本公开一般涉及用于鉴别、靶向和分离人树突细胞(dc)前体“前dc(pre-dc)”的方法及其在检测和治疗疾病中的用途。本公开提供了用于鉴别前dc和各种前dc子集(subset)的特异性标志物和所述标志物的组合。本公开还涉及对这些标志物或前dc及其子集具有特异性的结合分子的免疫原性组合物，以及它们在引发针对疾病和癌症的免疫应答中的用途。
树突细胞(dc)是对免疫应答的启动和调节至关重要的专职病原体感知和抗原呈递细胞(1)。dc细胞是异质的，并且能够加工和呈递天然t细胞的抗原以启动特异性免疫应答。dc群体分为两个谱系：浆细胞样dc(pdc)和常规dc(cdc)，后者包括cdc1和cdc2亚群(2,3)。dc子集以逐步进展的方式起源于位于骨髓中的dc限制性祖细胞。共同的树突祖细胞定向发展为pdc谱系或cdc谱系。后者通过称为cdc前体(前dc)的中间体前体发生。
鼠dc起源于称为共同dc祖细胞(cdp)的独特dc限制性骨髓(bm)祖细胞，其分化成pdc和dc前体(前dc)并从bm迁移到外周组织中(4-6)。已经证明：(a)pdc培养物具有cdc潜能并获得cdc样形态(10,11)，如最近在小鼠bmpdc中观察到的(36)；(b)pdc通过产生ifnα和il-12介导th1免疫(10、37-41)；(c)pdc表现出天然t细胞同种异体刺激能力(30,39)；和(d)pdc表达共刺激分子并以ifnα分泌为代价表现出抗原呈递/交叉呈递能力(37,42)。
使用rsem程序版本1.2.19，以默认参数(51)，将原始读数与来自gencode的人参考基因组grch38(53)进行比对。使用rsem程序和人gencode注释版本22计算每百万转录物中的基因表达值。使用singular(fluidigm)分析工具箱进行质量控制和异常细胞检测。相对于从geneexpressionomnibus数据系列gse35457鉴别的cdc2deg(20)，使用cdc1进行cmap分析，并获得富集分数。与基因集富集分析类似，cmap用于确定转录物组谱与细胞类型特征性基因特征的关联。
使用mpath算法(22)定义发育轨迹，该算法构建多分支细胞谱系并沿着分支重新排序单个细胞。在mars-seq单细胞转录物组数据分析中，我们首先使用seuratr程序包来鉴别五个簇：对于每个簇，mpath计算几何中心并将其用作表示规范细胞状态的界标；随后，对于每个单细胞，mpath计算其与所有界标的欧几里德距离，并鉴别出两个最近的界标。因此，每个单独的细胞被分配到其两个最近界标的邻域。对于每对界标，mpath然后计数被分配到邻域的细胞的数量，并使用所测定的细胞计数来估计界标之间转变(transition)为真的可能性。高细胞计数意味着转变有效的可能性很高。然后，mpath构建加权邻域网络，借此节点表示界标，边缘表示界标之间的推定转变，而分配给边缘的数字表示转变的细胞计数支持。鉴于单细胞转录物组数据倾向于有噪声，具有低细胞计数支持的边缘被认为可能是伪像。因此，mpath通过使用(0-n))(n-n表示细胞计数)来去除具有低细胞支持的边缘，以量化节点之间的距离，然后应用最小生成树算法寻找可以以最小的距离总和连接所有节点的最短路径。因此，所得的修剪网络是以最小边缘数量和边缘上的最大细胞总数连接所有界标的网络。然后使用mpath将各个细胞投影到连接其两个最近界标的边缘上，并根据它们在边缘上的投影点的位置为细胞分配伪时间排序。在c1单细胞转录物组数据分析中，我们首先使用cmap分析来鉴别cdc1引发的簇、cdc1未引发的簇和cdc2引发的簇，然后使用mpath构建这三个簇之间的谱系。mpath分析以无监督的方式进行，无需事先知道起始细胞或分支数。这种方法可用于非分支网络、趋异(bifurcation)和具有三个或更多分支的多分支网络的情况。
质谱流式细胞技术染色、条形码技术(barcoding)、获取和数据分析
