小鼠结肠平滑肌细胞分离自结肠組织结肠在右髂窝内续于盲肠，在第3骶椎平面连接直肠结肠分升结肠、横结肠、

降结肠和乙状结肠4部分，大部分固定于腹后壁结肠嘚排列酷似英文字母"M" , 将小肠包围在内。结肠横切面由内到外

依次为黏膜（ 上皮层、固有层、黏膜肌层）黏膜下层（疏松结缔组织） ， 肌層（内环形、外纵行两层平滑肌）外膜

（ 纤维膜或浆膜）。结肠平滑肌细胞主要分布于黏膜肌层和肌层的内环形、外纵行平滑肌结肠運动少而缓慢，对剌激的

反应也较迟缓结肠平滑肌在食物消化与吸收、肠道运动和物质分泌、诱发全身炎症反应以及细胞内信号转导途徑等研究

中起着重要的作用。结肠平滑肌细胞原代分离培养3天后可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不— 呈梭形、不规则形、三

角形或扇形， 核卵圆形、居中 2周后细胞汇合， 多数细胞伸展呈长梭形 胞浆丰富， 有分枝状突起细胞平行排列成单层

或部分区域多层重叠生長， 高低起伏；细胞密度低时 常交织成网状，密度志时则排列为旋涡状或棚栏状。传代后细胞

生长较快 4-6天即可汇合，并保持上述形態学特征和生长特点结肠平滑肌运动活性受到神经递质、胃肠激素和药物等因

素的调节。随着现代胃肠动力学研究的进展对胃肠运动嘚研究已从器官、组织水平发展到细胞、分子水平， 要求在胃肠

道单个平滑肌细胞标本上来完成各种电生理、药理和分子生物学等实验體外培养细胞， 由于影响因素单— 是研究细胞

功能以及相应的细胞信号转导机制的基础。

1) 收到非红系有核细胞后请检查是否漏液 ，如果漏液请拍照片发给我们。
2) 请先在显微镜下确认细胞生长 状态去掉封口膜并将T25瓶置于37℃培养约2-3h。
3) 弃去T25瓶中的培养基添加 6ml本公司附带的完全培养基。
4) 如果细胞密度达80%-90%请及 时进行细胞传代传代培养用6ml本公司附带的完全培养基。
5) 接到细胞次ㄖ请检查细胞是 否污染，若发现污染或疑似污染请及时与我们取得联系。

小鼠结肠平滑肌细胞培养操作

1）复苏细胞：将含有细胞悬液嘚冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻加 入 4mL 培养基混合均 匀。在 1000RPM 条件下离心 4 分钟弃去上清液，补 加 1-2mL 培养基后吹匀然后将所有细胞悬液加叺培养瓶中培 养过夜（或将 细胞悬液加入 10cm 皿中，加入约 8ml 培养基培养过夜）。第二天换液并 2）细胞传代：如果细胞密度达 80%-90%即可进行传代培养。 

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人的消化器官由长约8-10m的消化道及與其相连的许多大、小消化腺组成消化器官的主要生理功能是对食物进行消化和吸收，从而为机体新陈代谢提供了必不可少的物质和能量来源

消化是食物在消化道内被分解为小分子的过程。消化的方式有两种一种是通过消化道肌肉的舒缩活动，将食物磨粹并使之与消化液充分混合，以及将食物不断地向消化道的远端推送；这种方式称机械消化另一种消化方式是通过消化腺分泌的消化液完成的。消囮液中含在各种消化酶能分别分解蛋白质、脂肪和糖类等物质，使之成为小分子物质（表6-1）；这种消化方式称化学性消化正常情况下，这两种方式的消化作用是同时进行互相配合的。食物经过消化后透过消化道的粘膜，进入血液和淋巴循环的过程称为吸收。消化囷吸收是两个相辅相成、紧密联系的过程不能被消化和吸收的食物残渣，最后以粪的形式排出体外

表6-1 消化液的成分及其作用

一、消化道平滑肌的特性

在整个消化道中，除口、咽、食管上端和肛门外括约肌是骨骼肌外其余部分是都是由平滑肌组荿的。消化道通过这些肌肉的舒缩活动完成对食物的机械性消化，并推动食物的前进；消化道的运动对于食物的化学性消化和吸收也囿促进作用。

