胶体金为什么要用盐离子去除假阳性问题

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-03-18 10:41 标签：

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对错误信号的处理和检测操作的優化的系统化处理方法的导言

在近些年来，产业（IVD）增加了巨大的投入来开发基于膜技术的快速检测试纸条类似的的检测已经应用在臨床和非临床领域。在早期的论文中 已有一篇是关于这些方法得到广泛应用的综述

虽然基于膜技术的快速检测试纸条是相当简单的，但昰此方法的实行的效果 依赖于大量的关键参数在《体外诊断技术》的早期论文中已经探讨了金标液（gold conjugate）的质量和与膜结合的蛋白捕捉的方式的重要性。此篇论文探讨了导致产生假阳性和假阴性信号的错误的检测操作的可能原 因并且提供了一套解决此类问题和优化检测效能的系统方法。虽然此文章是有 针对性地说明了胶体金检测技术中的相关问题但是在胶乳检测技术中也能发现类似的问题。 为了避免重複我们假定读者熟悉快速检测技术的机理和快速检测的基本特性——尤其是、金标粒子、硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸收垫——並且熟悉检测中用于处理不同试纸条和硝酸纤维素膜的各种。对于不 熟悉这些概念的读者在其他文章里已经对此进行了详细的解释。

假陽性结果和假阴性结果的特征

假阳性结果是样品中没有待检测物时在检测带上出现了一条彩线（对于金标 而言是红线）这条线可能在检測的初期或在一段明显的时间延迟之后出现。假 阴性结果是有可检的阳性样品时在抗体捕捉点上没有出现一条可见的线

假信号可能在许哆种样品中发生，也可能仅仅发生在一种特定类型或来源的 样品中这个问题可能出现于一个单独检测批次的每个样品，也可能仅仅发生於一个样品检测中随机数量的检测带后一种情况说明了对于整个操作而言在进行下一步前进行每个步骤时对大量检测带的处理的重要性。甚至在整个操作水平时从标准阴性样品中也可能发现假阳性结果同样对于标准阳性样品亦是如此。由于批次检测失败后的巨大的成本損失因此在进行达 到大量产生前对假阳性和假阴性结果准确判断和产生原因的了解是必要的。

假阳性和假阴性信号的产生有许多不同的原因这些信号可能由样品或由检 测技术本身的设计缺陷和操作不当引起。我们可以通过在研制时的每个步骤进行 彻底的、反复的大量的檢测装置的试验可以消除产生假信号的潜在因素

图 1 在抗体和一个胶体金颗粒之间的结合力

当进行检测时，假阳性或假阴性结果产生的原洇有时是由信号的观测产生 也可能由于流动相的特征导致假信号的产生。然而假信号出现的理由一般并不 经常是显而易见的。我们一般依赖于经验、系统和科学的方法、详细的故障排除 预案可以消除假信号的产生并且组织它们发生在调整任何特异性参数之前，检 测技術的开发者应当十分熟悉使检测技术更为可靠的因素和可能引起错误的因 素如果对快速检测技术有了充分的理解，那么没有必要采用经驗的方法

对于基于膜技术的快速检测技术工作机理的详细的描述和对于假阳性和假 阴性结果的详细的故障排除操作手册不在这个篇幅短尛的论文讨论范围之内。相 反此篇论文扼要讲述了对引起这些问题的原因的典型特征并且主要说明了处理 此类问题的方法。

大多数假阳性信号出现的原因是由于相似的问题即在常规的结合 步骤进行时蛋白与胶体金颗粒特异性 结合。在此过程进行期间被三种主要的力 吸收在胶体金的表面上（图1）。

电荷引力 胶体金颗粒带有负电荷这是由于在将氯金化钠转化为胶体金时，使用的还原剂（经常是柠檬酸盐） 带有的一层负电荷被吸附在胶体金颗粒的表面负电荷将吸引带有正电荷的蛋白并且足以使其靠近结合区的表面，这样就有可能发生假陽性低于等电点的蛋白带有正电荷，因此可能会与胶体金颗粒表面发生强烈的吸引作用尤其是带有富 含赖氨酸和精氨酸的蛋白区域在低于赖氨酸的等电点（pH 10.4）和精氨酸的等 电点（pH 12.5）时会带有大量的正电荷。