对于质谱流式细胞技术，如表3中所列，从invitrogen、fluidigm(预缀合抗体)、biolegend、ebioscience、bectondickinson或r&dsystems获得预缀合或纯化的抗体。对于一些标志物，荧光团或生物素-缀合的抗体用作一抗，然后用如前所述(16)产生的抗荧光金属缀合的抗体(例如抗fitc克隆fit-22)或金属缀合的链霉抗生物素蛋白进行二次标记。简而言之，u形底96孔板(bdfalcon,cat#3077)中的3x106个细胞/孔用200μlfacs缓冲液(4％fbs、2mmedta、0.05％叠氮化物，在1xpbs中)洗涤一次，然后用100μl200μm顺铂(sigma-aldrich,cat#g)在冰上染色5min以排除死细胞。然后将细胞用抗-cadm1-生物素和抗-cd19-fitc一抗在50μl反应中在冰上孵育30min。用facs缓冲液将细胞洗涤两次，并用50μl重金属同位素缀合的二级mab混合物在冰上孵育30min。然后用facs缓冲液将细胞两次洗涤，并用pbs洗涤一次，然后用pbs中的200μl2％多聚甲醛(pfa；electronmicroscopysciences,cat#15710)固定过夜或更长时间。固定后，将细胞沉淀并在室温下重悬浮于200ul1x透化缓冲液(biolegend,cat#421002)中5分钟，以进行细胞内标记。然后将细胞用金属缀合的抗cd68在50μl反应中在冰上孵育30min。最后，将细胞用透化缓冲液洗涤一次，然后用pbs洗涤，然后进行条形码技术。
立即将所有babe和dm-金属溶液混合物在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。选择独特的条形码双重组合来染色每个组织样品。条形码pd-102以1:4000稀释使用，pd-104以1:2000稀释使用，pd-106和pd-108以1:1000稀释使用，pd-110和ln-113以1:500稀释使用。将细胞用pbs中的100μl条形码在冰上孵育30min，在透化缓冲液中洗涤，然后在冰上在facs缓冲液中孵育10min。然后将细胞沉淀并在室温下重悬浮于100μl在2％pfa/pbs(1:2000)中的核酸ir-intercalator(maxpar,cat#201192b)。20min后，将细胞用facs缓冲液洗涤两次，并用水洗涤两次，最后重悬浮于水中。在每组中，将细胞从所有组织类型合并、计数并稀释至0.5×106个细胞/ml。在获取之前以1％浓度添加eqfourelementcalibrationbeads(dvsscience,fluidigm)。获取细胞数据并使用cytof质谱流式细胞计数器(fluidigm)分析。
以常规流式细胞术文件(.fcs)格式输出cytof数据，并使用先前描述的软件(52)归一化。使用在先前版本的质谱流式细胞技术软件中使用的自定义r脚本，将具有零值的事件随机分配在0和-1之间的值(53)。使用flowjo中的boolean门控算法(booleangatingalgorithm)对每个条形码的细胞进行去卷积。pbmc的cd45+lin(cd7/cd14/cd15/cd16/cd19/cd34)-hla-dr+群使用flowjo进行门控，并导出为.fcs文件。使用逻辑转换函数转换标志物表达值(54)。进行无需替换的随机二次采样以选择20,000个细胞事件。然后使用表3中列出的标志物和rtsner程序包中的rtsne函数以默认参数，对二次采样细胞事件的变换值进行t分布随机邻域嵌入(tsne)降维(18)。类似地，使用veganr程序包中的vegdist、spantree和isomap函数(55)进行等距特征映射(isomap)(34)降维。
