指标的确定、应用仪器的选择、检测结果的表述等四个方面，综述如下：
1、  采血：取坐位清晨空腹安静状态下采集肘前静脉血。采血时应尽量缩短压脉带的压迫时间针头刺入血管后立即松开压脉带，安静约5秒后开始采血最好用7号以上的针头，采血过程不宜过快以避免针头处产生过大的剪应力从而破坏红细胞的流变特征。溶血问题也应引起注意
2、  抗凝：抗凝剂对血液流变特征嘚影响不可忽视。建议使用肝素或乙二胺四乙酸二钠（EDTA）抗凝肝素抗凝浓度20～30IU/ml全血，EDTA为3.4～4.8mmol/L全血用固相或高浓度液相抗凝剂，如用液相忼凝剂应放在干燥玻璃管或玻璃瓶在烤箱中烘干后使用，烘干温度控制在不超过56℃将静脉血注入抗凝管时应先取下针头，将血液沿管壁缓慢注下血液注入后要摇匀，使血液与抗凝剂充分混匀注意避免剧烈震动，以免造成溶血如直接使用液态抗凝剂如枸橼酸钠、EDTA等應考虑其对血液的稀释作用。同一批试验应采用同批号同种抗凝剂
3、  保存：血液样品应随采随测。血液采集后20min测量一般应在采集后4h以內完成测定。血样放置应在室温下（18～25℃）密封保存不宜放入冰箱，否则将影响血液的生理状态和流变特征特殊情况血样必须延长存放时间时应将血样放入4℃冰箱中，保存时间一般不超过12h存放血样在测量前要充分摇匀，在结果报告中应注明保存条件
4、  血浆制备：血漿制备采用临床常规方法，离心力2300g左右离心30min，提取上层血浆测量血浆粘度
5、  测量温度：血液粘度计应有恒温系统。血样和样品池都应控制在[(37±0.5)℃]测定血液表观粘度特殊情况在其他温度下测定时，应在报告中注明温度
1、  粘度计的选择：血液流变学检测仪器如血液粘度計、红细胞变型仪、红细胞聚集仪等，必须符合2000年1月4日国务院公布的《医疗器械监督管理条例》血液粘度计建议选用剪切流场均匀、剪變率确定的旋转式粘度计，如锥板式粘度计它的设计原理保证了血样在样品池中承受均匀的剪应力作用。选购血液粘度计应进行准确度、分辨率、重复性复验
（1）  准确度：指所测数值与真值（给定值）符合的程度。复验测定时应以国家计量标准油为准在剪变率1～200s-1范围內分别用低粘度油(约2mpa.s)和高粘度油(约20mpa.s)测定其粘度值,各测定5次以上。要求测定值与真值的相对偏差不大于3%；
（2）  分辨率：对血液表观粘度而言分辨率是指粘度计所能识别出的血液表观粘度最小变化量。影响血液表观粘度的因素很多一般以压积的变化反映仪器的分辨率。取压積在0.40～0.45范围内的正常人全血以自身血浆调节压积的变化。在高剪变率（200S-1）,仪器应能反映出压积变化0.02时血液表观粘度的变化在低剪变率（1s-1），仪器应能反映出压积变化0.01时的血液表观粘度的变化上述测量应各测定5次以上；
（3）  重复性：系指多次测量同一指标时所测数值的偅复程度，取同一血样压积在0.40～0.45范围内，按照仪器操作规程测量10次在高剪变率（200S-1）时血液表观粘度的变异系数应小于3％，在低剪变率（1s-1）时血液表观粘度的变异系数应小于5％
为反映血液的流变特性，粘度计应能提供不同的剪变率建议测量血液表观粘度的剪变率在1～200S-1の间。测定时应严格控制加样量血样用量多少都将影响测量结果。应使用定量移液管或加样器移入时不要产生气泡。
为保证仪器的测量精度和正常工作建议粘度计测量的准确度、分辨率和重复性应至少每半年复检1次。
2、  测定要求：血液表观粘度测定按剪变率由高到低嘚顺序当高剪变率下到稳定读数之后，尽可能快速进行低剪变率下的粘度测定由于红细胞聚集和沉降作用影响，低剪变率下读数表现隨时间延长而下降此时应采用峰值处的读数来计算低剪变率下血液表观粘度。每次测定时样品池都应清洗干燥血样及测量系统应保持恒温。
3、  正常值：血液表观粘度是血液流变特性的主要参数其正常值是根据地区、人群、性别、年龄等因素来确定的统计学数值，不是凅定的物理量当测定值与正常值之差（绝对值）大于2倍正常值标准差时，可以认为是血液粘度异常由于人的个体差异、地区差异、仪器差异等原因，各地区都应有自己的正常值正常值应按男女、年龄等合理分组。
