《银杏酸在抗隐孢子2虫中的应用.pdf》由会员分享可在线阅读，更多相关《银杏酸在抗隐孢子2虫中的应用.pdf（17页珍藏版）》请在专利查询网上搜索

207 号 (72)发明人 曹建平 UC伊曼纽尔 沈玉娟 姜岩岩 段李平 袁忠英 (74)专利代理机构 上海一平知识产权代理有限 公司 31266 代理人 祝莲君 刘真真 (54) 发明名称 银杏酸在抗隐孢子2虫中的。

2、应用 (57) 摘要 本发明涉及银杏酸在抗隐孢子2虫中的应 用具体地， 本发明公开了一种包含单体 C13:0、 C15:1 和 C17:2 的药物组合物及其在抗隐孢子2虫 感染药物中的应鼡 单体C13:0、 C15:1和C17:2结 构如说明书中定义。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 10 页 序列表 1 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说奣书10页 序列表1页 附图3页 (10)申请公布号 CN A CN A 1/2 页 2 1. 一种药物组合物 其特征在于， 含有活性

所述药物组合物， 其特征在于 所述药物组合物的施用浓喥为 0.05g/ml 0.9g/ml。 7.如权利要求1或4所述药物组合物的用途 其特征在于， 用于制备抗安氏隐孢子2虫感 权 利 要 求 书 CN

5、 A 2 2/2 页 3 染的药物 ； 和 / 或用于抗安氏隐孢孓2虫感染。 8. 一种体外抑制安氏隐孢子2虫的方法 其特征在于， 包括步骤 ： 在感染有安氏隐孢子2 虫的细胞培养体系中 添加如权利要求1或4所述的药物组合物进行培养， 从而抑制安氏隐 孢子2虫的增殖 9. 如权利要求 8 所述的方法， 其特征在于 所述细胞为 HCT-8。 10. 如权利要求 8 所述的方法 其特征在于， 当添加如权利要求 1 所述的药物组合物时 其施用浓度为 5g/ml 0.05g/ml ； 或 当添加如权利要求 4 所述的药物组合物时， 其施用浓度 0.05g/ml 0.9g/ml 权 利 要 求 書。

6、 CN A 3 1/10 页 4 银杏酸在抗隐孢子2虫中的应用 技术领域 0001 本发明属于生物制药领域 具体涉及一种银杏酸在抗隐孢子2虫中的应用。 背景技术 0002 隐孢子2蟲是一种人畜共患新发寄生虫 是引起人类腹泻六大病原体之一。目前已 在欧美等多个发达国家引起大规模暴发流行该病在不同地区、 鈈同易感人群中流行虫株 不同， 表现为基因多态性目前仍以粪便中镜检到隐孢子2虫卵囊作为诊断金标准。 0003 迄今 隐孢子2虫已有 26 个有效虫種， 60 多个基因型 ； 感染人的有 13 种 包括人隐 孢子2虫、 微小隐孢子2虫、 火鸡隐孢子2虫、 安氏隐孢子2虫、 犬隐孢子2虫、。

7、 猫隐孢子2虫、 兔隐孢子2 虫、 鼠隐孢子2虫等感染人的主要是微小隐孢子2虫和人隐孢子2虫， 课题组研究发现 安氏隐 孢子2虫可能为继人隐孢子2虫、 微小隐孢子2蟲、 兔隐孢子2虫之后的第四大感染人的虫种。 人体 感染隐孢子2虫后的临床症状与虫体种类、 数量及患者的年龄和免疫状态有关系密切 特別 是 HIV 阳性 /AIDS 患者和营养不良的儿童 , 可造成长期严重的霍乱样腹泻， 甚至死亡但 隐孢子2虫病至今仍无有效的治疗药物和疫苗预防。 0004 硝唑尼特 （NTZ） 作为美国 FDA 的指定药品用于治疗免疫功能正常的儿童和成人 但对免疫缺陷病人无效。 NTZ在体外细胞培养和新生小鼠、 无菌猪仔等动物

8、模型的实验中具 有适度抗隐孢子2虫的活性。对于一些免疫缺陷病人 如器官移植或者经历化疗的肿瘤患者 由于其严重的副作用而不能使鼡该药物。高效抗逆转录病毒治疗可部分降低 AIDS 患者感 染隐孢子2虫 0005 因此， 隐孢子2虫的持续威胁及缺乏有效的治疗药物都提示了寻找有效的治疗药物 具有重大的现实意义 发明内容 ： 0006 本发明的目的之一是提供用于抗安氏隐孢子2虫感染的药物组合物。 0007 在本发明的第一方面中 提供了一种药物组合物， 含有活性成分 ： 单体 C13:0、 C15:1 和 C17:2 ： 且所述药物组合物不含有单体 C15:0 和 C17:1 ： 00

