通过内源性荧光直接检测蛋白质嘚展开确定其熔解温度。随着蛋白质的展开和氨基酸的重排色氨酸和酪氨酸的荧光变化表明蛋白质的构象发生变化。内源性荧光是直接观察蛋白质解折叠的方法之一即使在聚集开始后也可以这样检测，这与基于光散射或量热法的方法不同这种检测方式可以对构建体嘚稳定性进行排序或比较不同的配方以获得较有利的条件。在大多数情况下随着蛋白质的展开，荧光强度会发生变化或峰值漂移但这種检测方式也有很多例外，好的方式是对数据进行分析Uncle检测完整的荧光光谱，以确保拥有所需的所有数据并以您需要的所有方式进行汾析。

Uncle通过直接测量内在荧光的展开来确定蛋白质的熔化温度随着蛋白质的展开和氨基酸的重排，色氨酸和酪氨酸的荧光变化表明其构潒也发生变化固有荧光是观察蛋白质解折叠的直接方

图1：Uncle:一站式稳定性分析平台。

法之一即使在聚合开始后也可以这样做，这与基于咣散射或量热法的方法不同 在大多数情况下，随着蛋白质展开荧光强度发生变化或峰值漂移。 但也有例外的时候好的方法是对数据進行系统性分析。Uncle测量完整的荧光光谱以确保拥有需要的所有数据，并以您需要的方式进行分析

2.聚集起始温度（Tagg）

通过在两个不同波長下使用SLS同时检测小颗粒和大颗粒，了解蛋白质在热升温过程中如何以及何时聚集可以对您的构建体或制剂进行排序，找到防止或延迟聚集开始的辅料 由于蛋白质可以展开也可以聚集，因此同时检测Tm和Tagg可以方便确定蛋白何时展开以及导致聚集的原因。 使用不依赖颗粒夶小变化的荧光方法即使在聚集已经开始之后也可以测量Tm。

Tm和Tagg组合检测方法：以多种制剂制备浓度为0.5mg / mL的单克隆抗体将每种样品9μL加载箌Uni管中，并以15-95℃的热升温运行升温速率为0.3℃/分钟。选择荧光强度的BCM模型作为佳分析方法

Tm结果：在制剂1中，抗体经历三个不同的转变甴软件确定发生在57.8℃，71.5℃和88.1℃（图2A）因为蛋白质直到后来才展开，相同抗体在制剂2中显示出热稳定性的改善 该条件下Tm为73.6℃。

Tagg结果：在疍白质一次构像展开之后266nm处的SLS（图2B）显示制剂1中的抗体在67℃下突然发生聚集。在大约78℃时266nm处的信号强度达到最大值并且聚集的蛋白质開始沉淀。相反制剂2中的相同抗体在整个热升温过程中几乎不显示聚集。此结果与SLS在473nm处（未示出）检测的结果相似虽然蛋白质在67°C开始聚集，但在较高温度下Tm2和Tm3仍可通过内源荧光检测到。

1. 用SYPRO荧光染料检测半数变性温度

差示扫描荧光测定法（DSF）是确定熔融温度的经典高通量方法之一蛋白质可与外在染料如SYPRO^?Orange结合使用，当它与未折叠蛋白质的疏水表面结合时会发生热变换。 该应用可用于蛋白质中很少戓没有色氨酸残基的情况或评估浓度非常低的蛋白质稳定性的情况。 与Uncle上的其他所有应用程序一样该软件简化了数据分析，以节省时間

方法：用SYPRO^?Orange配制1 mg / mL的人单克隆抗体。 将9μL样品加载到Uni管中并以15℃至95℃的热升温运行升温速率为0.5℃/分钟，激发波长为473nm Uncle分析软件使用510-680nm之間的曲线下的面积来计算曲线的拐点并分析数据。

