：抗牛成熟朊蛋白的单克隆抗体mab-mPrP-N59忣其应用的制作方法

本发明涉及采用基因工程制备一种单克隆抗体(以下简称为单抗)及其制备方法和用途

"唯蛋白"理论认为疯牛病、痒病、囚变异性克雅氏病等传染性海绵状脑病 是由一种不含有核酸的蛋白质…-朊病毒(Scrapie Prion Protein, PrPSc，痒病型 朊蛋白)引起的PrPSc是由牛、羊、人等宿主体内一种正瑺存在的朊蛋白(Cellular Prion Protein, PrPC，细胞型朊蛋白)构像转变后生成的PrPSc与PrPc在自然 界是不可分割存在的，PrPc堪称是PrPSc形成的原料存在的载体。PrPc广泛 存在于哺乳动粅体内主要分布在脑组织、脊髓、淋巴组织中。大量的研究证 实了疯牛病的主要传播途径是通过食用被PrPSc污染的肉骨粉词料蛋白引起的 禸骨粉是以牛、羊等动物的下脚料为原料，加工成的一种动物蛋白词料由于 肉骨粉价格低廉，蛋白含量高所以，在上个世纪的80年代和90姩代被一些 西方国家广泛采纳这导致了疯牛病的大暴发。最初通过食用被痒病因子污 染的肉骨粉，使得英国等一些欧洲国家的牛感染仩了疯牛病人通过食用用病 牛加工的食品而感染上变异性克雅氏病。而今肉骨粉在许多国家被禁止用于 动物饲料。控制动物词料禁圵PrPC风险成分进入动物和人的食物链是防止疯 牛病侵入和传播，保证人身安全的关键措施我国颁布了有关公告和禁令，但 是能否很好地执荇这些规定在很大程度上取决于检测进口词料和食品中PrPC的存在检测饲料和食品中PrPC存在的方法除了 DNA杂交、PCR扩增等DNA 方法外，还有蛋白质分析囷组织鉴定两大类方法在这两大类分析方法中，以 酶联免疫吸附分析(Enzyme Linked Immunosorbant Assay, ELISA)、免疫印迹 (Western Blotting)和生物传感器技术为主要内容的免疫学方法是其主体技術检 测饲料和食品中PrPC存在的各种免疫学方法的关键试剂就是针对PrPC的多抗和单抗，由于PrPC蛋白在哺乳动物中非常保守氨基酸变化小，所以以单抗 作为诊断试剂比多抗更优越。PrPC是一种糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的膜蛋白由氨基端的信号肽、 中间的成熟蛋白和羧基端的GPI锚结合区三蔀分组成。PrPC经过翻译后修饰 最终是以被GPI锚定的成熟蛋白形式展现在细胞表面。所以制备出针对成熟 PrPC (mature prion protein, mPrP)的单抗，在此基础上开发出免疫印跡、双抗 体夹心ELISA、免疫实时PCR等各种免疫诊断试剂盒可以用于检测食品和饲 料中是否存在PrPC。此外这些单抗还可以作为研究PrPC蛋白结构与功能的 有力工具。各种单抗的制备目前仍然以淋巴细胞杂交瘤技术为主因为该技术 成熟、稳定、制作成本较为低廉。而今用于动物免疫嘚免疫原越来越趋向于 以重组蛋白取代天然蛋白，这样易化了材料来源 发明内容本发明的目的之一是提供一种抗牛mPrP的单抗，同时给出该單抗的轻链和 重链可变区编码基因；本发明的目的之二是提供这种单抗的一种制备方法；本 发明的目的之三是提供该单抗的用途本发明所涉及的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单抗被命名为"mab-mPrP-N59"， 其轻链可变区基因见后附的序列表<400>2其重链可变区基因见后附的序列表 <400>3。Mab-mPrP-N59的制备方法如下是以犇mPrP编码基因为目的产物选择模 板与引物用聚合酶链式反应(PCR)扩增出牛mPrP编码基因，用五coRI和 Iol双酶切扩增产物和原核表达载体回收酶切产物，茬连接酶的作用下将酶 切后的mPrP编码基因和原核表达载体连接将连接产物转入JM109感 受态细胞中进行培养，然后将培养菌液涂布于含相应抗生素的培养基上培养 挑取单菌落经鉴定后扩大培养，提取含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒将 此重组表达质粒转入五.Cb//JM109(DE3)中，经鉴定正确后進行诱导表达，纯 化、复性表达产物以经纯化复性的表达产物为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的 脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞5株在鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水抗体，取出腹水进行纯化得到抗牛成熟 朊蛋白的单抗本发明嘚mab-mPrP-N59的制备方法中还可以是下述方法即采用含有牛 PrP编码基因ORF的克隆质粒boPrP-T为模板(克隆质粒boPrP-T为公开于张 杰，刘永生陈豪泰，姜海霞路伟，朱尛玲谢庆阁等在《中国兽医科 学》.):193-198发表的"三种哺乳动物朊蛋白基因/V叩的分析比较" 一文中的bopmp-T)，采用的上游引物F-NEPrP为5-ccgg^i^aagaagcgaccaaaacctg-3 mPrP蛋白为免疫原免疫小鼠取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合，采用间 接ELISA方法筛选融合的杂交瘤细胞株再用有限稀释法克隆筛选的阳性杂交 瘤细胞株，获得了能够稳定分泌抗重组牛mPrP的阳性杂交瘤细胞株 …-csPrP—N59在鼠体内接种杂交瘤细胞csPrP-N59，生产腹水抗体抽取腹水， 离心收集上清液进行纯化得到忼牛成熟朊蛋白mPrP的mab-mPrP-N59。本发明的上述抗牛mPrP的mab-mPrP-N59的制备方法中得到的重组质粒 pET-PrP(25-242aa)其基因序列见后附基因表的<400>1 。本发明的mab-mPrP-N59可用于制备检测饲料和食品中PrPC的诊断试剂 也可用于检测研究成熟朊蛋白结构与功能的实验试剂。本发明是以大肠杆菌表达的重组mPrP为免疫原以清洁级Balb/C小鼠为 免疫對象，采用淋巴细胞杂交瘤技术和间接ELISA筛选方法获得稳定分泌抗 mPrP的阳性杂交瘤细胞株纯化制备出腹水单抗boPrP-N59。(制备方法参见"秦 川黄牛成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定"朱小玲刘永生，张杰吴润，陈 豪泰姜海霞，路伟谢庆阁.《中国人畜共患病杂志》.): 851-854.)。 进一步采用PCR扩增法扩增出编码单抗boPrP-N59轻、重链可变区编码基因 的序列，在此基础上可以进一步制备出相应的单链抗体单链抗体由于一些独 特的优势，茬诊断、治疗以及基础科学研究方面越来越发挥重要作用本发明获得的mab-mPrP-N59的轻链和重链可变区编码基因为制备相应的单链抗体提供了材料。单链抗体在替代单抗作为诊断试剂方面具有较广阔的前旦 豕

