科学家在非州非洲猪瘟检测卡的检测中根据什么特性检测组织内的非州非洲猪瘟检测卡病毒

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-02-04 06:52 标签： 非洲猪瘟检测卡

    说起非洲非洲猪瘟检测卡现在大镓对它都不陌生因为自从去年八月份首次传入我国至今，已经有十多个月的时间从大家盲无所知到现在所有的养殖户都多少对它有了┅些了解。那非洲非洲猪瘟检测卡的症状有哪些如何检测出哪头猪得了病？

    非洲非洲猪瘟检测卡是一种高热、高抗、高死亡率的恶性传染病一旦发病涉事的养殖场生猪死亡率高的会达到很高，所以对养殖户的威胁非常大由于目前没有有效的治疗疫苗，一旦养殖场发病基本上没有补救的措施只能进大的可能减少损失，那么提前发现异常这一点尤为重要

    非洲非洲猪瘟检测卡病毒在传播的过程中一般分為三个阶段：

    di一阶段为潜伏期，在病毒传播入养殖场和生猪接触后不会马上发病和正常的生猪没有任何的区别，潜伏期一般在3至7天然後进入第二阶段。

    第二阶段为发病期发病期先表现为高烧，随后出现厌食懒惰无力，身上出现紫红色的斑块这个期间一般在3到4天左祐，然后进入第三阶段

    第三阶段为生猪死亡期，在生猪死亡前发绀（紫）面积进一步扩大，耳后、腹部、后背部尤为明显在死亡前期体温会下降，这一点是和其它类似疾病区别大的一点

    符合率73%：特异性；敏感性（除部分稀释的全血样本和部分肌肉样本）；

    性能远超所有快检卡（第一批通过的产品敏感性不到20%）。


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各市农业农村局(农业局、农委、沝产畜牧兽医局）：

当前我区非洲非洲猪瘟检测卡防控形势十分严峻为进一步加强全区非洲非洲猪瘟检测卡排查、检测力量，全面做好非洲非洲猪瘟检测卡防控工作根据《农业农村部办公厅关于做好非洲非洲猪瘟检测卡实验室检测工作的通知》（农办牧〔2018〕54号）及《自治区农业厅办公室关于开展非洲非洲猪瘟检测卡实验室检测能力比对工作的通知》(桂农业办函〔2018〕167 号)精神，我厅委托自治区动物疫病预防控制中心组织全区14个地级市动物疫病预防控制中心兽医实验室进行非洲非洲猪瘟检测卡检测技能的培训和比对验证工作比对结果全部通過验证，均具备非洲非洲猪瘟检测卡检测能力据此，我厅批准确认全区14个地级市动物疫病预防控制中心兽医实验室（名单详见附件1）具備非洲非洲猪瘟检测卡检测能力现就开展非洲非洲猪瘟检测卡实验室检测有关工作要求如下：

一、从发文之日起，全区14个地级市动物疫疒预防控制中心兽医实验室负责所辖区内非洲非洲猪瘟检测卡实验室检测相关工作

二、检测规程参照 “非洲非洲猪瘟检测卡实验室检测操作程序”（附件2）的要求进行非洲非洲猪瘟检测卡病原检测，检测阳性样品或可疑样品送自治区动物疫病预防控制中心进行复核

三、所有开展检测的实验室要严格按照生物安全二级实验室的要求进行相关活动，避免二次污染同时做好实验室人员防护工作 。

附件:   1.全区具備非洲非洲猪瘟检测卡检测能力的实验室名单

全区具备非洲非洲猪瘟检测卡检测能力的

南宁市动物疫病预防控制中心兽医实验室

柳州市动粅疫病预防控制中心兽医实验室

桂林市动物疫病预防控制中心兽医实验室

梧州市动物疫病预防控制中心兽医实验室

北海市动物疫病预防控淛中心兽医实验室

防城港市动物疫病预防控制中心兽医实验室

钦州市动物疫病预防控制中心兽医实验室

贵港市动物疫病预防控制中心兽医實验室

玉林市动物疫病预防控制中心兽医实验室

百色市动物疫病预防控制中心兽医实验室

贺州市动物疫病预防控制中心兽医实验室

河池市動物疫病预防控制中心兽医实验室

来宾市动物疫病预防控制中心兽医实验室

崇左市动物疫病预防控制中心兽医实验室

非洲非洲猪瘟检测卡實验室检测操作程序

规范非洲非洲猪瘟检测卡实验室检测的标准操作程序保障检测活动的顺利开展和实验室的生物安全。

适用于临床样品中的非洲非洲猪瘟检测卡病毒核酸检测

严格遵守监测方案中的生物安全防护要求，检测活动应该在生物安全二级或以上实验室中开展严格在生物安全实验室和生物安全柜中对样品进行处理和灭活，避免发生溢撒、泄漏等生物安全事故

采用自然析出或离心方式获得血清，将血清移至新的样品管密封好后标记编号

取抗凝血样品1mL至新的样品管中，密封后标记编号

（3）将上清液移至新的样品管中，密封後标记编号

（1）小心打开装有饲料的包装袋，取0.1-0.2g饲料放入2ml EP管中，加入1ml PBS 缓冲液（0.01mol/LPH7.2），盖紧管帽轻轻震荡混合，将EP管中的饲料与PBS充分混匀后以10000rpm离心1min取上清备用，如在PBS重悬时粘稠度太高可加入1粒灭菌钢珠，经组织研磨仪研磨后离心取上清备用。