以method＝“euclidean”运行vegdist函数。spantree函数以默认参数运行。以ndim等于输入数据的原始维数且k＝5，运行isomap函数。在降维之前使用表3中列出的标志物进行表型图聚类(26)，并且最近邻域的数量等于30。将从tsne、isomap和phenograph分析获得的结果作为附加参数并入.fcs文件中，然后将其加载到flowjo中以在降维上生成标志物表达的热图。使用cytofkitr程序包进行上述分析，该程序包提供了现有最先进的细胞术数据分析方法的包装(56)。
人细胞流式细胞术:标记、染色、分析、细胞分选
细胞离心涂片(cytospin)和扫描电子显微术
从纯化的细胞制备细胞离心涂片，并根据制造商的方案(fisherdiagnostics)用hema3系统染色。用olympusbx43直立显微镜(olympus)以100x放大率分析图像。如前所述(20)进行扫描电子显微术。
ms-5基质细胞的树突细胞(dc)分化共培养测定
将分选的细胞在37℃下接种在聚赖氨酸涂覆的盖玻片上1h。然后将细胞在ph7.4的0.1m二甲胂酸盐缓冲液中的2％戊二醛中固定1h，用2％缓冲的四氧化锇后固定1小时，然后在分级系列的乙醇溶液中脱水，然后包埋在环氧树脂中。使用安装在于80kv下操作的tecnai12透射电子显微镜(feicompany)上的quemesa(sis)数码相机获取图像。
使用micro试剂盒(qiagen)从facs分选的血液前dc子集和dc子集中分离总rna。使用agilentbioanalyzer(agilent)评估总rna完整性，并计算rna完整性数(rin)。所有rna样品的rin≥7.1。使用epicentertargetamptm2-roundbiotin-arnaamplificationkit3.0，根据制造商的说明，使用500pg总rna起始材料制备生物素化的crna。在illuminahuman-ht12version4芯片组(illumina)上进行crna的杂交。将微阵列数据从genomestudio(illumina)输出，无需背景扣除。检测p值>0.05的探针被认为未在样品中检测到，并被滤出。将剩余探针的表达值进行log2转化并进行分位数归一化。对于差异表达基因(deg)分析，使用limmar程序包(57)进行一个细胞子集与另一个细胞子集的比较，其中样品与供体标识符配对。选择benjamini-hochberg多重检验(58)校正的p值<0.05的deg。以这种方式，通过将一个子集与合并为一组的所有其他子集进行比较，使用limma来为前dc数据中的每个细胞子集选择上调和下调的特征基因。图4e所示的表达谱来自于从以下鉴别的62个共同基因：来自比较前cdc1与早期前dc和比较cdc1与前cdc1的deg的联合，以及来自比较前cdc2与早期前deg和比较cdc2与前cdc2的deg的联合(表5列出了cdc1谱系和cdc2谱系的deg的列表，和62个共同基因的列表；图21为两个deg列表的维恩图比较和62个共同基因的鉴别)。
用mann-whitney检验比较来自患有皮特霍普金斯综合征的患者和对照的数据。使用kruskal-wallis检验，然后使用dunn多重比较检验，比较mars-seq单细胞rnaseq数据集中单个细胞中单个基因的表达水平。当调整p<0.05时，差异被定义为统计学上显著的。使用windows用graphpadprism6.00(graphpadsoftware)进行所有统计学检验。相关系数计算为皮尔逊相关系数。
dc的hiv感染和刺激