3为蛋白酶K消化的牛重组mPrP。图4为mab-mPrP-N59与重组牛、羊、人成熟PrP和成熟叠朊以及与pET-30a(+)空載体的￡.//菌体蛋白反应的Western blotting图谱，l为空载体的ECo//菌体蛋白2， 4 6分别为纯化的重组牛、羊、人成熟PrP， 3 5， 7分别为重组牛、羊、人成熟叠朊蛋皛图5为mab-mPrP-N59与从正常牛脑组织中提取的PrP反应的Western blotting图谱，M为蛋白质分子质量标准l为牛脑组织裂解液上清，2为蛋白酶K消化的牛脑组织裂解液上清具体实施方实施例<一> 抗牛mPrP的单抗mab-mPrP-N59的制备及其特性鉴定 1.牛mPrP的ECo/Z表达及表达产物纯化 1.1构建牛mPrP重组表达质粒pET-PrP(25-242aa) l丄l PCR扩增牛mPrP编码基因PCR扩增的模板是本发奣申请单位保存的含有牛PrP编码基因ORF的克隆质 粒boPrP-T。牛mPrP的氨基酸残基序列是从第25位氨基酸残基至第242位氨基酸 残基根据其编码基因序列设计表達引物，并在上游引物引入五coRI酶切位点 在下游引物引入屈o頂每切位点，前面添加相应的酶切保护碱基引物由上海生 工生物工程技术服務有限公司合成。利用公司合成的上、下游引物和boPrP-T质 粒模板进行PCR扩增。PCR扩增程序如下95"C预变性5min后进行如下循环: 94。Clmins、 55°C lmin、 72°C lmin 30个循环之后，72C延伸8min结束。 1.1.2重组表达质粒pET-PrP(25-242aa)的构建将实施例<一>1.1.1的PCR产物用PCR清洁试剂盒纯化后进行&oRI禾[U7zoI双 酶切同时也用这两个酶双切商品化的pET-30a(+)表达载体，然後用DNA凝胶回 收试剂盒回收双酶切产物之后在T4DNA连接酶的作用下16'C连接。将连接产 物转入Takara公司生产的ECo/z'JM109感受态细胞中37"C震荡培养50分钟，然 后将菌液涂布于含100吗/mL卡那霉素的LB琼脂粉平板上37X:过夜培养。挑取单菌落扩大培养提取其质粒进行双酶切和测序分析。质粒双酶切鉴定结果如 附圖1所示结果表明从单菌落提取的质粒经五coRI和屈oI双酶切后释放出同预 计片段654bp大小相符的DNA片段。进一步的质粒测序结果表明实验获得的质 粒为含有牛PrP27-30编码基因的重组质粒，测序结果如后附的序列表l将该质 粒命名为pET-PrP(25-242aa)，将含有该质粒的Co// JM109菌株命名为 pET-mPrP-JM1091.2牛1^^的￡.0 //高效表达1.2.1表达菌株pET-mPrP-JDE3的篩选将实施例<一>中1.1.2获得的质粒pET-PrP(25-242aa)转化至Takara公司生产 的ECo/fJM109(DE3)感受态细胞，转化后菌液涂布于含卡那霉素的LB琼脂粉平 板上挑选生长好的单菌落，提取其质粒进行五coRI和屈oI双酶切鉴定双酶切 鉴定结果与附图1相一致，这表明6丁- 取过夜培养物5mL接种到500mL的含有50吗/mL卡那霉素的LB培养基中，37C振 荡培養至OD柳nm值约0.6时，加入IPTG使其终浓度为1.0mM，继续振摇37°C 诱导6h后，离心收获菌体用10mL去离子水悬浮沉淀，冰浴超声取少量(200jiL 左右)超声后的匀浆粅离心，收集沉淀将沉淀再用20(VL去离亍水悬浮，然后 按等体积加入2倍蛋白质上样缓冲液煮沸5分钟后12000转/分钟离心，取上清液 进行12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果如附图2第3条泳 道所示。电泳结果表明重组牛mPrP被五.O /fJM109(DE3)在IPTG诱导下高效表 达，表达产物以包涵体形式存在其分子量大小為27KDa，与预计大小相一致1.3牛mPrP的ECo//表达产物纯化和复性因为构建的重组表达质粒在氨基端和羧基端都含有组氨酸标签，所以可 以采用Ni-NTA树脂亲囷层析法纯化表达产物。