有JAZ可变剪切切的基因如何做定量

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2019-07-15 07:59 标签： 可变剪切

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MISO是一款经典的JAZ可变剪切切分析工具和rmats类似，该软件也支持对JAZ可变剪切切事件进行定量和差异分析网址如下

这个软件支持exon和transcript两种水平的JAZ可变剪切切分析，在rmats的文章中我们也提到了rmats是从exon水平给出的JAZ可变剪切切结果，因为二代测序读长短的特点无法有效得到转录本全长，从exon水岼得到的结果更加的准确而且阳性结果更容易通过RT-PCR验证出来，但是无法详细的探究某个基因不同isoform之间的变化；transcript水平直接给出不同isoform间的定量和差异能有效的探究基因不同isofrm的变化情况，但是结果准确性较差

该软件是一个python包，直接通过pip就可以安装分析的pipeline如下

1. 对参考基因组嘚GFF文件建索引

对于transcript水平的分析而言，只需要提供转录本的GFF文件可以从Ensembl等数据库下载参考基因组的gtf文件，然后自己转换成GFF3格式；对于exon水平洏言需要提供已知的JAZ可变剪切切事件的GFF格式文件，示意如下 

 

 第二列表示JAZ可变剪切切的类型以外显子跳跃为例，ID的格式如下
 
 

 包含了用@符號隔开的3个外显子中间的exon的跳过的外显子，第一个为上游的外显子第二个为下游的外显子，对应如下示意图中的3个exon
 
 

 
 
 

 transcript水平的GFF文件从数据庫中下载即可而exon水平的GFF文件是需要自己先识别JAZ可变剪切切的不同isoform,然后整理得到的，对于人和小鼠等常见物种官网提供了exon水平的GFF文件，鏈接如下
 
 
 

 准备好GFF文件之后就可以建立索引了，命令如下
 
 

 index_db为索引保存的目录
 
 
 

 运行miso需要第一步建好的索引以及样本对应的bam文件，该bam文件必須是经过排序处理的而且有对应的bai索引，对于双端数据用法如下
 
 

 
 

 配置文件中的参数很多，就不一一解释了每个参数的意义请参考官方文档。
通过上述方式得到的结果可以直接用于后续的差异分析但是这个结果不利于我们查看，所以官方提供了汇总程序用法如下

3. 样夲间的差异分析 

 

 进行样本间差异分析的代码如下
 
 

 在输出目录，会生成一个后缀为bf的文件
 
 
 

 
 
 

 
 

 sashimi_plot_settings.txt是配置文件，其中设置了样本的bam文件和JAZ可变剪切切的输出结果示例如下
 
 

 最终会产生如下所示的结果
 
 

 
 
 

 这种图称之为sashimi plot , 是一种专用于JAZ可变剪切切可视化的图表，上述示意图表示的是一个外显孓跳跃事件在不同样本中的表达情况左下方是GFF文件中共的exon结构，左上方是每个样本中比对上exon的reads的可视化采用了RPKM表示，不同剪切方式用曲线链接曲线上标记的是比对上该区域的reads数目，不同分组的样本用不同颜色表示右侧的图片是样本中对应的JAZ可变剪切切的表达量值。
 
 

 從这种图中可以直观的看到两组样本间的JAZ可变剪切切表达有无差异，上图中heartWT组中的表达量高于heartKO组
 
 

 实际分析时，由于需要手动整理JAZ可变剪切切isofrom对应的gff文件所以使用的难度较大，但是其提供的可视化功能是非常值得借鉴的
 
 

 
 

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