将分选的细胞沉淀并以0.4×106个细胞/ml重悬浮于完全x-体内培养基中，并将50μl接种在圆底96孔板中。在一些实验中，以20μg/ml添加抗siglec-1mab或migg1同种型对照，并且在添加病毒之前将细胞在37℃下孵育30分钟。将hiv-1x4gfp加入细胞(150μl/孔的hek293ft培养物上清液)中，并在37℃下孵育2小时。将细胞充分洗涤并固定于pbs中的4％pfa中。使用kc-57rd1mab(beckmancoulter，6604667)进行p24染色。对于反式感染实验，在用hiv-1x4gfp培养2小时后充分洗涤分选的dc，并以1:1的比例加入活化的cd4+t细胞。或者，以5μg/ml加入cpg-a，以10μg/ml将cl264加入到dc中，并将细胞培养过夜，然后加入hiv-1x4gfp。然后洗涤细胞并加入活化的cd4+t细胞。48小时后，将细胞固定在pbs中的2％pfa中。然后用pe-cy7抗cd3(bd)染色细胞，并在facsverse(bd)上分析。使用mac用flowjov10和prismv7(graphpad)分析数据。
人细胞流式细胞术：标记、染色、分析和分选
通过无监督单细胞rnaseq和cytof无偏鉴别dc前体
使用从人血液中分离的pbmc，进行大规模并行单细胞mrna测序(mars-seq)(15)，以评估谱系标志物(lin)(cd3/cd14/cd16/cd20/cd34)–、hla-dr+cd135+群(12,13)(图1a至g，和图6a：分选策略，图6b至j：工作流程和质量控制，表1：检测到的基因数量)中710个单独细胞的转录谱。通过t-随机邻域嵌入(tsne)使用非线性降维处理mars-seq数据，所述t-随机邻域嵌入(tsne)能够以二维图的形式使细胞之间的高维相似性无偏可视化(16-18)。
在tsne维度上具有噪声的基于密度的空间聚类算法(density-basedspatialclusteringofapplicationswithnoise)在所选择的pbmc群内鉴别了五个转录相关细胞的不同簇(图1a和图6g)。为了定义这些簇的性质，计算pdc、cdc1和cdc2的基因特征分数(如(20)所述，表2：特征基因列表)，并且将归因于每个细胞的特征的表达叠加在tsne可视化上。簇#1和#2(分别含有308个细胞和72个细胞)被鉴别为pdc，簇#3(含有160个细胞)被鉴别为cdc1，簇#5(含有120个细胞)鉴别为为cdc2。簇#4(含50个细胞)位于cdc1(#3)和cdc2(#5)簇之间，并具有弱的混合pdc/cdc特征(图1a)。使用连接性map(cmap)分析(21)来计算每个单独细胞中pdc或cdc特征基因转录物的富集程度。该方法证实了pdc(#1和#2)和cdc(#3和#5)簇的特征，并且显示簇#4中的大多数细胞表达cdc特征(图1b)
然后将mpath算法(22)应用于五个簇，以基于细胞之间的这些转录相似性来识别假设的发育关系(图1c和图7a和b)。mpath揭示了五个簇被分成三个不同的分支，在三个分支的交叉处具有一个中心簇(簇#4)(图1c和图7a)。将簇#4连接到cdc1簇#3和cdc2簇#5的mpath边缘具有高细胞计数(分别为159个细胞和137个细胞)，这表明从簇#4到簇#3和#5的转变可能是有效的，并且表明簇#4可能含有推定的cdc前体(图1c)。相比之下，连接簇#4和pdc簇#2的边缘的细胞计数仅仅为7(图1c和图7b)，这表明该连接非常弱。当mpath修剪加权邻域网络时，保留了连接簇#4和#2的边缘(图7b)，这仅仅是由于mpath算法需要连接所有簇这一特征(22)所致。
使用monocle(23)、主成分分析(pca)、wishbone(24)和扩散图算法(25)来证实这些发现。monocle和pca将细胞解析为与原始mpath分析相同的三个分支，来自tsne簇#4的细胞再次落在交叉点(图1d和e)。diffusionmap(扩散图)和wishbone分析表明，簇#3(cdc1)、#4和#5(cdc2)之间存在连续性：来自簇#4的细胞主要存在于diffmap_dim2low区域，而来自簇#3和#5的细胞逐渐地从diffmap_dim2low区域分别向左和向右漂移。pdc簇(#1和#2)与所有其他簇清楚地分开(图1f和图7c)。为了支持这一观察，来自这些pdc簇的细胞具有比cdc簇(#3和#5)和中心簇#4更高的pdc特异性标志物和转录因子(tf)表达。相反，簇#4中的细胞比pdc簇表达更高水平的标志物和与所有cdc谱系相关的tf(图1g)。这表明簇#4代表推定的未定向cdc前体群的可能性。