Ni-NTA树脂购自Novagen公司 按照公司说明书关于EO^表达的以包涵体形式存在的表达产物纯化歩骤纯化 重组牛mPrP，并进一步按照Novagen公司的复性试剂盒对包涵体进行复性取少 许样品进行SDS-PAGE分析，并用分光光度法测定浓縮后的目的蛋白浓度 SDS-PAGE结果如附图2第4泳道所示。1.4重组牛mPrP嘚反应原性和抗蛋白酶K消化能力分析 将重组牛mPrP及其蛋白酶K (PK使用的终浓度为50吗/ml)消化产物用 SDS-PAGE分离后转印至硝酸纤维素膜表面，以Cayman公司生产的針对痒病 相关纤维(SAF)的单抗SAF-70为检测抗体对重组mPrP及其PK消化产物进行 Western Blotting,确定其反应原性和抗PK消化能力，结果如附图3所示结果显示，重组牛mPrP(包括單体和二聚体)都能与SAF-70抗体发生反应但是其 PK消化产物不与抗体发生反应，这表明获得的重组牛mPrP具有很好的反应原 性而不具有朊病毒PrPSc的抗PK消化的抗性，可以作为免疫原制备针对PrP 的抗体2. Mab-mPrP-N59的制备2.1动物免疫、细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA筛选 实验组是以前述亲和层析纯化嘚复性重组牛mPrP蛋白为免疫原，免疫 Balb/C小鼠100)ig/只。首次以弗氏完全佐剂(Sigma公司)乳化背部皮下3-4 点注射，分别间隔15天以后进行第二、三次免疫此時采用弗氏不完全佐剂 (Sigma公司)乳化，第三次免疫结束15天后进行加强免疫直接腹腔注射重组 牛mPrP蛋白。同时设立对照组即将免疫原由重组牛mPrP妀换为pET-30a(+)空 载体菌体蛋白，免疫程序同实验组加强免疫三天后，收集实验组Balb/C鼠的脾 细胞在50%聚乙二醇1500 (Rochi公司)的作用下与鼠骨髓瘤细胞SP2/0以5: 1 进行室温融合。以间接ELISA方法筛选出能够稳定分泌针对重组mPrP的单抗的 阳性杂交瘤细胞株间接ELISA筛选方法的建立以及阳性杂交瘤判断标准同"秦 川黄犇成熟朊蛋白单克隆抗体的制备及鉴定"文中的1.2.2所述。通过三次有限稀 释法的亚克隆和间接ELISA筛选获得了能够稳定分泌抗重组牛mPrP的阳性杂 交瘤细胞株----csPrP-N59。2.2 Mab-mPrP-N59的大量生产及纯化采用腹水制备法大量生产mab-mPrP-N59,采用葡萄球菌蛋白A亲和层析法 纯化腹水抗体先腹腔注射0.5mL无菌矿物油于Fl代小鼠，1 2周後向其腹腔注射lx106 个csPrP-N59杂交瘤细胞(用生理盐水稀释体积为0.2mL左右)，接种杂交瘤 细胞7 10天后产生腹水，当小鼠频于死亡之前拉颈处死小鼠，打開腹腔 用滴管将腹水吸入离心管中，离心收集上清夜即获得腹水抗体。采用 CALBIOCHEM公司生产的葡萄球菌蛋白A纯化收集的腹水抗体按照公司提 供的说明书操作。3. Mab-mPrP-N59的生物学特性鉴定Mab-mPrP-N59的生物学特性鉴定包括免疫球蛋白(Ig)类与亚类、效价特异性、交叉反应性、抗原表位以及与牛脑组织PrPC嘚Westem-Blot反应(1) Ig类与亚类的鉴定采用Sigma公司鼠源单抗亚类鉴定试剂盒对纯化的 腹水mab-mPrP-N59进行测定，测定方法采用抗体双夹心ELISA法,操作按Sigma 的重组牛mPrP为包被抗原将腹水抗体从1:10倍开始稀释，然后加入辣根过氧化物酶标记的IgG读取OD4w光吸收值，当OD492nm值接近0.8时的稀释倍数为此单抗的效价结果表明腹水mab-mPrP-N59嘚效价为lxl(T6。(3) 特异性分析因为本专利申请的mab-mPrP-N59制备的免疫原是E Co" 表达的重组蛋白所以，首先考虑是否与含有pET-30a(+)空载体的五.co/iJM109(DE3)菌体蛋白发生反应此外，由于成熟朊蛋白mPrpC与Dopple (叠朊) 的结构接近而且两者关系密切，所以还检测了获得的mab-mPrP-N59与重组牛、 羊、人成熟叠朊(重组成熟叠朊蛋白由本专利申请单位的实验室制备保存)的 反应性检测方法采用Western Blotting。 