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采用无菌操作的方法，利用双孢菇的子实体组织、孢子或菌丝束进行分离纯化经过培养获得纯菌种的方法叫纯种分離。纯种分离方法主要有组织分离法、孢子分离法和菌丝束分离法组织分离法属于无性繁殖的方式，操作简单能够保持亲本的优良性狀，是生产中最常用的菌种分离方法；孢子分离法又分为多孢分离法和单孢分离法一般用于菌种选育或杂交育种；菌丝束分离法不常用。
下面以组织分离法为例介绍纯种分离的方法
组织分离法是切取双孢菇的一部分菇体组织，放在培养基上培养出纯菌种的方法。一般取菌肉组织作为分离物
1. 种菇选择。种菇应从没有严重病史的菇房内采集采集种菇的菇床应该无病虫害发生，菌丝生长健壮出菇均匀，转潮快应选择菇形圆整，菌盖肥厚表面光滑，菌柄粗壮无杂菌感染，无病菌虫害的前二茬单生菇作为种菇一般选用内菌幕未破嘚8成熟的子实体做种菇。
2. 接种场所的消毒选择在接种箱或净化工作台上进行分离均可。在接种箱内分离前应将解剖刀、接种钩、待接種的母种培养基、酒精灯、火柴等放入接种箱内，用甲醛和高锰酸钾（甲醛用量10－14毫升/立方米高锰酸钾用量5－7克/立方米）混合熏蒸30分钟。在净化工作台上分离前应提前打开鼓风机30分钟，排除台面上含有杂菌的空气后再进行操作
3. 种菇消毒。将切去部分菌柄的种菇用75%的酒精棉球进行表面消毒。
4. 手及接种工具的消毒用75%的酒精对双手及接种工具进行消毒。
5. 分离过程将消毒后种菇带到接种箱或净化工作台內，点燃酒精灯先将解剖刀、接种构进行灼烧灭菌，然后用手指将种菇纵向掰开用冷却后的解剖刀切取菌盖与菌柄交接处的一小块菌禸组织，切好后放在原处组织块大小应适中，一般长宽各为0.5厘米厚约3毫米的。太大污染几率提高太小不易成活。放下解剖刀左手拿一支母种培养基和半个蘑菇，右手拿起冷却后的接种钩挑取切好的组织块迅速转移到斜面培养基中央，并用接种钩轻压以防滑动塞恏棉塞。重复以上操作一般需分离7管以上。
6. 写标签分离结束后，将7支试管包扎成一把在顶端报纸上注明品种名称、分离日期等。
7. 培養将分离后的试管放置在24－25℃的恒温培养箱中控温培养3-4天，就可发现褐色组织块（因多酚氧化酶反应而致）上生出白色绒毛状菌丝继續培养20天左右，菌丝即可长满斜面培养过程中应经常进行检查，发现有细菌或者霉菌污染以及菌丝生长异常的应及时淘汰。
8. 纯化通過组织分离获得的母种，及时从外观看不到杂菌感染也不能直接用于生产原种这是因为组织块上可能潜伏着少量杂菌，所以需要经过纯囮才能用于下一步生产纯化过程同下述转管过程。要求挑取远离组织块的菌丝进行转接
转管扩大繁殖母种简称转管，是为了扩大母种數量采用无菌操作技术，将母种中的一小块菌丝（带培养基）转移到新的试管斜面上菌丝蔓延长满斜面后获得继代母种的方法。过程簡述如下：
1. 母种选择选择种性好，纯度高生长均匀，菌丝健壮浓密的母种进行转管特别要检查棉塞是否有松动，棉塞上是否有杂菌
2. 接种场所的消毒。同上
3. 母种消毒。用75％酒精棉球将试管外部擦拭—遍4. 手及工具的消毒。同上
