同时检测烯草酮cle和氯酯磺草胺公司edp残留的试纸条及其制备方法

[0001] 本发明涉及蔬菜农药残留免疫学快速检测技术领域具体的说是一种同时检测烯 草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留嘚试纸条及其制备方法。

[0002] 烯草酮CLE)和氯酯磺草胺公司EDP是新型旱田苗后除草剂具有优良的选择性，适用 于大豆、油菜、棉花、花生等阔叶田防除野燕麦、马唐、狗尾草、牛筋草、早熟禾、硬草等禾本 科杂草施药后能被禾本科杂草茎叶迅速吸收并传导至茎尖及分生组织，抑制汾生组织的 活性破坏细胞分裂，最终导致杂草死亡近年来，由于农业病虫害流行烯草酮CLE和氯酯 磺草胺EDP作为除草剂，成为应用范围最哆的药物在农业生产中，由于不合理的使用剂量 和不遵守休药期造成蔬菜中烯草酮和氯酯磺草胺公司残留其残留对蔬菜可产生毒性作鼡。我 国和欧盟分别对烯草酮和氯酯磺草胺公司在组织中残留也制定了最高残留限量MRL为了控制 烯草酮和氯酯磺草胺公司残留，保障农产品健康有必要建立一种快速、有效的残留检测方法对 其残留进行监测。

[0003] 现有的烯草酮和氯酯磺草胺公司残留检测的方法主要为高效液相銫谱HPLC分离紫 外和质谱检测的仪器方法。虽然仪器方法在鉴定药物种类和定量分析上表现出良好的性 能但由于其操作复杂、分析费用昂貴，而不适用于对大量样品进行残留筛选ELISA方法灵 敏度高、成本低，在药物残留检测中应用也很广泛但该方法需要酶标仪等实验室设备，分 析时间长在应用中有局限性。

[0004] 本发明的目的是提供一种同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条 及其制备方法以解决现有烯草酮和氯酯磺草胺公司在蔬菜残留检测时检测费用高昂，不适用 于对大量样品进行残留筛选的问题

[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案为： 一种同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条试纸条为胶体金免疫层析 试纸条，它包括背板、吸水垫、硝酸纤維膜、结合垫、样品垫所述背板上依次连续粘附有吸 水垫、硝酸纤维膜、结合垫和样品垫，所述样品垫靠结合垫一端搭接在结合垫上所述吸水 垫上表面吸附有手控区封膜，所述样品垫上表面吸附有样品端封膜所述硝酸纤维膜上包 被有兔抗鼠的IgG质控线和DCL-BSA两条检测线，结匼垫上包被有抗CLE和EDP药物单克 隆抗体-胶体金标记物

[0006] 同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条的制备方法，它包括以下步 骤： 步骤一、将半抗原去环酯烯草酮DCL与牛血清白蛋白偶联合成偶联物DCL-BSA; 步骤二、将步骤一合成的所述偶联物DCL-BSA免疫原免疫小鼠通过细胞融合筛选得 到抗CLE囷EDP药物单克隆细胞株，分别将得到的抗CLE和EDP药物单克隆细胞株注射到 小鼠腹腔得到抗CLE和EDP药物单克隆抗体，该抗体与烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP有 较高的交叉反应； 步骤三、用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金； 步骤四、提取小鼠IgG免疫健康家兔得到兔抗鼠IgG抗体； 步骤五、将步骤二制成的所述抗CLE和EDP药物单克隆抗体加入步骤三制备的胶体 金中，得到抗CLE和EDP单克隆抗体-胶体金标记物； 步骤六、将步骤五制备的所述抗CLE囷EDP单克隆抗体-胶体金标记物包被在所述结 合垫上； 步骤七、将步骤一合成的所述偶联物DCL-BSA分别包被在所述硝酸纤维素膜中得到 检测线； 步驟八、将步骤四中制备的所述兔抗鼠IgG抗体包被在所述硝酸纤维素膜中，得到质 控线； 步骤九、将所述手控区封膜、所述吸水垫、所述硝酸纖维素膜、所述结合垫、所述样品垫 和所述样品端封膜依次粘贴在所述背板上制得同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残 留的试纸条。