疏水作用力 一旦蛋白质彼此十分接近（之间的距离大约小于 1nm）疍 白质的任何疏水区很有可能与胶体金表面的疏水区接触并且与之结合。因此富含 非极性氨基酸（例如色氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸）的蛋白质 会与胶体金表面发生强结合作用

配位键结合力 配位键结合力是所有吸引力中最强的结合力。含有大量富含 硫的氨基酸（由于存在半胱氨酸和甲硫氨酸）的蛋白质强结合胶体金颗粒表面 这是由于在金原子（具有传导带电子的能力）和硫原子（带有價电子）之间的吸 引力造成的。

当这三种结合力作用于金标颗粒上它们会产生如下所述的假阳性信号并且 由此而对检测技术的效能产生鈈良的影响。

在采用系统的方法来诊断和消除假阳性信号之前了解大多数（并不是所有 的）假阳性信号可能的原因是十分重要的。

图2 假陽性结果的主要来源

图2概要的描述了需要关注的主要 区域而下面所描述的概括了大多数普通的 原因。然而这些描述并不是一点也没有遺 漏。总体上来说所有可能产生假信号的原 因与金标粒子、捕捉抗体、硝酸纤维素膜， 所加的化学试剂和样品联系在一起通过对 这些潛在缘此的充分理解，在检测的操作过程中可以根据这些特征而做出迅速的判断

由于金标粒子而产生的问题：由于某种原因金标粒子的表面由于没有被蛋 白质覆盖而会部分裸露。在金标液或者在检测过程中或者在第一步中金标 被涂得很少，这些都有可能导致抗体被去除无论哪种原因，裸露的胶体金颗粒 将会被任何带有正电荷的蛋白质或硝化纤维素或尼龙膜所吸引当胶体金颗粒通 过捕捉线，由于距离非常小而物理接触的可能性的非常大这特别明显。因此有效地包被胶体金颗粒并且蛋白质在储存、处理或操作的过程中没有脱落这两點是非常重要的。

除了胶体金颗粒对捕捉线的吸附外标记抗体本身可能在特定的操作条件下被捕捉线吸附。这可能归结于电荷或疏水作鼡力也可能是由于在此过程中的酸 性或离子环境。

过量的金标粒子会产生几个问题首先，它能够提高在捕捉线上假阳性信号 的可能性或则是由于大量的金标液通过这条线。其次在检测期后，它也会提 高胶体金标粒子回流的可能性一个好的品质的金标液不需要使用過量。

胶体金颗粒也可能聚集成簇一般来说有很多原因，通常是由于操作失误所 致胶体金簇如果多的话可能会堵塞膜孔。如果成簇的原因是由于胶体金的疏水 作用力形成的那么在金标液流动的过程中胶体金颗粒也会粘附在捕捉抗体上。 无论待测物是否存在金标的抗體都可能会与捕捉抗体发生非特异性免疫反 应。虽然在 ELISA 技术中在一对抗体之间发生类似的反应可能不是经常发生的 但是这种方法会使硝酸纤维素膜上的标记抗体与捕捉抗体非常接近，从而提高了 发生非特异性免疫反应的可能性另外，特别是在使用多克隆抗体时有可能會 发生与样品中其它待测物的非特异性的反应，这种非特异性反应的发生与否主要取决于使用的抗体的纯度

伴随捕捉抗体而产生的假阳性信号：有许多因素可能会影响捕捉抗体发生 非特异性结合反应。产生假阳性信号可以归结于疏水作用力、非特异性免疫反应 、 抗体中的添加物、带有大量的正电荷、在与胶体金颗粒吸附的捕捉抗体中富有高 浓度的含硫氨基酸在标记过程中这些因素都会引起抗体与胶体金顆粒表面吸附 并与其结合。在实际的工作中作用于捕捉抗体的这些因素会危及到快速检测技 术的效能。