结果：通过软件计算抗体在62.5℃和76.3℃下构象发生改变（图3） 当蛋白质折叠时，来自SYPRO^?染料被缓冲液的水性环境淬灭荧光信号的强度很低。 当蛋白质在较高温度下展开时随着疏水区域的暴露，信号显著增加然后在变性蛋皛质的解离和聚集后再次降低。

图3：使用SYPRO?Orange荧光染料检测抗体的热熔解

4.△G（吉布斯自由能变）

强制降解是室温稳定性评估的既定替代品，但热升温方法并不总能区分相似稳定性的条件 对于这些棘手的问题，ΔG值可提供蛋白质稳定性的定量检测它可在正交应力条件下测量。 通过将蛋白质暴露于化学变性剂中并测量其所产生的荧光变化可以计算蛋白构象展开所需的能量。

方法：制备含2至9.2M尿素的32个点的变性曲线其中治疗性抗体的终浓度为864μg/ mL。 将样品在室温孵育过夜确保反应达到平衡。取9μL样品分别加到Unis管中并在25℃检测。

结果：图4显礻抗体在350/330nm处的荧光比值与变性剂浓度的函数关系蛋白质在变性剂浓度4.6M和6.3M下经历两种不同的构象改变。Uncle分析软件使用3-state模型拟合数据计算茬两种构象改变条件下的ΔG值分别为9.89kcal/mol和10.9kcal/ mol。 在室温下反应达到平衡时首次次构象发生改变的变性蛋白质为0.06ppm，样品第二次发生构象改变时变性蛋白质为0.01ppm

等温稳定性是稳定性评估的另一种方法。不是将温度升高以引起熔化转变而是将样品在略低于预期Tm的温度下保持更长时间。 将样品密封在Uni比色管中温度可保持数小时或数天而不会蒸发。选择在荧光和SLS模式下同时检测样品的构象展开和聚集如果想了解分子戓聚集体的大小如何随时间变化，请选择DLS

方法：以PBS（制剂A）和增加不同浓度精氨酸的PBS溶液（制剂B-E）配制终浓度1mg/mL的人抗体。 将每种样品9μL加载到Uni管中并在60℃下孵育36小时该温度低于抗体的解链温度。

结果：图5显示在266nm处的光散射强度随着精氨酸浓度的增加，聚集减少在更長的孵育时间里，差异的幅度更明显

图4：治疗性抗体的变性曲线。通过Uncle 软件采用3-state模型计算表中的数值

图5：在五种不同制剂配方中抗体的等温聚集

热变性恢复可以检测蛋白构象展开的可逆性，或监测温度变化如何影响分子选择一个温度（或几个），并上下升高观察蛋皛质是否可以在选择的制剂中重新折叠。选择荧光SLS模式同时检测蛋白构象展开，重折叠和聚集如果想监测蛋白质的构象随着流体动力學粒径大小和时间的改变，可选择收集DLS数据

方法：用PBS缓冲液制备终浓度5mg/mL的人抗体。将9μL样品加载到Uni管中并在15°C至58°C的温度下运行三次溫度升温，每个温度保持20分钟然后在15°C至70°C温度下进行三次温度升温，每个温度保持20分钟

结果：该图显示了通过在荧光信号的BCM模型下測量蛋白质的解折叠和重折叠，以及473nm处的光散射强度（图6）当蛋白质升温至低于其Tm的温度时，看到的少量构象展开是部分可逆的并且鈈会导致任何聚集体形成。然而当温度升高至70℃时，较大的颗粒不可逆地形成即使样品冷却至15℃，荧光信号仍然很高

7.粒度与多分散性系数

DLS是一种高灵敏度的工具，用于测量溶液中蛋白质和小分子的流体动力学粒径大小 Uncle的灵敏度符合行业高标准，可以在低至0.05mg/mL的浓度下檢测蛋白质的大小 使用DLS可以识别聚集体或杂质的存在，并确认分子是否是期望的大小另外，可以15-95°C之间的任何温度下获得粒径信息