（一）消化道平滑肌的一般特性

消化道平滑肌具有肌组织的共同特性如兴奋、自律性、传导性和收缩性，但这些特性的表現均有其自己的特点

1．消化道平滑肌的兴奋较骨骼肌为低。收缩的潜伏期、收缩期和舒张期所占的时间比骨骼肌的长得多而且变异很夶。

2．消化道平滑肌在离体后置于适宜的环境内，仍能进行良好的节律性运动但其收缩很缓慢，节律性远不如心肌规则

3．消化道平滑肌经常保持在一种微弱的持续收缩状态，即具有一定的紧张性消化道各部分，如胃、肠等之所以能保持一定的形状和位置同平滑肌嘚紧张性在重要的关系；紧张性还使消化道的管腔内经常保持着一定的基础压力；平滑肌的各种收缩活动也就是在紧张性基础上发生的。

4．消化道平滑肌能适应实际的需要而作很很大的伸展作为中空的容纳器官来说，这一特性具有重要生理意义它的消化道有可能容纳好幾倍于自己原初体积的食物。

5．消化道平滑肌对电刺激较不敏感但对于牵张、温度和化学刺激则特别敏感，轻微的刺激常可引起强烈的收缩消化道平滑肌的这一特性是与它所处的生理环境分不开的，消化道内容物对平滑肌的牵张、温度和化学刺激是引起内容物推进或排涳的自然刺激因素

（二）消化道平滑肌的电生理特性

消化道平滑肌电活动的形式要比骨骼肌复杂得多，其电生理变化大致可分为三种即静息膜电位、慢波电位和动作电位。

1．静息膜电位消化道平滑肌的静息膜电位很不稳定波动较大，其实测值为-60—-50Mv静息电位主要由K⁺的岼衡电位形成，但Na⁺、CI^-、Ca²⁺以及生电性钠泵活动也参与了静息膜电位的产生

2．慢波电位消化道的平滑肌细胞可产生节律性的自发性去极化；鉯静息膜电位为基础的这种周期性波动，由于其发生频率较慢而被称为慢波电位又称基本电节律（basal electric rhythm,BER）。消化道不部位的慢波频率不同茬人类，胃的慢波频率为3次/min十二指肠为12次/min，回肠末端为8-9次/min慢波的波幅约为10-15mV，持续时间由数秒至十几秒

用细胞内微电极记录时，慢波哆表现为单向波包括初期的快速去极化和缓慢的复极化平台。关于慢波产生的离子基础尚未完全清楚目前认为，它的产生可能与细胞膜上生电性钠泵的活动具有波动性有关当钠泵的活动暂时受抑制时，膜便发生去极化；当钠泵活动恢复时膜的极化加强，膜电位便又囙到原来的水平实验证明，用抑制钠泵的药物哇巴因后胃肠平滑肌的慢波电位消失。

在通常情况下慢波起源于消化道的纵行肌，以電紧张形式扩布到环行肌由于切断支配胃肠的神经，或用药物阻断神经冲动后慢波电位仍然存在，表明它的产生可能是肌源性的慢波本身不引起肌肉收缩，便它可以反映平滑肌兴奋性的周期变化慢波可使静息膜电位接近于产生动作电位的阈电位，一旦达到阈电位膜上的电压依从性离子通道便开放而产生动作电位。

3．动作电位平滑肌的动作电位与神经和骨骼肌的动作电位的区别在于：①锋电位上升慢持续时间长；②平滑肌的动作电位不受钠通道阻断剂的影响，但可被Ca²⁺通道阻断剂所阻断这表明它的产生主要依赖Ca²⁺的内流；③不滑肌動作电位的复极化与骨骼肌相同，都是通过K⁺的外流所不同的是，不滑肌K⁺的外向电流与Ca²⁺的内向电流在时间过程上几乎相同因此，锋电位嘚幅度低而且大小不等。

由于平滑肌动作电位发生时Ca²内流的速度已足以引起平滑肌的收缩因此，锋电位与收缩之间存在很好的相关性每个慢波上所出现锋电位的数目，可作为收缩力大小的指标

慢波、动作电位和肌肉收缩的关系可简要归纳为：平滑肌的收缩是继动作電位之后产生的，而动作电位则是在慢波去极化的基础上发生的因此，慢波电位本身虽不能引起平滑肌的收缩但却被认为是不滑肌的起步电位，是平滑肌收缩节律的控制波它决定蠕动的方向、节律和速度（图6-1）。

图6-1 消化道不滑肌的电活动

下面的曲线为细胞内电极记录嘚基本电节律

在第二和第三个波的支极化期，出现数目不同的动作电位；

上面的曲线为肌肉收缩收缩波只出现在动作电位时，

动作电位数目越多收缩的幅度也越大T：张力 IP：细胞内电位

人每日由各种消化腺分泌的消化液总量达6-8L（表6-1）。消化液主要由有机物、离子和水组荿消化液的主要功能为：①稀释食物，使之与血浆的渗透压相等以利于吸收；②改变消化腔内的pH，使之适应于消化酶活性的需要；③沝解复杂的食物成分使之便于吸收；④通过分泌粘液、抗体和大量液体，保护消化道粘膜防止物理性和化学性的损伤。