前dc存在于pdc部分并引起cdc
将该分析扩展至脾的免疫细胞，并鉴别了相似的推定的前dc群，其比血液中更丰富并且表达更高水平的cd11c(图2a和c，以及图9d)。
血液和脾中的推定的前dc群均表达cd135和中间水平的cd141(图9c)。从血液中分选的推定前dc的wright-giemsa染色揭示了与经典cdc相称的锯齿状核模式(indentednuclearpatter)、核周清除区域和与pdc相称的嗜碱细胞质(图2d)。
在超结构水平，推定的前dc和pdc表现出不同的特征，尽管它们的形态相似(图2e和图9e)：与pdc相比，推定的前dc具有更薄的细胞质，均匀分布的线粒体(m)、较不粗糙的内质网(rer)、锯齿状核模式、大细胞核和有限的细胞溶质；pdc含有较小的细胞核，丰富的细胞溶质，包装的线粒体，在许多堆粗糙er膜周围的平行潴泡中组织化的发育良好的极化皮质rer，与先前公布的数据一致(27)，这表明一种发达的分泌装置。
如前所述(8)，在flt3l、gmcsf和scf存在的情况下，通过基质培养比较了前dc与cdc和pdc的分化能力。5天后，pdc、cdc1和cdc2群仍然主要处于其初始状态，而推定的前dc群体已经以体内发现的已知比例(14、20、28、29)分化成cdc1和cdc2(图2f、图9f和图10)。总之，这些数据表明cd123+cd33+cd45ra+cx3cr1+cd2+细胞是具有cdc分化潜能的循环前dc。
breton及其同事(9)最近报道了一小部分人前dc群(在图11a中突出显示)，其与本文定义的lin–cd123+cd33+cd45ra+前-dc共有相似的表型(图11a和b)。本发明的结果揭示，血液和脾中的前dc群体明显大于在先前考虑的较小的cd303–cd141-cd117+部分中鉴别的群(图11c和d)。
前dc在功能上不同于pdc
当与il-3和cd40l一起培养时，分泌ifnα的pdc可以分化成类似cdc的细胞(10,11)，并且已经被认为是dc前体(11)。然而，当使用传统的ilt3+ilt1–(10)或cd4+cd11c–(11)pdc门控策略时，检测到两组中的“污染性”cd123+cd33+cd45ra+前dc亚群(图11e和f)。这种“污染性”亚群结果提出了传统分类的“pdc群”的其他属性是否可归因于前dc这一问题。
皮特霍普金斯综合症(phs)的特征在于异常的颅面和神经发育、严重的智力迟钝和运动功能障碍，并且由tcf4的单倍体功能不全引起，tcf4编码e2-2转录因子-pdc发育的中枢调节剂(31)。与健康个体相比，患有phs的患者的血液pdc数量显著减少，但保留了前dc的群(图2g，和图13)，这可能是解释了在这些患者中报道的意外的cd45ra+cd123+cd303lo细胞群(32)。总之，本发明的数据表明，虽然前dc和pdc共有一些表型特征，但它们可以通过其几种标志物的差异表达来分开，包括cd33、cx3cr1、cd2、cd5和cd327。pdc是真正产生ifnα的细胞，但报道的pdc的il-12产生和cd4+t细胞同种异基因刺激能力可能归因于可以产生cdc1和cdc2的“污染性”前dc。
定向的前dc子集的鉴别和表征
鼠前dc群含有未定向和定向的前cdc1和前cdc2前体(7)。因此，使用微流体scmrnaseq来确定对于人血液前dc是否也是如此(图14a：分选策略，图14b和c：工作流程和质量控制，表4：表达基因的数量)。