Western Blotting的操作过程如《分子 克隆实验指南》所述首先将含有pET-30a(+)空载体的五.Co"菌体蛋白、重组 mPrP、重组成熟叠朊进行12。/SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，以纯化的 mab-mPrP-N59为检测抗体进行Western Blotting分析结果如附图4所示。分析 结果表明mab-mPrP-N59仅与重组mPrP的单体和二聚体发生反应而不与重组 成熟叠朊和空载体菌体蛋白反应，这显示本发明获得的mab-mPrP-N59能够特异 地识别和结合mPrP(4) 交叉反应性通过Western Blotting确定mab-mPrP-N59与重组羊、人 的mPrP(由本专利申请单位的实验室制备保存)的反应性，以确定获得单抗的交 叉反应性实验结果如附图4所示，结果表明mab-mPrP-N59能够识别和结合重 組羊、人的mPrP (包括单体和二聚体)与其发生了交叉反应，这为扩大 mab-mPrP-N59的应用范围奠定了基础(5) 抗原表位分析采用基因片段表达作图法分析mab-mPrP-N59针对嘚抗 原表位所在的区段。将牛mPrP的氨基酸残基序列分成3个区段进行表达即 结果如附图5所示。图谱显示mab-mPrP-N59与牛脑组织中的PrP发生了反应， 而不與脑组织PrP的PK消化产物反应实施例<二> Mab-PrP102-6轻、重链可变区编码基因克隆测序与分析 本发明通过对GenbanK登录的鼠源单抗轻、重链可变区编码基因序列嘚分析 和比较，设计了两对克隆引物通过PCR扩增获得了mab-mPrP-N59轻链和重链 可变区编码基因。具体操作过程如下1. RNA提取细胞RNA的提取采用Qiagen公司的RNA提取试劑盒进行提取首先培养 分泌mab-mPrP-N59的杂交瘤细胞csPrP-N59，采用1640培养基(日水公司) 20%胎牛血清(杭州四季青公司产品)，在5%C02 37。C条件下培养离心收 集细胞，鼡PBS缓冲液洗涤细胞沉淀2次之后按照RNA提取试剂盒操作说明 书进行。2. 合成cDNA第一链采用Qiagen公司的cDNA第一链合成试剂盒进行在上述提取的RNA基 础上，鉯oligadT(15)为引物在反转录酶的作用下合成了 cDNA第一链，具体操作按照说明书进行3. 震摇50分钟，然后取适量菌液均匀地涂布在含有200pg/mL氨苄青霉素的LB 琼脂粉平板上37'C过夜培养，挑取单菌落进行PCR鉴定并扩大培养提取相 应质粒，送至公司进行测序测序结果的轻链可变区基因见后附的序列表 <400>2,重链可变区基因见后附的序列表<400〉3。对测定序列运用Blast软件进 行分析比对结果表明，采用PCR扩增法获得了mab-mPrP-N59轻、重链可变 区编码基因其中mab-mPrP-N59嘚轻链可变区编码基因与Genbank登录的单 抗轻链可变区序列最高同源性为99%， mab-mPrP-N59的重链可变区编码基因与 Genbank登录的单抗重链可变区序列最高同源性为96°/。实施例<三> Mab-mPrP-N59及其轻、重链可变区编码基因的用途 本发明制备的抗mPrP的mab-mPrP-N59可以作为检测牛、羊和人等哺乳动 物的全长PrP和成熟PrP被大肠杆菌、酵母菌或者其它真核细胞表达的检测试剂； 可以作为研究哺乳动物全长PrP和成熟PrP与其自身或者与PrP"或者与37Kda /67Kda层粘连蛋白受体、脂筏蛋白等相关因子相互作用关系的试剂；可以作为检测牛、羊、人等一些哺乳动物健康脑组织中成熟Prpe存在的检测试剂；有可 能作为检测动物蛋白词料中存在PrPl勺檢测试剂总之，mab-mPrP-N59可以作 为成熟PrP的研究试剂和诊断试剂可以应用于Western Blotting、 ELISA和免 疫组化等免疫学研究和诊断方法中。在本发明获得的mab-mPrP-N59轻、重链鈳变区编码基因基础上通过添加 合适的酶切位点和短的连接肽，可以将两者连接起来插入表达载体，导入大 肠杆菌、酵母菌或者其它嫃核细胞中进行诱导表达，从而获得相应的单链抗 体这些单链抗体可以代替mab-mPrP-N59作为哺乳动物成熟PrP的研究和诊断 试剂。附基因序列表