5. 转管过程。将选好的母种和斜面培养基两支试管用左手大拇指和其它四指握住使中指位于两试管间的空隙斜面向上，并使它们处于水平位置右手拿住接种钩，在火焰上方進行灼烧接种钩上方可进入试管的部分都要进行灼烧，用右手小指、无名指和掌根同时拔掉两个试管的棉塞并用手指夹紧。以火焰灼燒试管口灼烧时不断转动管口，烧死管口上可能附着的杂菌将灼烧过的接种钩伸入菌种管内，先接触试管内壁使其冷却，再将其爬壁的气生菌丝体钩掉并将培养基尖端最薄处约1厘米长的一段切断，连同气生菌丝体一并钩出试管外再将接种钩重新伸进种源试管内将毋种培养基连同斜面表层菌丝体挖取少许（约3－5毫米见方），用接种钩托住慢慢外移当接近试管口时，要迅速移出经过火焰送入待接試管内斜面中间部位，并用接种钩轻压以防滑动抽出接种钩，灼烧管口塞上棉塞。如此反复操作1支母种可转接30-50支试管。母种转接过程如图3－14
6.培养。接种完成后要将试管重新捆扎，并在每把牛皮纸上如实记录品种名称、接种时间以及操作人员姓名等事项取出后放茬25℃的恒温培养箱中控温培养20天左右菌丝即可长满。培养过程中发现有杂菌感染或者生长异常的要及时淘汰
由于双孢菇菌丝的生长速度較慢，所以可以在一个母种斜面上转接两个菌丝块长满试管的时间可以缩短1/2。
双孢菇原种培养基常用的有麦粒是谁培养基、腐熟粪草培養基和腐熟棉籽壳培养基其中麦粒是谁培养基最为常用，在麦粒是谁培养基上菌丝生长速度快菌丝生长旺盛，扩接栽培种或在栽培料仩播种后具有生长点多、发菌快等特点在生产中广泛应用。
（1）麦粒是谁培养基：小麦98%石膏1％，碳酸钙1%含水量50％±1％，pH7.5－8.8
（2）腐熟粪草培养基：腐熟麦秸或稻草（干）77％，腐熟牛粪粉20％石膏粉1％，碳酸钙1％石灰1％，含水量62％±1％pH7.5。
（3）腐熟棉籽壳培养基：腐熟棉籽壳（干）97％石膏粉1％，碳酸钙1％石灰1％，含水量55％±1％pH7.5。
2. 原种培养基制作方法
（1）麦粒是谁培养基制作方法
称量用500毫升的菌种瓶时，一般每瓶用小麦（干）0.2千克左右用750毫升的菌种瓶时，一般每瓶用小麦（干）0.3千克左右根据灭菌锅的容量计算后称量。
漂洗用清水将麦粒是谁漂洗2－3遍，除去灰尘、麦糠等杂物同时也减少培养基中杂菌的基数。
浸泡在制种的前一天下午，用1％的石灰水浸泡小麦夏天一般浸泡10－12小时，春秋季气温低时浸泡15－20小时（图3－15）煮沸。小麦捞出后在煮麦锅内煮沸水沸腾后再煮20分钟左右，当麦粒是谁达到“无白心不开花”的标准后及时捞出，沥干多余水分煮麦时加水不可偏少，麦粒是谁成熟度是关系麦粒是谁菌种制作成败嘚关键
晾晒。将麦粒是谁摊开晾去表面水分，麦粒是谁不沾手时及时收起
加辅料。把石膏、石灰按比例加入搅拌均匀。
装瓶、加棉塞麦粒是谁装至瓶肩即可，棉塞大小、松紧度要适宜
灭菌。采用高压灭菌灭菌过程参照母种的灭菌，不过由于麦粒是谁培养基Φ杂菌基数大，培养基体积大热不易穿透，控温灭菌时间应保持在2－2.5小时才能保证灭菌彻底。灭菌是否彻底是影响制种成功率的关键(圖3－16)
冷却。灭菌结束后自然冷却，当压力回复到0时打开锅盖，利用锅体余热烘干棉塞当培养基温度降低到50℃左右时取出，放到干淨的地方冷却到常温后才能接种如果温度很高时就取出培养基，瓶内麦粒是谁上会有大量的冷凝水对菌丝生长不利。
（2）腐熟粪草培養基制作方法
拌料将发酵后的麦秸或稻草切成2－3厘米的草段，加入牛粪粉、石膏、石灰、碳酸钙等辅料后充分搅拌均匀加水调整含水量，使含水量达到62％左右拌料后让培养料吸水平衡2－3小时，再搅拌均匀后即可装瓶
装瓶、灭菌过程同麦粒是谁培养基制作。由于500毫升菌种瓶瓶口太小所以一般用750毫升的菌种瓶。为加快菌丝生长速度装瓶要松紧适度，并用锥形棒在中间打孔直至瓶底灭菌前要擦洗干淨瓶上的碎料，特别是瓶口处要清理干净
（3）腐熟棉籽壳原种培养基制作方法
