酿酒酵母如何构建什么体系IAA合成体系

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-05-27 23:12 标签： 构建什么体系

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repea)系统是细菌和古细菌在长期演化過程中形成的一种适应性免疫防御,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA2012年起第一代CRISPR系统CRISPR/Cas9被改造为基因编辑工具,并衍生出一系列高效、便捷的基洇编辑工具,迅速在基础理论、基因诊断和临床治疗等研究领域中得到广泛应用。然而,CRISPR/Cas9也存在编辑效率较低、细胞毒性、脱靶效应等一些亟待解决的问题,在一定程度上限制了CRISPR/Cas9的应用与CRISPR/Cas9系统相比,第二代基因组编辑系统CRISPR/Cpf1只需要一个crRNA并且Cpf1酶的分子量比标准的Cas9要小,Cpf1复合物识别的PAM为5'T-rich序列,剪切位置离识别位点较远并产生粘性末端,让DNA插入更可控。本研究以酿酒酵母为研究对象,探究了提高酿酒酵母中CRISPR系统编辑效率的技术体系,搭建了适合酿酒酵母的CRISPR/Cpf1编辑系统的技术平台,主要研究结果如下:1.探究目的基因表达及表达量对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响(1)目的基因的表达可提高CRISPR/Cas9系统的编辑效率。以潮霉素基因(Hyg)为研究对象探究了目的基因在质粒上表达与否对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响:将Hyg基因和两端加终止子的Hyg基因分别连接到表达载体pESC-His上,并分别与构建什么体系好的可编辑Hyg基因的pCRCTG418质粒共转化酵母细胞结果表明,CRISPR系统对质粒上表达的Hyg基因进行了编辑而不表达的Hyg基因没有发生编辑;以酿酒酵母Ado1基因为研究对象探究了目的基因在染色体上表达与否对CRISPR/Cas9系统编辑效率的影响:构建什么体系Ado1基因两端加终止子嘚酵母突变株,将可编辑Ado1基因的pCRCTG418质粒分别转化原始菌株及不表达Ado1的突变株。结果表明,CRISPR系统对染色体上表达的Ado1基因进行了编辑而不表达的Ado1基因沒有发生编辑(2)提高目的基因的表达量可提高CRISPR/Cas9系统编辑效率。以SAM1和SAM2基因为研究对象,分别设计针对目的基因的gRNAs组件,通过DR序列串联到pCRCTG418质粒上,可實现对SAM1和SAM2基因的编辑通过控制培养基的成分调控SAM1和SAM2基因的表达量,结果表明,SAM1或SAM2基因表达量高于对方则CRISPR/Cas9系统更倾向于对其进行编辑。2.三方激活因子可提高CRISPR/Cas9系统对目的基因的编辑效率我们将可以特异性提高目的基因表达量的三方激活因子VP64-p65-Rta(VPR)融合到Cas9蛋白的C-末端,分别利用pCRCTG418质粒和pCRCTG418-VPR质粒對酿酒酵母Gal7基因进行编辑,并比较二者的编辑效率,结果表明,CRISPR系统在第4次传代时对Gal7基因进行了编辑,而融合了VPR的CRISPR系统在第2次传代时对Gal7基因进行了編辑,证明了VPR可提高CRISPR/Cas9系统可提高Gal7基因编辑效率,但也需要更多的试验进一步证明三方激活因子的广谱性和适用性。3.建立了适合酿酒酵母的CRISPR/Cpf1编辑系统将pCRCTG418质粒中的Cas9蛋白替换为Cpf1蛋白并进行密码子优化,原DR序列替换为AATTTCTACTCTTGTAGAT,得到了适合酿酒酵母的CRISPR/Cpf1编辑系统pCRCTG418-Cpf1。分别利用pCRCTG418质粒和pCRCTG418-Cpf1质粒对酿酒酵母ADH7基因進行编辑,并比较二者的编辑效率,结果表明,pCRCTG418-Cpf1质粒适用于酿酒酵母,且其编辑效率与pCRCTG418质粒相当该系统的建立拓宽了CRISPR系统在酿酒酵母中进行基因編辑的范围。

【学位授予单位】：河北大学
【学位授予年份】：2018


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