分泌过程是由腺细胞主动活动的过程它包括由血液内摄取原料、在细胞内合成分泌物，以及将分泌物由细胞内排出等一连串的复杂活动对消化腺分泌细胞的刺激-分泌耦联的研究表明，腺细胞膜上往往存在着多种受体不同的刺激物与相应的受体结合，可引起细胞内一系列的生化反应最终导致分泌物的释放（图6-2）。

图6-2 胰腺分泌细胞内的两种介导机制

三、胃肠的神经支配及其作用

神经系统对胃肠功能的调节较为复杂咜通过植物性神经和胃肠的内在神经两个系统相互协调统一而完成的（图6-3）。

图6-3 消化系统的局部和中枢性反射通路

胃肠的内在神经是由存茬于食管至肛门的管壁内的两种神经丛组成的一种是位于胃肠壁粘膜下神经丛（Meissner神经丛）；另一种是位于环行肌与纵行肌层之间的肌间鉮经丛（或称Auerbach神经丛）。内在神经丛包含无数的神经元和神经纤维据估计，内在神经丛中约有10⁸个神经元包括感觉神经元、中间神经元囷运动神经元。内在神经丛的神经纤维（包括进入消化管壁的交感和副交感纤维）则把胃肠壁的各种感受器及效应细胞与神经元互相连接起着传递感觉信息、调节运动神经元的活动和启动、维持或抑制效应系统的作用。目前认为消化管壁内的神经丛构成了一个完整的、楿对独立的整合系统，在胃肠活动的调节中具有十分重要的作用

支配胃肠的自主神经被称为外来神经，包括交感神经和副交感神经交感神经从脊髓胸腰段侧角发出，经过腹腔神经节、肠系膜神经节或腥下神经节更换神经元后，节后纤维分布到胃肠各部分主要通过三種途径影响胃肠活动：①终止于内在神经元的肾上腺素能纤维；②分布于某些肌束的肾上腺素能纤维；③分布至血管平滑肌的肾上腺素血管纤维。由交感神经节后纤维释放至内在神经元表面的去甲肾上腺素可抑制神经元的兴奋活动，从而抑制其向前传导的活动这样，由茭感神经发放的冲动可抑制通过内在神经丛或迷走神经传递的反射。

图6－4　胃肠胆碱能、肾上腺素能及肽能神经的支配及作用模式图

I：抑制 E：兴奋 CNS：中枢神经系统

——：胆碱能神经质 ----：肾上腺素能神经　+++肽能神经

副交感神经通过迷走神经和盆神经支配胃肠到达胃肠的纤維都是节前纤维，它们终止于内在神经丛的神经元上内在神经丛的多数副交感纤维是兴奋性胆碱能纤维，少数是抑制性纤维；而在这些抑制性纤维中多数既不是胆碱能，也不是肾上腺素能纤维它们的末梢释放的递质可能是肽类物质，因而被称为肽能神经（图6-4）由肽能神经末梢释放的递质不是单一的肽，而可能是不同的肽如血管活性肽（VIP）、P物质、脑啡肽和生长抑素等。目前认为胃的容受性舒张、机械刺激引起的小肠充血等，均为神经兴奋释放VIP所致VIP能神经的作用主要是舒张平滑肌、舒张血管和加强小肠、胰腺的分泌活动（图6-5）。

图6-5 血管活性肠肽（VIP）能神经支配的设想图

在胃肠的粘膜层内 不仅存在多种外分泌腺体，还含有十种内分泌细胞这些细胞分泌的激素統称为胃肠激素（gastrointestinal hormone）。胃肠激素在化学结构上都是由氨基酸残基组成的肽类分子量大多数在5000以内。

（一）胃肠内分泌细胞的形态及分布

鼡细胞免疫细胞化学的方法已经证明从胃到大肠的粘膜层内，存在有40多种内分泌细胞它们分散地分布在胃肠粘膜的跑非内分泌细胞之間。由于胃肠粘膜的面积巨大胃肠内分泌细胞的总数很大有大，大大地超过了体内所有内分泌腺的总和因此，消化道已不仅仅是人体內的消化器官它也是体内最大最复杂的内分泌器官（表6-2）。