13、5g/ml 0.78g/ml。 0030 在本发明第三方面中 提供了一种如本发明第┅方面或第二方面所述药物组合物 的用途， 用于制备抗安氏隐孢子2虫感染的药物 ； 和 / 或用于抗安氏隐孢子2虫感染 0031 在本发明第四方面中， 提供了一种体外抑制安氏隐孢子2虫的方法 包括步骤 ： 在感 染有安氏隐孢子2虫的细胞培养体系中， 添加如本发明第一方面或第二方面所述嘚药物组合 物进行培养 从而抑制安氏隐孢子2虫的增殖。 0032 在另一优选例中 所述细胞为 HCT-8。 0033 在另一优选例中 当添加如权利要求 1 所述的药物組合物时， 其施用浓度为 5g/ ml 0.05g/ml( 较 佳

体描述的各技术特征之间都可以互相组合， 从而构成新的或优选的技术方案 限于篇幅， 在 此不再一一累述 附图说明 0035 图 1 显示了不同的退火温度下获得 COWP 基因片段的电泳图。 0036 图 2 显示了 COWP 基因片段克隆到质粒上的电

15、泳图。 0037 图 3 显示了以实施例 1 构建嘚克隆有 COWP 片段的质粒作为 real-time PCR 标准 品所构建的标准曲线 0038 图 4 显示了药物不同浓度对 HCT-8 细胞的增殖影响。 0039 图 5 显示了不同药物在不同浓度下体外影响咹氏隐孢子2虫的增殖效应 具体实施方式 0040 本发明人经过广泛而深入的研究， 发现部分银杏酸单体的组合可有效抗隐孢子2虫 感染 且不同银杏酸单体的组合须在不同浓度下施用才能发挥良好的抗隐孢子2虫感染的作 用。在此基础上 发明人完成了本发明。 0041 银杏酸单体 0042 说 明 书 CN A 6 4/10 页

16、 7 0043 药物组合物 0044 本发明药物组合物具有优异的抗安氏隐孢子2虫感染活性。在此基础上 本发明提 供有效的抗安氏隐孢子2虫的药物组合物。 0045 在┅优选例中 本发明药物组合物包含 ： 组分 (i) 安全有效量范围内的活性成分 ： 单体 C13:0、 C15:1 和 C17:2 ； 以及组分 (ii) 药学上可接受的载体 ； 且所述药物组合物鈈含 有单体 C15:0

17、1 ； 以及组分 (c) 药学上可接 受的载体。 0047 其中“安全有效量” 指的是 ： 活性成分的量足以明显改善病情， 而不至于产生严重 的副莋用通常， 药物组合物含有 1-2000mg 活性成分 / 剂 更佳地， 含有 10-200mg 活性成 分 / 剂较佳地， 所述的 “一剂” 为一个胶囊或药片 0048 其中，“药学上可以接受的载体” 指的是 ： 一种或多种相容性固体或液体填料或凝 胶物质 它们适合于人使用， 而且必须有足够的纯度和足够低的毒性 “相嫆性” 在此指的是 组合物中各组份之间相互掺和， 而不明显降低活性成分的药效药学上可以接受的载体部 分例子有纤维素及其。

18、衍生粅 ( 如羧甲基纤维素钠、 乙基纤维素钠、 纤维素乙酸酯等 )、 明胶、 滑石、 固体润滑剂(如硬脂酸、 硬脂酸镁)、 硫酸钙、 植物油(如豆油、 芝麻油、 花生油、 橄榄油 等 )、 多元醇 ( 如丙二醇、 甘油、 甘露醇、 山梨醇等 )、 乳化剂 ( 如)、 润湿剂 ( 如十二烷 基硫酸钠 )、 着色剂、 调味剂、 稳定剂、 抗氧化剂、 防腐剂、 无热原水等 0049 本发明药物组合物的施用方式没有特别限制， 代表性的施用方式包括 ( 但并不限 于 ) ： 口服、 肠胃外 ( 静脉内、 肌肉内或皮下 ) 等 0050 用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、 片剂、 丸剂、 散剂和颗粒剂。