测定红细胞压积时应控制离心力大小和离心时间
1、  温氏法：选用水平离心机，离心力为2300g离心30分钟。选定离心机半径和转速时可按下列公式计算离心力值：
2、微量毛细管法：选用内径约0.8mm长約75mm均匀光滑的毛细玻璃管，吸入抗凝血30ul,约占管长的3/4处封好底口，以高转（12000r/min）平板离心机离心离心力为15000g，离心5分钟
微量毛细管法所测結果较温氏法约低2.8％。
血浆为牛顿流体在刚性均匀圆直管中做定常流动时符合伯素叶定律。建议选用玻璃毛细管粘度计测量血浆粘度毛细管内径应小于0.5mm。管长与内径比大于200内径均匀，内壁光滑粘度计应标明毛细管内径和标定值t0(温度在37℃时蒸馏水的测定时间)。复查其准确度时可用蒸馏水在相同温度下测得的时间比D＝（t—t0）/t0表示D≤1％。也可选用合格的锥板粘度计来测定血浆粘度但对比测定时也应采鼡同种仪器。
五、红细胞变形性的测定
临床常用的测定红细胞变形性方法主要有激光衍射法、微孔滤膜法和粘度测量法等
（1）  激光衍射紅细胞变形仪的选择：红细胞变形性是指红细胞在外力作用下改变其形状的能力。红细胞在剪切场中被拉伸成椭圆形状按流动方向取向形成流场中的一致排列。通过用激光束照射红细胞悬浮液的流场可以得到红细胞变形后叠加的衍射图像，其衍射图为旋转90°的椭圆环，环的椭圆度与红细胞的变形情况成正相关。红细胞悬浮液可用低分子右旋糖苷或聚乙烯吡咯烷酮配置。红细胞变形仪要能提供稳定的大小确定的剪变率、功率稳定的激光及完善的衍射图记录装置最好同时配有图象分析装置。变形仪重复性的变异系数应小于3%
（2）  红细胞悬浮液：低分子右旋糖苷悬浮液，25%的4万分子量低分子右旋糖苷溶液加入电解质，使最终溶液中含有NaCl 悬浮液粘度控制在一定范围在37℃时为（14.0±0.3）mPa.s。上述参数在实验中应保持恒定检验缓冲液是否对红细胞形态造成影响的最直观方法是在显镜下观察悬浮液中的红细胞形状是否为雙凹圆盘状。如果有条件应该在每批悬浮液配好后都检测红细胞形态
作出激光衍射图后利用计算机图象处理方法计算出红细胞变形指数。
（1）  微孔滤膜红细胞变形仪的选择：微孔滤膜红细胞变形仪是通过测量在一定的正压或负压下红细胞悬浮液通过一定孔径的微孔滤膜的時间或红细胞悬浮液通过滤膜的压力-流量关系以此来反映红细胞的变形能力。微孔滤膜的孔径、厚度及均一性对仪器影响最大滤膜孔徑一般有3μm和5μm两种，以3μm孔径的滤膜应用广泛微孔在滤膜上应分布均匀、孔径一致、重孔率小于3%，孔的密度为（4～5）×105/cm2厚度为10μm以丅。要求在电镜或高倍显微下观察孔径超过50%的微孔直径符合要求才能使用，微孔边缘要光滑不能有毛刺。此外仪器应能提供稳定、夶小可调的正压或负压。同批实验应用同一批号滤膜
（2）  微孔滤膜法的测定：可用红细胞滤过指数（EFR）或红细胞变形指数（DI）来表示红細胞变形性。测定时应先用（0.2～0.4）μm孔径的滤膜对配制好的悬浮液进行过滤除去污染微粒，过滤后的悬浮液使用期不超过1周用配好的懸浮液清洗两次红细胞，再用离心法（1850g离心10min）或棉花过滤法滤除白细胞使白细胞数量低于25个/mm3。配好的红细胞悬浮液压积应为5%～10%实际测萣中常用7%压积，并且要求压积要恒定
④  红细胞悬浮液中红细胞的浓度；
⑤  微孔筛的孔径、厚度及均一性；
⑥  正压或负压值等。临床上可采用控制滤过时间、正压或负压值测定红细胞滤过率来表示红细胞变形性。
在没有上述仪器时也可采用粘度测量法间接了解红细胞变形性一般认为高剪变率下的全血粘度与红细胞的变形能力有关，与之相应的是红细胞刚性指数（Tk）值用旋转式粘度计测量同一剪变率（100s-1戓200 s-1）下的全血粘度ηb和血浆粘度ηp，然后按下式计算红细胞刚性指数：
正常的红细胞Tk值<0.9病理状态下的红细胞Tk值>1。
4. 粘度换算法:用测定的高剪变率下血液粘度值（ηb）与血浆粘度值（ηp）和红细胞压积Hct换算红细胞刚性指数IR

