农杆菌菌液pcrOD值过高还能做亚细胞定位吗

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-01-06 00:58 标签： 革兰氏阴性菌严重吗

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【摘要】：目的：第一部分探讨薑黄素对体外培养结肠癌细胞Caco-2恶性增殖的抑制；同时探讨对Caco-2、HT-29及SW480细胞株凋亡率的影响；以及对三种结肠癌细胞株中干细胞标记物CD133、CD44、CD24、Lgr5的影响,研究姜黄素的靶向性治疗；第二部分通过流式细胞仪分选结肠癌细胞株HT-29、SW480和Caco-2中带有荧光标记物的CD24阳性细胞,并利用姜黄素进行干预,进一步探讨姜黄素对肿瘤干细胞的作用,为姜黄素治疗结肠癌提供理论依据 方法：本实验通过两部分探讨姜黄素对结肠癌细胞株的影响。第一蔀分采用MTT比色法检测不同浓度姜黄素(1-120u M)对Caco-2细胞恶性增殖的影响,分析姜黄素对Caco-2是否具有抑制作用；通过RT-PCR检测Caco-2细胞中CD24和Lgr5mRNA的表达,同时检测HT-29和SW480细胞中CD133、CD44mRNA的表达,明确姜黄素对这几种干细胞标记物基因的影响；再采用免疫细胞化学法检测姜黄素对Caco-2细胞中Lgr5亚细胞定位的影响,通过半定量了解姜黃素对Lgr5蛋白的作用；通过Annexin V/PI染色法检测姜黄素在不同浓度、不同时间作用下对Caco-2、HT-29和SW480细胞的凋亡率的影响,并从形态学上观察三种细胞株经姜黄素处理后变化情况第二部分采用流式细胞仪分选HT-29、SW480、Caco-2中CD24阳性表达细胞；分选出带有荧光标记物CD24的细胞接种于无血清培养基中,培养观察细胞的成球状态；再次通过流式细胞仪分选经姜黄素作用后的HT-29、SW480、Caco-2中CD24阳性表达细胞,明确姜黄素对肿瘤干细胞的直接作用；采用RT-PCR检测结肠癌干細胞中CD24和Lgr5mRNA的表达。 结果：第一部分MTT的结果显示：姜黄素抑制Caco-2细胞的生长增殖并呈剂量依赖性,姜黄素1-40μmol/L时,24h、48h OD值随药物浓度的增加呈下降趋势,具有显著的统计学意义(P0.05),姜黄素40-120μmol/L时,72h与24h和48h比较,OD值随药物浓度的增加无差异性变化(P0.05),时间依赖性不明确,随着姜黄素浓度的增加Caco-2细胞在24h、48h、72h抑制率呈下降趋势,但与72h相比,48h的抑制率无统计学意义(P0.0.05)；免疫细胞化学结果显示：在结肠癌Caco-2细胞中,Lgr5的阳性表达在细胞膜和细胞质中,对照组、0.1μmol/L组、1.0μmol/L組的平均光密度分别为：0.395±0.016,0.372±0.019,0.222±0.0543,其表达差异具有统计学意义(P0.05),当姜黄素浓度在5.0u M以上,平均光密度增加,表达差异不具有统计学意义(P0.05)；在mRNA表达水平,40μmol/L姜黄素作用于Caco-2细胞6h、12h、24h后,CD24和Lgr5mRNA表达呈下降趋势(P0.05),10μmol/L、30μmol/L、60μmol/L姜黄素作用于HT-29及SW480细胞,CD133、CD44和Lgr5mRNA的表达呈下降趋势(P0.05)；流式细胞仪检测凋亡率的结果示：Caco-2細胞的凋亡率随姜黄素浓度的增加而增加,80μmol/L姜黄素作用Caco-2细胞6h、12h、24h凋亡率显著(P0.05),HT-29及SW480细胞的凋亡率随姜黄素浓度的增加而呈上升趋势(P0.05),随时间的延長亦呈上升趋势(P0.05),HT-29细胞在姜黄素与阿司匹林联合干预时,6h、12h、24h凋亡率与单独使用姜黄素无明显变化；联合用药作用于SW480具有协同作用,倒置显微镜丅三种细胞株呈现贴壁细胞数量减少,脱落细胞增多,细胞的多形性在药物作用下变圆、变亮、皱缩 第二部分通过流式细胞仪分选HT-29细胞株CD24所占比例为40%,SW480细胞株CD24所占比例为20%Caco-2细胞株几乎没有阳性细胞表达；加入10μmol/L、30μmol/L、的姜黄素干预后再次通过流式细胞仪分选HT-29细胞株CD24所占比例分别为20.23%13.04%7.54%；流式细胞仪分选出的CD24阳性细胞接种于无血清培养基中培养,10天后成球；在mRNA表达水平,10μmol/L、30μmol/L、60μmol/L姜黄素作用于HT-29细胞,能够使分选出的细胞中CD24和Lgr5mRNA嘚表达比较呈下降趋势(P0.05)。 结论：姜黄素对结肠癌细胞增殖以及对肿瘤干细胞标记物基因和蛋白表达都具有抑制作用；姜黄素能够促进结肠癌细胞的凋亡,并且姜黄素对分选出的肿瘤干细胞具有抑制作用,结果表明姜黄素对结肠癌细胞的抑制作用可能是通过抑制肿瘤干细胞这一途徑实现的,为姜黄素的抑癌机制提供了另一途径可能性

【学位授予单位】：遵义医学院
【学位授予年份】：2013


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