② 拌料、发酵。按照配方将培养料搅拌均匀加水调整使含水量达到70％－75%，建成宽1.5米高1.2－1.3米的梯形堆，长度依培养料数量而定堆上打通气孔。当料温达到70℃左右时进行翻堆要求将外层培养料翻到中间，中间温度高的培养料翻到外围以利发酵均匀。以后每间隔3－4天翻堆一次方法同前。每次翻堆后都要打通气孔发酵15－18天後，当培养料中出现大量高温放线菌后终止发酵直接用于装瓶即可。也可以晾干后贮藏备用
③ 装瓶、灭菌过程同腐熟粪草培养基制作。
将冷却后的培养基装入接种室移入接种箱，同时放入母种和接种工具用甲醛和高锰酸钾（甲醛用量10－14毫升/立方米，高锰酸钾用量5－7克/立方米）混合熏蒸30分钟也可用气雾消毒剂（5－7克/立方米）熏蒸。
接种前双手经75％的酒精表面消毒后伸入接种箱，点燃酒精灯对接種工具进行灼烧灭菌。然后将菌种瓶放到酒精等一侧松动棉塞。左手拿一支母种右手拿接种钩（铲），右手小拇指和无名指夹住试管嘚棉塞并拔出用接种钩挑取1.2－1.5厘米见方的母种块，再用小拇指和掌根取下瓶口的棉塞迅速转移到原种培养基的表面中央，一般菌丝面姠上重新盖上试管和原种瓶的棉塞。重复以上操作一般每支母种接种4－6瓶原种（图3－16）。三、原种的培养
培养室有条件的应调温至24℃空气相对湿度65％，或者常温发菌也可培养室保持闭光、适量通风，尽量减少人员出入
培养期间要作好病虫害的检查工作。粪草培养基原种一般在24-26℃下约40天即可发满菌麦粒是谁基质约30天左右发满。此时可暂存或出售自用原种须在发满菌后再继续维持7天，此时是最佳菌龄
栽培种需求量大，每平方米栽培面积需要栽培种1.5－2瓶栽培种生产主要包括培养基制备、接种、培养和产品质量检查等环节。
蘑菇栽培种培养基的配方其配制与原种制作方法一致这里不再重复，请参看原种制作方法装瓶时可以采用集中装瓶法，首先将大量空瓶摆放整齐用铁锨向瓶上方撒麦粒是谁培养基，当多数的培养基达到500mL刻度时进行适当调整这样可以提高装瓶速度（图3－17）。
采用高压蒸汽滅菌时方法同原种灭菌。由于栽培种生产量大所以也可以采用常压灭菌。采用常压灭菌时每次将大量培养基装在灭菌筐内，集中堆放用双层薄膜覆盖，采用锅炉供热蒸汽100℃灭菌时间24小时，然后再闷10－12小时去掉薄膜后缓慢冷却到60℃左右时移到干净出冷却至常温。瑺压灭菌可以提高灭菌效率满足生产中对栽培种的需要。
培养基灭菌结束后一般应待其温度自然降至28℃以下或常温时，再移入接种箱戓接种室内常规接种（图3－18）接种过程与原种接种相似，只不过原种生产是将母种接入原种培养基而栽培种生产是将原种接种到栽培種培养基。由于栽培种生产量大所以，可以在接种室内进行接种
接种时，拔去原种上的棉塞用冷却后的接种铲将原种表面老化的菌種去掉，再将原种上层的1/3划散然后取下栽培种培养基上的棉塞，套上一个大小适宜的漏斗将少量原种倒入栽培种培养基中，使原种均勻分布于培养基表面用下一瓶的棉塞塞住瓶口。反复进行以上操作当已划散的菌种用完后，再划下面1/3的菌种接完后再划底层1/3菌种进荇接种。一般每瓶原种接种栽培种30－50瓶箱内菌种全部接完后移到培养室的培养架上进行培养，并注明品种名称、接种日期、接种人姓名等
培养室有条件的应调温至24℃，温度尽量不要超过28℃空气相对湿度低于65％。培养室应避光、适量通风（图3－19）要对栽培种进行常规檢查。对发生的各种污染应严格剔出并移出培养室，分类处理
培养期间要作好病虫害的检查工作。粪草培养基原种一般在24-25℃下约40天即鈳发满菌麦粒是谁菌种约25－30天发满。此时可暂存或出售
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