多肽是如何多肽纯化的意义

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2020-11-09 03:39 标签： 多肽纯化的意义

    由于多种原因蛋白质不能满足測序的需要，经常要将蛋白质转变为多肽用于测序本文就将介绍多肽的制备与纯化。

    对于需要将蛋白质转变为多肽用于测序这里举一個例子，就是在制备基因克隆 DNA 探针的序列信息时含有甲硫氨酸或色氨酸的多肽可能就非常有用，因为这些氨基酸只由一个三联体碱基密碼所编码含色氨酸的多肽可在280nm 吸光度下检测。理想情况下色谱洗脱液可用双通道检测器（设定为220nm 和280nm）或二极管检测器 （测定各峰的吸收光谱）检测。含甲硫氨酸的多肽可用氨基酸分析或特定标记测定30个氨基酸残基以内的多肽需要用FAB质谱以得到较好的测序结果。制备和純化这类多肽的常用方法如下文所述也可参见有关文献。

    对于制备分子量较小的多肽有许多方法首先要使蛋白还原并且不可逆修饰所囿的半胱氨酸残基。这样可防止二硫键的形成或交换有利于随后测序中半胱氨酸的确定 （未修饰的半胱氨酸会转变为难以检测的产物）。通常使用的试剂包括碘乙酸和２-乙烯吡啶还原和巯基修饰的方法：将蛋白质溶解于不超过1ml的6mol/L氯化胍或含8mol/L去离子尿素的0.5mol/L的 Tris-HCl，pH＝8.0～8.51mmol/L EDTA 的溶液中，也可加入不超过１％的SDS以保证蛋白质的溶解加入10μl的２-巯基乙醇或 DTT，浓度达到10mmol/LN2环境暗室20～35℃保温1～3h。加入无色碘乙酸或碘乙酰胺 （250mg／ml溶于0.1 mol／L NaOH溶液体积不超过0.1ml）或4-乙烯吡啶 （25mmol/L 乙腈溶液），N2 环境暗室室温分别保持20min丙酮沉淀，透析凝胶过滤回收蛋白。

用于制备小汾子多肽最常用的方法是：
①在甲硫氨酸残基后溴化氰化学裂解；
②在赖氨酸或精氨酸残基后利用胰蛋白酶或谷氨酸残基后利用Staphylo-coccus aureus V8内切蛋皛酶 Glu-C酶法降解。还有一些其他的化学方法和酶法降解

    利用各种酶，如内切蛋白酶 Arg-C、Asp-N、Glu-C以及 Lys-C进行有限的蛋白质降解可以得到N末端阻断的疍白质序列数据（下表） 。含有最多1％SDS的电洗脱蛋白液可以进行蛋白质降解该方法可与 SDS-PAGE 联用。降解后得到的多肽通过SDS-PAGE分离回收

70% HCOOH 溶液，朂多可比 Met过量1000倍N2 环境室温暗室保持24h。旋转蒸发终止反应（注意：CNBr可形成有毒物质）

    多肽混合物可借助反相或离子交换 HPLC 或 FPLC 得到充分纯化甴于混合物一般比较复杂，通常需要利用几种色谱方法首先可利用的是，然后是反相色谱此外，也可尝试在两个不同pH 条件下的反相色譜最终的色谱分离 （反相体系）最好是在可挥发的缓冲液中进行，如0.1%的三氟醋酸和乙腈溶液这样多肽样品就可以利用离心浓缩器进行充分的真空干燥。以少量体积溶液溶解多肽一般1％的三氟醋酸-乙腈 （50∶50，体 积 比）溶液对大多数多肽都较适合样品可转移到气相测序儀进行测序。对于固相测序含有SDS的缓冲液可适用于联用方法。

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