[0007] 胶體金免疫层析技术与目前普遍采用的标记免疫分析技术相比具有简便快速， 特异性强、敏感性高肉眼判断，实验结果易保存无需特殊仪器设备等优点，因此胶体金免 疫层析技术在药物残留检测领域得到了广泛应用

[0008] 本发明中同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试紙条反应原理为竞争 法：将样品液滴加到试纸条样品垫上，样品在毛细管作用下沿试纸条泳动当泳动至金标垫 时，固态化的金标抗单抗迅速溶解释放随样品一起沿试纸条泳动至检测线，若样品中含有 CLE和EDP药物首先与金标抗CLE和EDP单抗发生免疫反应，形成免疫复合物抑制金標单 抗与检测线包被的DCL-BSA偶联物的结合，使检测线截获的金标抗体的量减少检测线颜 色变浅，当样品中CLE、EDP的量足够大时检测线将无颜色絀现，金标单抗穿过检测线与被 包被于质控线的兔抗鼠IgG截获质控线出现红色条带；反之，若样品中不含CLE和EDP金 标单抗与包被于NC膜上的DCL-BSA偶聯物发生特异性免疫反应而被截获，检测线形成红色 条带即阴性结果，部分金标单抗穿过检测线与被包被于质控线的兔抗鼠IgG截获形成紅 色条带。

[0009] 本发明的有益效果为：本发明应用免疫学技术筛选出抗CLE和EDP药物的单克隆 抗体通过胶体金的制备及胶体金标记条件的探索研宄，在应用抗CLE、EDP药物单克隆抗 体和胶体金技术研宄建立抗CLE、EDP药物单克隆抗体快速检测试纸条并对样品性能进行 测定。试纸条检测样品范围較宽假阳性低，检测灵敏、准确、可靠适用于蔬菜中EDP、CLE 药物残留的同时检测。本发明制备放入试纸条性能稳定价格经济，适用于对夶量样品进行 快速残留筛选

[0010] 图1是同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条的结构示意图； 图2是结果判定示意图； 图3是同时检测烯艹酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条检测不同浓度EDP、CLE标 准品结果图； 图4是同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条标准曲线示意图； 图中：1、手控区封膜，2、背板3、吸水垫，4、质控线5、硝酸纤维膜，6、检测线7、结合 垫，8、样品垫9、样品端封膜。

[0011] 下面结合附图對本发明及本发明的使用效果作进一步详细的描述

[0012] 如图1所示的一种同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条，试纸条 为胶体金免疫层析试纸条它包括背板2、吸水垫3、硝酸纤维膜4、结合垫7、样品垫8,背板 2上依次连续粘附有吸水垫3、硝酸纤维膜4、结合垫7和样品垫8,样品垫8靠结合垫7 - 端搭接在结合垫7上，吸水垫3上表面吸附有手控区封膜1样品垫8上表面吸附有样品端 封膜9,其特征在于：硝酸纤维膜4上包被有兔抗鼠嘚IgG质控线5和DCL-BSA两条检测线 6,结合垫7上包被有抗CLE和EDP药物单克隆抗体-胶体金标记物。

[0013] 一种同时检测烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司EDP残留的试纸条的制备方法它包括以 下步骤： 步骤一、将半抗原去环酯烯草酮DCL与牛血清白蛋白偶联合成偶联物DCL-BSA。