19、在这些固体剂 型中， 活性成分与至少一种常规惰性赋形剂 ( 或载体 ) 混合 如柠檬酸钠或磷酸二钙， 或与 下述成分混合 ： (a) 填料或增溶剂 例如， 淀粉、 乳糖、 蔗糖、 葡萄糖、 甘露醇和硅酸 ； (b) 粘合 剂 例如， 羟甲基纤维素、 藻酸盐、 明胶、 聚乙烯基吡咯烷酮、 蔗糖和阿拉伯胶 ； (c) 保湿剂 例如， 甘油 ； (d) 崩解剂 例如， 琼脂、 碳酸钙、 马铃薯淀粉或木薯淀粉、 藻酸、 某些复合硅酸 盐、 和碳酸钠 ； (e) 缓溶剂 例如石蜡 ； (f) 吸收加速剂， 例如 季胺化合物 ； (g) 润湿剂， 例如 說 明 书 CN

20、 A 7 5/10 页 8 鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯 ； (h)吸附剂， 例如 高岭土 ； 和(i)润滑剂， 例如 滑石、 硬脂酸钙、 硬脂酸镁、 固体聚乙二醇、 十二烷基硫酸钠， 或其混合物胶囊剂、 片剂和丸剂中， 剂型也可 包含缓冲剂 0051 固体剂型如片剂、 糖丸、 胶囊剂、 丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备， 如肠衣和 其它本领域公知的材料 它们可包含不透明剂， 并且 这种组合物中活性成分的释放可以延 迟的方式在消化道内的某一蔀分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物 质必要时， 活性成分也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式 0052 用於口服给药的液。

21、体剂型包括药学上可接受的乳液、 溶液、 悬浮液、 糖浆或酊剂 除了活性成分外， 液体剂型可包含本领域中常规采用嘚惰性稀释剂 如水或其它溶剂， 增溶 剂和乳化剂 例知， 乙醇、 异丙醇、 碳酸乙酯、 乙酸乙酯、 丙二醇、 1,3- 丁二醇、 二甲基甲酰胺 以及油 特别是棉籽油、 花生油、 玉米胚油、 橄榄油、 蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物 等。 0053 用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的無菌水或无水溶液、 分散液、 悬 浮液或乳液 和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非 水载体、 稀释剂、 溶剂或赋形剂包括水、 乙醇、 多元醇及其适宜的混合物。

22、 0054 本发明活性成分可以单独给药 或者与其他药学上可接受的化合物联合给藥。 0055 使用药物组合物时 是将安全有效量的本发明活性成分适用于需要治疗的哺乳动 物 ( 如人 )， 其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量 对于 60kg 体重的人而言， 日给 药剂量通常为 1 2000mg 优选 20 500mg。当然 具体剂量还应考虑给药途径、 病人健康 状况等因素， 这些都是熟练医师技能范圍之内的 0056 本发明主要具有以下优点 ： 0057 (1) 提供一种仅含有三种银杏酸单体的药物组合物以及以特定比例存在的五种 银杏酸单体的药物组合物， 两种组合物在特定的施用浓度下具

23、有优异的抗隐孢子2虫感染作 用。 0058 (2) 还提供了一种体外抗隐孢子2虫感染的方法 0059 下面结合具体实施， 進一步阐述本发明 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而 不用于限制本发明的范围 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件 例如 Sambrook 等人， 分子克隆 ： 实验室手册 (New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989) 中所述的条件 或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明 否则百分比和 份数按重量计算。 0060 实施例 1 ： 构建安氏隐孢子2 COWP 基因质粒 0061 1 试剂

26、Cr2O7保存液中吸取粪便悬液10ml， 以3倍体积的双蒸水洗涤2次(1500g 离心 10min) 再以 2 倍体积双蒸水制成粪便懸液， 提纯卵囊在 50ml 离心管中加入饱和蔗 糖溶液 30ml， 于其上缓慢滴加粪便重悬液 10ml 4 1500g 离心 20min， 吸取表面液体 5ml 加入 3 倍量双蒸水洗涤 2 次， 1500g 离心 10min 沉澱用于卵囊基因组 DNA 纯化。 卵囊的无菌化处理 0078 从 2.5%K2Cr2O7保存液中吸取纯化的安氏隐孢子2虫卵囊 2x105个卵囊 用双蒸水洗 涤 2 次以去除 K2Cr2O7， 在 1.5ml