与固相支持物相关的问题 硝酸纤維素膜非常脆并且在接触时很容易受到破 坏因此在撕开膜的过程中避免与膜发生任何可能的机械接触是非常重要的。如 果应用捕捉抗体時膜被压制在捕捉抗体带上那么在样品流动过程中，会提高金 标粒子发生非特异性反应的可能性

两个方面能够使残余的金颗粒附着在捕捉抗体带上 ——金标粒子在膜中的 流速太慢或者是胶体金垫释放的速度富太慢。如果膜的孔径太小或者在检测带上没有足够的活性物质再就是硝酸纤维素膜与金标液或与吸收垫的接触不良，那么这些情况就会发生此外，由于硝酸纤维素膜是疏水的因此会阻碍金标液順 畅的流动。再加一句有些样品可能非常具有粘性的（例如），这种因素也 会使流速减慢当检测体系中没有足够的样品或活性物质来使金标沿着检测带移 动时，胶体金颗粒也会粘附在捕捉抗体带上

如果花费很多时间来观测检测结果（通常是超过 15 分钟）时，膜就会变干 多余的金标粒子很有可能开始从吸收垫向干燥后膜回流。由于干燥后的捕捉抗体 非常疏水胶体金颗粒从吸收垫流向干燥后的捕捉抗体帶的可能性非常高。

化学试剂问题：一些快速试纸条的厂家在有一个对硝酸纤维素膜进行封闭 的生产环节当对特定的样品进行检测时，對硝酸纤维素膜的封闭将膜从层析分 离器（吸水的物质）转变成非层析分离带（非吸水的物质）这种设计是为了提 高样品和金标粒子在膜带上的流速。

然而采用在蛋白液或溶液中浸泡后对膜的封闭也有可能洗掉任 何化学试剂，这些掺入进去的化学试剂是厂家让膜不至于變得完全干燥和疏水 性因此，在干燥的状态下这种封闭作用可能会让膜具有更强的疏水性因此甚 至能在捕捉抗体带引起更为普遍的背景染色或假阳性信号。

采用过量的蛋白或活性剂进行封闭的方式都能够在样品流动过程中产生高 粘性因此可能降低样品清除率。用不恰當的反应液进行封闭也会改变捕捉抗体 的特性通过电荷作用力、疏水作用力或氢—硫作用力的提高会使其更具有粘附 性。封闭膜应当进京用于下面所述的理由例如当需要提高样品或胶体金颗粒的 流动性，和仅仅需要最低的反应物浓度

一些保护剂，不论在捕捉抗体中的、标记抗体中的或者是样品中的都能产生 假阳性结果硫柳汞（含硫和汞的化合物）和赖氨酸（一般在 pH<10.4 下带有大 量的正电荷）在检测中是特别要注意的问题。

样品的问题：许多样品中含有可能与金标粒子或捕捉抗体发生非特异性结 合的物质并且产生非特异性结果。举例来說一些含有细菌的样品，而样品中 的细菌可能被部分破坏成细胞碎片并且这些细菌是非常疏水的。这些疏水的细 菌碎片也可能与捕捉忼体和金标粒子发生交叉反应

其它的一些样品可能含有高水平的硫或 SH 基团，或者具有高正电荷此外，一些样品可能含有大量的分子或細胞分子这有可能阻塞膜并且对检测带上的金 标液的流动产生干扰。

图 3 系统诊断假阳性信号的流程图

样品可能在酸性条件下变化非常大例如，尿液样品最初的 pH 值是在 4~7 之间然而随着细菌含量的增加，样品的 pH 值也随之降低酸性样品在流动过 程中在捕捉抗体表面产生正电荷，反过来这将引起与带有负电荷的金标粒子发生 非特异性反应

如果样品含有大量的酸性物质或者带有大量的正电荷蛋白质，它们在到達捕 捉抗体区之前可能与金标粒子非特异性结合这不仅能掩盖待测物与金标的结合 信号（因此产生降低特异性信号效果），也能增加与茬膜上和捕捉抗体带上成簇 物质的结合物

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