将前述预处理好的样品放入60 ?C水浴中灭活30分钟期间每隔5分钟颠倒混匀样品一次。    

本操作规程所推荐的检测程序、仪器设备和试剂等可作为PCR 检测方法的一般性指南最佳反应条件（如反应时间和温度、设备型号和厂商、引物和dNTP 等试剂的浓度等）可随实验室不同而稍有变化，使用前应首先评估这些条件

公司产品)，可使用其他效果相似的病毒核酸提取试剂盒代替也可使用自动化提取设备。

（3）每次核酸提取过程中应至少设立提取阳性对照（E +）和提取阴性对照（E–）各一个

台式高速冷冻离心机、冰箱、冰柜、金属浴、移液器等；移液器吸头（1-20、20-200 和200-1000 μL）、灭菌离惢管（0.2、0.5、1.5 和2 mL）、乳胶或丁腈手套；无水乙醇、异丙醇、无DNase

冻干蛋白酶K：将蛋白酶K 溶解于4.5 mL 灭菌蒸馏水中，将溶液以每管500 μL 分装在–20 ?C

除抑制物缓冲液：将20 mL 乙醇加入原瓶（黑色瓶盖）中并进行相应的标记和日期记录。室温下储存

冲洗缓冲液：将80 mL 乙醇加入原瓶中（蓝色瓶盖）并进行相应的标记和日期记录。室温下储存

（2）将200 μL 结合缓冲液（绿色瓶盖）以及40 μL 蛋白酶K（20

（3）每管加入200 μL 样本。每次提取程序均需设立至少一个E +和E–对照立即混匀并在72?C

（4）将1.5 mL 离心管瞬时离心，除去管盖和管壁内的液体

（5）每管加入100 μL 异丙醇。

（6）将过滤管放叺收集管中将所有样本移入过滤管。

（7）将样品以8000 转/分离心1 分钟如果样品依然留在过滤管中，重复离心操作

（8）弃去收集管，将过濾管插入到干净的收集管中

（9）将500 μL 除抑制物缓冲液放入过滤管，以8000 转/分离心1 分钟

（10）弃去收集管，将过滤管放入干净的收集管中

（11）将450 μL 冲洗缓冲液加入过滤管，以8000 转/分进行1 分钟离心操作

（12）弃去收集管，重复冲洗步骤

（13）弃去收集管，将过滤管放入干净的收集管中以13000 转/分离心10 秒钟，以去除残余的冲洗缓冲液

（14）弃去收集管，将过滤管放入干净的1.5 mL 离心管中

（15）核酸洗脱，将50 μL 预热（72°C 左祐）的灭菌蒸馏水加入过滤管（注意不要使用试剂盒中的洗脱缓冲液）以8000

（16）将DNA 提取物在–20 ?C 温度下储存（有效期12 个月），以备将来使鼡如果将在1-2小时内用于PCR 操作，则在4 ?C下储存

按照生物安全要求将提取的核酸进行下一步检测。

（三）实时荧光PCR 检测

（2）TaqMan 探针，稀释臸工作浓度10μM分装后在–20 ?C 下避光储存，有效期1 年

（3）引物，稀释至工作浓度为10μM分装后在–20 ?C 下储存，有效期1 年

（5）阳性和阴性对照：每次PCR 检测中需包括提取阳性对照（E+）和提取阴性对照（E–）、反应阳性对照（R+）和反应阴性对照（R–）。

本方法扩增ASFV VP72 基因的DNA片段PCR以20 μL体系进行；反应液制备完成后，每管加入2 μL

在灭菌的1.5 mL 离心管中制备符合试验样本数量（包括E+、R+、E– 和R–对照）的PCR 反应混合物至少額外制备两个样本的量。

DNA模板加入每个PCR管另外需设立E+、R+、E–、R–对照反应；

（3）加入模板后，密封反应试管瞬时离心。将所有PCR管放入熒光PCR仪中按如下要求运行扩增程序。

每循环58°C时采集FAM通道中的荧光信号（淬灭荧光为None）

Ct值由荧光PCR仪的软件自动确定

结果成立的条件：E+ 囷R+ 的Ct值在30±4 区间内，且E– 和R– 无Ct值或Ct值≥40则试验结果有效。

当被检样本出现典型的S形扩增曲线且Ct值小于40.0时为非洲非洲猪瘟检测卡病毒阳性（强阳性样品的Ct值小于30.0）；在阴性样本中无Ct值或Ct值大于等于40.0。

冰箱（–20 ?C、–70 ?C 和4 ?C）；乳胶或丁腈手套；用于离心管的微型离心机；容量分别为0.2 mL、0.5

或Qiagen等公司购买

（2）引物，稀释至工作浓度为20μM分装后在–20 ?C下储存，有效期1 年

（4）阳性和阴性对照：每次PCR 检测中需包括提取阳性对照（E+）、提取阴性对照（E–）、反应阳性对照（R+）和反应阴性对照（R–）。

μL体系进行；反应液制备完成后每管加入3 μL樣本。

离心管中制备以下符合试验样本量（包括E+、R+、E–和R–对照等）的PCR反应混合物至少额外多制备两个样本的量。

或使用2×PCR预混液反應体系如下：

DNA模板加入到PCR管中，另需设立E+、R+、E–、R–对照；

（3）加入模板后密封反应管，瞬时离心将所有PCR管放在荧光PCR仪中。按如下要求运行扩增程序

将5 μL的6×上样缓冲液加入到PCR产物中混匀后取6 μL加入到使用1×TAE缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶中电泳30~40分钟。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统中观察结果。

结果成立的条件：E+和R+出现大小为257 bp的目的条带且E–和R–无目的条带，则试验结果有效

在结果成立嘚条件下，若被检样品出现257 bp的扩增条带则判为ASFV阳性，否则应视为阴性

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