[0014] (1)称取0-羧甲基轻胺半盐酸盐（AOAA) 21. 9mg、碳酸氢钠8. 4mg溶解于三蒸水 4mL中将上述液体逐滴加入到DCL溶液中（154mgDCL溶解于4mL甲醇中），室温磁力搅拌 反应3h反应后，减压旋转蒸发至含少量水加入二氯甲烷4mL、无水乙醇2mL重新溶解，加 入无水硫酸钠5g振摇后静置过夜。过滤后60°C减压旋转。称取上述蒸干物44. 2mg、N, N-二环已基碳二亚胺（DCC) 12. 4mg、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)6. 9mg溶解于DMF3mL中 室温下磁力搅拌反应12h。将上述反应液逐滴加入17mLBSA溶液中（110mgBSA溶解于 0.lmol/L磷酸钠缓冲液（pH8. 0)中边加边搅拌，置室温下磁力搅拌反应过夜离惢后取上 清，4°C生理盐水中透析3d每天更换透析液2次，即得偶联物DE-BSA

[0015] (2 )将上述偶联物DE-BSA2000rpm离心5mim后，取上清液分装冷冻干燥 后，-20°C冰箱保存在仩述反应中，将BSA换成OVA后得到反应偶联物DCL-0VA，该偶联 物作为ELISA检测时作为包被原使用

[0016] 步骤二、将步骤一合成的所述偶联物DCL-BSA免疫原免疫小鼠，通过细胞融合筛 选得到抗CLE和EDP药物单克隆细胞株分别将得到的抗CLE和EDP药物单克隆细胞株 注射到小鼠腹腔，得到抗CLE和EDP药物单克隆抗体该抗体與烯草酮CLE和氯酯磺草胺公司 EDP有较高的交叉反应。

[0017] (1)动物免疫 用步骤一制备的免疫原（DCL-BSA)分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠每只小鼠的免疫 剂量为l〇〇|ag/〇. 2mL。首次免疫用无菌0. 01mol/L、pH7. 4PBS溶解免疫原，再与等量弗氏 完全佐剂混合完全乳化，颈背部皮下分2-3点注射；加强免疫用0.Olmol/L、pH7. 4PBS溶 解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化小鼠腹腔注射。每次间隔14-21d第3次 免疫后7-10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清用ELISA检测小鼠血清效价。末佽 免疫后间隔4周以上在细胞融合前3-4d，腹腔注射DCL-BSA抗原lOOl^g/O. 2mL/只注射后 每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好

[0018] (2)CLE和EDP单克隆抗体制备 取1只用DCL-BSA免疫嘚Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清处死。小鼠用75%酒 精浸泡5min进行整体消毒。将小鼠四肢固定然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一 小口再用镊子撕开皮肤，露出腹膜在腹膜上用剪刀剪一小口；剪开腹膜，露出脾脏用镊 子夹住脾脏，用剪刀将脾脏外膜剪破然后放入倳先灭菌的匀浆器中；加适量基础培养基 (RPMI-1640)于匀浆器中，进行研磨挤压出脾细胞，取出匀浆器的匀浆棒再补加适量基础 培养基（RPMI-1640)，静置2min将上层细胞悬液吸取后，放入腹腔巨噬细胞离心管中重 复上述操作1次。1200r/min离心10min除去上清。将108个免疫脾细胞与1-2X10 7个 SP2/0骨髓瘤细胞按照1: 10或1: 5的比唎加入50mL离心管中进行混匀，然后于1500r/ min水平离心10min弃去上清。将离心管倒扣在灭菌的吸水纸上把管中液体吸干。用手 指或桌面轻轻敲击管底让沉淀的细胞松动，再把离心管置于37°C水浴锅中在1min内缓 慢将50%PEG0. 8mL滴入离心管中，边加边轻轻用吸管尖搅拌沉淀细胞再继续搅拌30sec 后，静置lmin然后慢慢加入40mL1640基础培养基（事先进行37°C预温）。加基础培养基 方法为：第lmin内逐滴滴入lmL第2min内加2mL，第3min内加3mL第4min内加其余的 4mL，在每次加培養基时需缓慢加入并轻轻地搅