哆分散性是样品不均匀性的衡量标准，如果颗粒尺寸不均匀将检测到较高的多分散性值。 低多分散性值表明颗粒尺寸更均匀Uncle在检测粒徑的同时不使用任何额外的蛋白质或添加任何时间，即可获得有关多分散性的更多信息并可在相同样品上进行其他实验。

方法：将9μL 0.5mg/mL的單克隆抗体加载到Uni管中并在62℃保持16小时，每10分钟测量4次DLS数据每次5秒。 在开始（t = 0）和结束（t = 16小时）时样品的尺寸分布显示在图中（图7）

结果：在运行开始时，抗体在预期大小处有一个峰并且多分散性值低于0.1，表明为单分散性样品 在62℃孵育16小时后，在该制剂的Tm或Tagg温度鉯下存在两个不同（较大）的峰，并且多分散性已增加至高于0.5表明聚集体有显著的增加。

确定或确认生物制剂热稳定性的另一种方法昰用DLS测量蛋白质的流体动力学粒径大小因为蛋白粒径在热应激下会经历构象变化。通过DLS测量粒径的增加是蛋白构象展开的证据然而，茬聚集开始后仅用光散射不能确定真正的熔融温度。 Uncle的多种检测模式可更清晰地了解蛋白质构象的展开和聚集从而可靠地监测蛋白质嘚构象变化。

方法：将9μL0.5mg/ mL的单克隆抗体加载到Uni管中并以40-74℃的热升温运行，升温速率为0.3℃/分钟每次检测都进行两次DLS信号采集，每次采集3秒

结果：温度在70℃之前，总体平均粒径和散射光强度保持恒定；温度在70℃左右两种检测值均显著增加（图8）。这与该制剂中抗体的第②次构象展开相对应

图6：蛋白质在六轮加热和冷却后的热变性恢复。

9．kD：（扩散相互作用系数）

Uncle能确定蛋白质在不同配方中的扩散相互莋用系数以帮助预测其胶体稳定性或聚集的可能性。在结构和制剂配方缩小到更小范围后使用这种非侵入式技术可以验证优化后的条件。另外只需一次实验和几分钟的时间即可以同时获得B₂₂值。

方法：配制不同pH不同缓冲液（乙酸钠，组氨酸或磷酸盐）终浓度15mg/mL的牛血清皛蛋白（BSA）通过光吸收检测蛋白确切的浓度，并且在每个pH条件下进行6次稀释直至2mg / mL。将每种样品取9μL加载到Uni管中每个样品三次重复。采集4次DLS数据每次5秒。 Uncle分析软件使用每个样品测量的流体动力学粒径结合制剂信息，计算扩散系数通过拟合直线的斜率和截距来计算k_D徝。

结果：强阳性的k_D值（如该蛋白质在pH7条件下所见）表明蛋白净排斥相互作用（图9） k_D值随pH降低而降低。在pH 4时负k_D值表明蛋白之间的净吸引相互作用。这与之前在这些条件下对BSA的检测结果*

10.B₂₂：（第二维里系数）

第二维里系数是研究样品中蛋白质分子之间相互作用的既定且有價值的方法。在测量k_D的同时使用完全相同的样本，即可获得独立计算的B₂₂测量结果通过它帮助预测蛋白质在制剂配方中的聚集倾向。正B₂₂徝表示蛋白质分子之间的净排斥力而负B22值表明蛋白质易于自我结合。

方法：在Uni管中测量甲苯散射强度以校准仪器的标准参数。配制不哃pH,不同缓冲液（乙酸钠组氨酸或磷酸盐）终浓度15mg / mL的牛血清白蛋白（BSA）。通过光吸收检测蛋白确切的浓度并在每个pH条件下进行6次稀释，矗至2mg / mL将每种样品取9μL加载到Uni管中，每个样品三次重复采集4次DLS数据，每次5秒 Uncle软件使用每个样本的光散射强度来计算Kc/R值，通过数据拟合線的斜率计算B₂₂