胃肠内分泌细胞在形成上有两个明显的特点一是细胞内的分泌颗粒均分布茬核和基底之间，故属于基底颗粒细胞不同的内分泌细胞的分泌颗粒大小、形状和密度均不同。胃肠内分泌细胞的另一特点是大部分細胞呈锥形，其顶端有绒毛突起伸入胃肠腔内（图6-6），微绒毛可直接感受胃肠内食物成分和pH的一刺激而引起细胞的分泌活动只有少数胃肠内分泌细胞无微绒毛，它们与胃肠腔无直接接触它们的分泌可由神经兴奋或局部内环境的变化而引起，而与胃肠腔内的食物成分无關这两种类型的细胞，前者被称为开放型细胞后者为闭合型细胞。

表6-2 主要胃肠内分泌细胞的名称、分布和分泌产物

图6-6 胃窦粘膜内的G细胞（开放型细胞）示细胞顶端的绒毛

胃肠内分泌细胞在生物化学方面都具有摄取胺前体进行脱羥而产生肽类或活性胺的能力。具有这种能力的细胞统称为APUD(amine precursor uptake and decarboxy-lation)细胞除胃肠和胰腺的内分泌细胞外，神经系统、甲状腺、肾上腺髓质、垂体等组织中也含有APUD细胞

胃肠激素与神经系统一起，共同调节消化器官的运动、分泌和吸收功能此外，胃肠激素对体内其它器官的活动也具有广泛的影响其作用有三个主要方面。

1．调节消化腺的分泌和消化道的运动 这一作用的靶器官包括唾液腺、胃腺、胰腺、肠腺、肝细胞、食管-胃括约肌、胃肠平滑肌及胆囊等三个主要胃肠激素的作用见表6-3及后文。

表6-3 三种胃肠对消化腺分泌和消化管运动地作用

╂：兴奋 ╂╂：强兴奋 —：抑制

2．调节其它激素的释放已经证明食物消化时，从胃肠释放的抑胃肽（gastric inhibitory polypeptide,GIP）有很强的刺激胰岛素分泌的作用因此，ロ服葡萄糖比静脉注射相同剂量的葡萄糖能引起更多的胰岛素分泌。进餐时不仅由于葡萄糖的吸收入血直接作用于胰岛B细胞，促进其汾泌胰岛素而且还可通过抑胃肽及早地把信息传递到胰岛，引起胰岛素较早的分泌；使血糖不至于升得过高而从尿中丢失这对于有效哋保持机体所获得的能源，具有重要的生理意义

影响其它激素释放的胃肠激素还有：生长抑素、胰多肽、血管活性肽等，它们对生长激素、胰岛素、胰高血糖素、胃沁素等的释放均有调节作用

3．营养作用 一些胃肠激素具有刺激消化道组织的代谢和促进生长的作用，称为營养作用（trophic action）例如，胃泌素能刺激胃沁酸部和粘膜和十二指肠粘膜的蛋白质、RNA和DNA的合成从而促进其生长。给动物长期注射五肽胃泌素（一种人工合成的胃泌素含有胃泌素活性的最小片段—羧基端的5个氨基酸片段），可引起壁细胞增生在临床上也观察到，切除胃窦的疒人血清胃泌素水平下降，同时可发生胃粘膜萎缩；相反在患有胃泌素瘤的病人，血清胃泌素水平很高这种病人多有胃粘膜增生、肥厚。此外近年来还发现，小肠粘膜内I细胞释放的胆囊收缩素也具有重要的营养作用它能引起胰腺内DNA、RAN和蛋白质的合成增加，促进胰腺外分泌组织的生长

由胃肠内分泌细胞释放的激素主要是通过血液循环运送到靶细胞起作用的，这些出现在血液中的激素可用放射免疫方法从血液中测定出来。但有一些胃肠激素释放后并不进入血液循环而是通过细胞外注弥散至邻近的靶细胞，这种传递局部信息的方式也称为旁分泌（paracrine）由胃窦部或胰岛内的D细胞释放的生长抑素，很可能是以这种方式发挥其对邻近的胃泌素细胞（G细胞）或胰B细胞的抑淛性调节作用的图6-7是胃肠激素这两种作用方式的模式图。

图6-7 胃肠激素作用的两种主要方式

A：经典的内分泌方式 B和C：旁分泌方式

近年来的研究证实一些产生胃肠道的肽，不仅存在于胃肠道也存在于中枢神经系统内；而原来认为只存在于中枢神经系统的神经肽，也在消化噵中发现这些双重分布的肽被统称为脑-肠肽（braingut peptide）。已知的脑-肠肽有胃泌素、胆囊收缩素、P物质、生长抑素、神经降压素等约20余种这些肽类双重分布的生理意义已引起人们的重视，例如胆囊收缩素在外周对胰酶分泌和胆汁排放的调节作用及其在中枢对摄食的抑制作用提礻脑内及胃肠内的胆囊收缩素在消化和吸收中具有协调作用。