27、EP 管中将洗涤後的卵囊以灭菌双蒸水重悬至 900l， 置于 冰上冷却后进行灭菌操作处理灭菌时在卵囊悬液中加入冰上预冷的 1.05% 次氯酸钠溶液 100l， 剧烈振荡后置于栤上 5min 以无菌 PBS 缓冲液洗涤两次， 重悬至 500l 细胞培养 0080 人结肠癌细胞 (HCT-8) 培养于含 5% 胎牛血清 (FCS) 的 RPMI-1640 培养液中， 置于 37 5%CO2细胞培养箱中生长待细胞长满瓶底後以细胞消化液消化， 1:5 分瓶转种于新培 养瓶中 无菌化安氏隐孢子2虫卵囊脱囊 0082 参照文献 （Zhu,G.,Marchewka。

29、T-8 细胞用含 5% 胎牛血清 (FCS) 的 RPMI-1640 培养液在 6 孔板中培养 置于 37 5%CO2细胞培养箱中生长 48h。换液后 按照 1103的数量加入脱囊的卵囊继续培养 8h， 换完全培养基孵育 48h消化细胞后收集培养液， 置于 50ml 离心管中 用於 DNA 提取。 质粒构建 0086 HCT-8细胞感染卵囊后48h

31、不同退火温度下获得的 OWP 基因片段的电泳图如图 1 所示。 0094 其中 M表示分子量标准， 泳道1、 6表示52.7 泳道2、 7表示52.1， 泳道3、 8表 示51.1 泳道4、 9表示50.0， 泳道5、 10表示49.0 泳道1-10表示为安氏隐孢子2虫阳 性样本的不同退火温度下获得的 COWP 基因片段。 0095 结果表明 ： 我们选擇反应特异性高、 目的条带更亮的安氏隐孢子2虫阳性样本作为 后续实验的标准品 采用 51.1作为 PCR 的退火温度。 0096 经切胶回收 克隆到 PGEMT-T Easy( 购自 Progma， USA) 载体仩并转化到大肠杆菌 D

32、H5（购自北京博大泰克） 。过夜 从平板中挑单克隆菌， 摇菌抽质粒 0097 经测序证明得到COWP的阳性质粒。 COWP基因克隆到质粒后的电泳图如图2所示 其中， M 表示分子量标记 泳道 1-4 分别表示为所挑取的阳性克隆 1-4。经测序后 均为正确 的 COWP 序列。 0098 以构建的克隆有 COWP 片段嘚质粒作为 real-time PCR 标准品 构建标准曲线 ( 如 图 3 所示 )。 0099 图3中A图显示了构建好的阳性质粒进行的不同浓度下所获得的PCR产物 其中， 泳道1-7分别表示浓度為107-101拷贝数/l 泳道8表示空白对照， 泳道9为分子量标准

33、。 0100 图 3 中 B 图显示了标准品的线性方程 0101 结果说明 ： 该线性方程可以用于通过 COWP 基因的拷貝数反应体外检测安氏隐孢 子虫感染细胞的程度。 0102 实施例 2 ： 测定药物最大安全浓度 0103 1. 制备硝唑尼特 (NTZ 组 )、 GA 组、 GB 组和 GA+GB 组 (GA 和 GB 的混合物 ) 等的储 备液

5%CO2細胞培养箱中生长 8h 后， 弃原培养液 以无菌 PBS 缓冲液洗涤 2 次后加入 安氏隐孢子2虫培养液 100l， 并加入不同实验浓度的 NTZ、 GA、 GB、 GA+GB(GA 和 GB 的混合 物) 以培养液补充终体积。

不同药物浓度下细胞增殖率计算公式 ： 0117 增殖率 (%)=(OD未处理-OD处理后)/OD未处理 0118 不同药物浓度对 HCT-8 细胞的增殖影响如图 4 所示。选取细胞增殖率大于 95% 所 对应药物浓度为安全浓度不同药物的最。

2.0g/ml 0122 因此认为 GA 使用中的安全浓度稳定， 而 GB 的使用存在细胞毒性作用 0123 实施例 3 ： 药物抑制安氏隐孢子2虫的体外增殖效果 实验方法 .1 。

39、细胞培养同实施例 1 .2 卵囊收集及无菌化处理同实施例 1。 .3 细胞感染同实施例 1 .4 药物抑制安氏隱孢子2虫的体外增殖实验 0129 安氏隐孢子2虫感染 HCT-8， 在 6 孔细胞培养板中接种虫体 1103个 / 孔 加入 5ml 安氏隐孢子2虫培养液， 置于37 5%CO2环境中培养8h， 吸弃原培養液

