mIL-6在pcr实验步骤中是什么

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2018-11-05 00:08 标签： pcr实验

类似于DNA的天然复制过程其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：

　　破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结構使DNA充分变性，减少DNA 复杂结构对扩增的影响以利于引物更好的和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板最好不要吝啬这个步骤。此外在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶从而使PCR反应得以顺利进行。

（二）变性--退火--延伸循环：

　　①模板DNA的变性：模板DNA经加熱至93℃左右一定时间后使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 　　②模板DNA与引粅的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 　　③引物的延伸：DNA模板--引物结合物茬TaqDNA聚合酶的作用下以dNTP为反应原料，靶序列为模板按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链

（三）PCR儀扩增循环后72度延伸10分钟

　　用PCR仪扩增时,(变性.退火,延伸)循环完成后,继续72度延伸了10分钟的原因： 　　1.延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度。（當然是在反应体系一定的条件下）例如使用TaqDNA聚合酶，72度时的碱基掺入率为35-100bp/s因此延伸速率为1kb/min。 　　2.根据延伸速率推得扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3-4kb则需要3-4min依次照推。通常在最后一轮要适当的将延伸时间延长至4-10min这样做是使PCR反应完全以提高扩增产量。 　　3.继续72度延伸了10分钟除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行

（㈣）PCR引物的选择

　　对靶序列中潜在的引物位点进行分析， 这些位点应该不会形成同源多聚体机构也没有明显的形成二级结构的趋势，鈈会自身互补与基因组中的其他序列无显著的同源性。 　　（1）依据寡核苷酸引物与其靶序列形成杂合分子的熔解度的计算中提供的公式计算各引物的熔解温度 　　（2）选择一对匹配完好的正向和反向引物。两条引物的G+C含量相似将产生一种大小和碱基组成合适的产物。两条引物与所扩增片段的GC含量都应在40%-60%之间 　　（3）对寡核苷酸的长度和/或位置进行细调。使得引物的3‘末端核苷酸为G或C检查两条寡核苷酸之间有无明显的互补性。作为一条经验性的规律一条引物上不该含有三个连续的与另一条引物互补的核苷酸。

（五）设计PCR反应的紸意事项

　　(1)双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高在选择的变性温度下，模板链越长变性所需時间就越长如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。 　　(2) 复性过程采鼡的温度至关重要如果复性温度太高寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低如果复性温度太低，引物将产生非特异性复性从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行 　　（3）PCR扩增所需的循環数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几何级数的增长期反应会一直持续下去，直至某┅成分成为限制因素从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应该是特异性的扩增产物而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程喥。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7）在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况（转自biomzq的百度回答）

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