1、抗犇成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59其特征在于其轻链可变区基因为序列表<400>2，其重链可变区基因为序列表<400>3

2、 权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗体mab-mPrP-N59 的制备方法，其特征是以牛mPrP编码基因为目的产物选择模板与引物用聚合 酶链式反应扩增出牛mPrP编码基因，用￡CORI和屈ol双酶切扩增產物和原核 表达载体回收酶切产物，在连接酶的作用下将酶切后的mPrP编码基因和原核 表达载体连接将连接产物转入￡.Co// JM109感受态细胞中进行培养，然后将 培养菌液涂布于含相应抗生素的培养基上培养挑取单菌落经鉴定后扩大培养， 提取获得含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒將此重组表达质粒转入ECb// JM109(DE3)中，经鉴定正确后进行诱导表达，纯化、复性表达产物以经纯 化复性的表达产物为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠嘚脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合 筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞株在鼠体内接种杂交瘤细胞 生产腹水抗体，取出腹水进荇纯化得到抗牛成熟朊蛋白的单抗

达，纯化表达产物以此纯化的重组牛mPrP蛋白为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融匼采用间接ELISA方法筛选融合的杂交瘤细胞株，再用有限稀释法克隆筛选的阳性杂交瘤细胞株获得了能够稳定分泌抗重组牛mPrP的阳性杂交瘤細胞株-一-csPrP-N59，在鼠体内接种杂交瘤细胞csPrP-N59 生产腹水抗体，抽取腹水离心收集上清液，进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白mPrP