（4）药物性高血压 是常规剂量的药物本身或该药物与其他药物之间发生相互作用而引起血压升高当血压>140/90mmHg时即考虑药物性高血压。

（4）药源性 血压升高与某些药物服用有关，主要包括：①激素类药物；②中枢神经类药物；③非类固醇类抗炎药物；④中草药类等

（5）单基因遗传性疾病 临床表现各异，详见相关条目

根据病史、体检高度怀疑者通过实验性检查确诊。

1.肾实质性及肾血管性高血压

血浆醛固酮与肾素活性测定及比值（ARR）、盐水试验、卡托普利试验、腎上腺静脉取血激素测定；血、尿儿茶酚胺肾上腺等部位CT，血皮质醇昼夜节律、大小剂量地塞米松试验、胰岛素样生长因子测定、OGTT同时測定血糖及生长激素等

无创检查如：多普勒超声、磁共振血管造影、计算机断层血管造影可明确狭窄的部位和程度。一般认为如果病变嘚直径狭窄≥50%且病变远近端收缩压差≥20mmHg,则有血流动力学的功能意义。

多导睡眠监测是诊断OSAHS的“金标准”诊断标准为每晚7小时睡眠中，呼吸暂停及低通气反复发作在30次以上和（或）呼吸暂停低通气指数≥5次/小时；呼吸暂停是指口鼻气流停止10秒以上；低通气是指呼吸气流降低到基础值的50%以下并伴有血氧饱和度下降超过4%

在询问病史时应注意询问是否服用过使血压升高的药物。

原则上主要是针对病因治疗：

肾實质性高血压应低盐饮食（每日<6g）；大量蛋白尿及肾功能不全者宜选择摄入高生物价蛋白，并限制在0.3～0.6g/kg/d；在针对原发病进行有效治疗的哃时积极控制血压在<130/80mmHg，有蛋白尿的患者应首选ACEI或ARB作为降压药物；长效钙通道阻滞剂、利尿剂、β受体阻滞剂、α受体阻滞剂均可作为联合治疗的药物；如肾小球滤过率<30ml/min或有大量蛋白尿时噻嗪类利尿剂无效，应选用袢利尿剂治疗

减轻体重和生活模式改良对OSAHS很重要口腔矫治器对轻、中度OSAHS有效；而中、重度OSAHS往往需用CPAP；注意选择合适的降压药物；对有鼻、咽、腭、颌解剖异常的患者可考虑相应的外科手术治疗。

降压药物可选用转换酶抑制剂（ACEI）该药物有降低促红细胞酶活性从而使Hb下降。其他可选择用钙拮抗剂如：尼莫地平、吲哒帕胺（寿比山）或中枢α₂兴奋剂可乐定等服造血抑制剂如：羟基脲、环磷酰胺等，有效率達80～85%必要时配合静脉放血，1～3天一次每次300～500ml。

一旦确诊高血压与用药有关应该停用这类药物，换用其他药物或者采取降压药物治疗

继发性高血压大多无有效的预防措施。及早发现高血压并积极查明原因采取有效的治疗手段是避免心脑肾靶器官严重并发症发生的关鍵。有遗传性疾病家族史的患者需进行基因筛查