结果：强阳性的B₂₂值（如在该蛋白质的pH7条件下所见）表明净排斥相互作用，这与相同条件下独立测量的k_D值*（图10）同样地，茬pH4时负B₂₂值表明分子之间有相互吸引的作用，因此该条件不是该蛋白质的有利制剂

G₂₂是一种更严格的检测蛋白质的净自身相互作用参数的方法，特别是在高浓度时G₂₂可以确定样品中的蛋白质-溶剂和蛋白质-溶质相互作用。与B₂₂不同阴性G₂₂值表示蛋白质分子之间的净排斥力，而阳性G₂₂表示可能的自结合这节省宝贵的样本和时间，可以对B₂₂数据重新分析以获得在蛋白高浓度时的G₂₂值。

方法：在Uni管中测量甲苯散射强度鉯校准仪器的标准参数。在pH5的40mM乙酸钠缓冲液（含或不含300M NaCl）中制备80mg / mL的α-胰凝乳蛋白酶原通过光吸收测量蛋白浓度，并6次稀释蛋白至20mg / mL将每種样品取9μL加载到Uni管中，每个样品三次重复采集4次DLS数据，每次5秒Uncle软件使用每个样品的光散射强度来计算R₉₀/K值，其与蛋白质的预期分子量┅起使用计算不同条件下蛋白质的G₂₂值

图11：在pH 5的条件下，蛋白质浓度与散射强度的函数关系以及蛋白质高浓度（80mg / mL）时的G₂₂值。

结果：R₉₀/K的强烮上升趋势（如该蛋白质在300M NaCl制剂中的条件所示）表明净吸引相互作用这与在相同条件下高蛋白质浓度时计算的阳性G₂₂值*。不含NaCl的蛋白质制劑在高蛋白质浓度时显示出R₉₀/K的适度增加以及负G₂₂值表明该蛋白质在此条件下不具有自结合的倾向。

Uncle可以比较不同蛋白质的黏度并在制剂開发过程中更早地了解配方成分或赋形剂如何增加或降低溶液的黏度。Uncle需要的样品量比传统的粘度计小因此可以用更少的蛋白质筛选更哆的条件。

方法：对于甘油标准品将1μL的100nm聚苯乙烯微珠和1μL的吐温溶液分别与100μL10种不同浓度的甘油溶液（0至67％（w/w））混合。对于蛋白质樣品以PBS为缓冲液制备浓度范围为1-300mg/mL的BSA溶液，并将每种样品与100nm聚苯乙烯微珠和稀释后的吐温混合不含蛋白质的样品用于标准微珠粒径检测。将每种样品取9μL加载到Uni管中并在23℃进行4次数据检测，每次5秒对于甘油标准品，用PBS替代微珠样品将数据与在Rheosense microVISC上收集的黏度测量值相關联。

甘油结果：使用Uncle和粘度计测定的甘油溶液黏度结果之间存在极好的相关性（图11A）黏度高达14cP。对于每种仪器将三次读数取平均值鉯获得图表上的值，但是每次测量时Uncle仅需要9μL样品而粘度计需要400μL样品。

蛋白质结果：用Uncle测量浓度高达300mg/mL的BSA溶液的黏度黏度值高达4cP，且具有重复性（图11B）对于这种牛顿流体的黏度值与之前报道的通过其他方法获得的值相符。

图12：在Uncle和粘度计（A）上测量的甘油标准品黏度徝的相关性以及由Uncle（B）测量的蛋白质浓度增加时的黏度值。

Uncle结合了三种检测方法可在单一平台上实现更稳定的测量。通过组合各检测方法为研究人员提供了更大的灵活性; 例如，可以通过热熔融和聚集跟踪粒径和多分散性系数 在某些情况下，可以同时获得两组值（例洳k_D和B₂₂）总之，使用一台仪器可以完成12种不同的应用大大降低了蛋白质样品的体积要求，而且避免需要使用几种单一测量仪器来确定稳萣性