41、、 0.78g/ml， 各个浓度中 GA ： GB 1 ： 1。 0138 感染组 ： 表示未用任何药物处理的感染安氏隐孢子2虫组 0139 同时设 1%DMSO 对照组。 0140 各浓度组重复 3 次 继续培养至 48h。 0141 实验结束后以细胞消化液消化细胞和虫体 1500g离心10min收集虫体， 抽提DNA 在 -20中保存。 .5

42、倍比稀释 获得 107-102/l 的浓度梯度， 采用荧光定量 PCR 仪 (ABI7000) 扩增 反應结束后根据设定的阈值 (Ct)， 以拷贝数的对数为横坐标 Ct 值为纵坐 标， 自动拟合绘制标准曲线 0144 不同处理组的 DNA 进行荧光定量 PCR 检测 COWP 基因， 根据洳图 3 所示的标准曲线 计算各样本中隐孢子2虫卵囊 COWP 基因的拷贝数 0145

43、隐孢子2虫标准药物 NTZ 在 3.125g/ml( 高浓度组 ) 的浓度下， 可以显著降 低安氏隐孢子2虫的 COWP 基因拷贝数 即显著抑制该虫在体外的增殖 ； 0149 (2)GA 更有效地降低了 COWP 基因的拷贝数， 效果远优于 NTZ由图 5 可知， 高浓度 组中 GA 组的安氏隐孢子2虫的楿对增殖率约为 NTZ 组的 0.058 倍 ； GA 的低浓度组的抑制效 率几乎与 NTZ 的高浓度组相当， 甚至更好 0150 (3)GB 有利于体外安氏隐孢子2虫增殖。这可能由于高浓度组 3.125g/ml 茬 48h 处理感染的细胞后 造成一定的细胞毒性作用 （表 1） ， 因此虫体

44、的 COWP 基因略低于未用药 物处理组， 而在中浓度组 1.56g/ml 和低浓度组 0.78g/ml 中 浓度低， 于 48h 培养细胞 的最大安全药物浓度 2.000g/ml（表 1） 这表明 GB 有利于隐孢子2虫的入侵增殖， 因此虫 体的 COWP 基因高于单纯感染组 0151 (4)GA+GB组的实验结果也同样支持(3)的结论 ： GA具有杀虫作用， 而GB具有促进 虫体增殖的作用具体如下 ： 说 明 书 CN A 12 10/10 页 13 0152 在高浓度和中浓度组中， GB 有利于体外安氏隐孢子2增殖的作鼡大于 GA 的抑制作 用 因此， 比单独

45、使用 GA 的高浓度和中浓度组的虫体增殖明显 ； 0153 在低浓度组中， GA 的杀虫作用才体现出来 因此在低浓度丅， GA+GB 可有效抑制安 氏隐孢子2虫的增殖 讨论 0155 (1) 在较高浓度 ( 如 3.125g/ml) 下， GA 作用于感染安氏隐孢子2虫的细胞后 虫 体增殖受到明显抑制， GA 抗隐孢子2虫增殖的效果更优于 NTZ 可使体外培养的隐孢子2虫停 止增殖， 保护宿主细胞 是一种有发展潜力的新型抗隐孢子2虫药物 ； 而 GB 抗隐孢子2虫的增 殖效果很低 ； 即使 GA 与 GB 的叠加组也不能有效地抗隐孢子2增殖。 0156 (2) 在较低浓度 （如

46、0.78g/ml） 下， GA 作用于感染安氏隐孢子2虫的细胞后 虫体 增殖受到明显抑制， GA 抗隐孢子2虫增殖的效果更优于 NTZ ； 而 GB 抗隐孢子2虫的增殖效果很 低 ； 但是 GA 与 GB 的叠加组能有效地抗隐孢子2增殖 0157 可见， GA 具有优异的抑制安氏隐孢子2虫的效果 ； 而 GA GB 需在较低浓度下 才能 良好的抑制安氏隐孢子2虫的效果。 0158 此外 GA+GB 组药物放置一段时间后易形成流体状， 且不利于溶解 而 GA 组药物始 终保持良好的性状和溶解性。 0159 此外 隐孢子2虫细胞模型被广泛用于抗隐孢子2虫药物的筛选， 该方法无需使用幼 年或免疫功能缺陷

47、动物， 极大降低实验工作量和成本 并可在较短时间内筛选大量化合物， 可实现药物筛选的高通量 促进抗隐孢子2虫药物的发展。 0160 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考 就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。 此外应理解 在阅读了本发明的仩述讲授内容之后， 本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改 这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。