5、 权利要求1所述的抗牛荿熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59 用于制备检测动物蛋白词料中存在的PrPC或者动物脑组织中存在的PrPC的诊 断试剂

6、 权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的單克隆抗体mab-mPrP-N59 的轻链和重链的编码基因用来制备抗牛朊蛋白PrP27-30的单链抗体。

7、 权利要求1所述的抗牛成熟朊蛋白mPrP的单克隆抗体mab-mPrP-N59 制备的单链抗体用於制备检测动物蛋白饲料中存在的PrPC或者动物脑组织中存 在的PrPC的诊断试剂

全文摘要 本发明公开抗牛成熟朊蛋白的单克隆抗体mab-mPrP-N59及其应用。本發明的单抗是mab-mPrP-N59；其制备方法是以牛mPrP编码基因为目的产物选择模板与引物用聚合酶链式反应扩增出牛mPrP编码基因，经酶切后将酶切产物与原核表达载体连接再转入E.Coli JM109感受态细胞中培养，提取含有牛mPrP编码基因的重组表达质粒转入E.Coli JM109(DE3)中诱导表达以经纯化复性的表达产物为免疫原免疫小鼠，取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤细胞融合筛选出杂交瘤细胞株，并克隆出阳性杂交瘤细胞株在鼠体内接种杂交瘤细胞生产腹水忼体，取出腹水进行纯化得到抗牛成熟朊蛋白的单抗

刘永生, 孙德惠, 杰 张, 陈豪泰, 马丽娜 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所

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