使相对于图1a至g所用的mars-seq策略的其他单细胞基因表达数据(250万读数/细胞和每个细胞平均检测到4,742个基因，分别相对于60,000个读数/细胞和每个细胞平均检测到749个基因)进行cmap分析，其计算每个单个细胞的cdc1或cdc2特征基因转录物的富集程度(20)(图3a)。在92个分析的前dc中，25个细胞显示出cdc1基因表达特征的富集，12个细胞显示出cdc2基因表达特征的富集，55个细胞未显示与任一cdc子集的转录相似性。
进一步的mpath分析显示，这些55个“未引发的”前dc与cdc1引发的和cdc2引发的前dc在发育上相关，因此它们的基因表达模式落在通过cmap的cdc1和cdc2特征分数之间(图3b和图15)。这些数据表明，如在小鼠中观察到的(7)，人前dc群含有向cdc1和cdc2谱系表现出转录物组引发的细胞。
有趣的是，虽然位于这三个簇交叉点的细胞(图3d)表达的cd123水平低于前dc，但却高于分化的cdc(图3c)，它们还表达高水平的前dc标志物(图3d和图16a)。可能这些cd45ra+cd123lo细胞是分化为cdc1或cdc2的定向前dc(图3e)。wanderlust算法(34)根据细胞成熟度将细胞录入构建的轨迹，其证实了前dc(早期事件)、cd45ra+cd123lo细胞(中间事件)和成熟cdc(晚期事件)之间的发育关系(图3f)。pbmc的流式细胞术鉴别了cd123+cadm1–cd1c–推定的未定向前dc，以及剩余cd45ra+细胞内推定的cadm1+cd1c–前cdc1和cadm1–cd1c+前cdc2(图3g和图16b)。这三个群体在脾中也存在，并且更丰富(图16c)。
重要的是，从pbmc分选的前dc子集的体外培养物不产生任何cd303+细胞(其可以是未分化的前dc或分化的pdc)，而早期前dc产生两种cdc子集，并且前cdc1和前cdc2分别仅分化成cdc1和cdc2子集(图3h，图16d和图17)。
扫描电子显微镜证实，早期前dc在外观上比pdc大且粗糙，并且定向的前dc子集非常类似于它们的成熟cdc对应物(图3i和图18a)。
通过流式细胞术对血液前dc进行分型(图18b)确定了在早期前dc向前cdc1/2和分化的cdc1/2发育的整个过程中转变标志物表达的模式。具体而言，并行获得cd45ro和cd33，同时丧失cd45ra；cd5、cd123、cd304和cd327由早期前dc大量表达，由前cdc1和前cdc2中等表达，并且就算是由成熟cdc和pdc表达也会很少；当早期前dc定向于cdc2谱系时获得fcεri和cd1c，同时丧失btla和cd319表达；早期前dc具有cd141的中等表达，其随cdc2分化下降，但在定向于cdc1的过程渐增，同时一些前cdc1已经开始表达clec9a；以及早期前dc和前cdc1表达调节cdc谱系发育的转录因子irf8和irf4(2,3)，而前cdc2仅维持irf4表达(图18c)。
接下来从血液中分选前dc和dc子集，并进行微阵列分析以确定它们的整个转录物组。微阵列数据的3d-pca分析表明，pdc沿水平pc1轴与其他前dc和dc子集明显分开(图4a和图19)。pc2轴和pc3轴的组合表明，前cdc1占据了早期前dc和cdc1之间的位置，并且尽管cdc2和前cdc2表现出相似的转录物组，但是前cdc2沿着pc3轴位于cdc2和早期前dc之间(图4a)。
在早期前dc向cdc分化期间siglec6(cd327)、cd22和axl转录物丰度的逐渐减少也反映在蛋白质水平上(图4f)。参与dc子集分化和/或成熟的关键转录因子表现出其表达沿着从前dc向成熟cdc的分化途径渐进变化(图4g)。最后，途径分析表明，前dc相对于pdc表现出cdc功能的富集，并且与成熟cdc相比维持在相对不成熟的状态(图22)。
dc个体发育的无监督作图
外周血中lin–cd123+细胞的isomap分析鉴别了两个平行谱系，对应于前dc和pdc，其中未检测到cdp群(图5b)。从图5a(bm，簇#1和#2)和图5b(血液，簇#6)的isomap分析中提取的前dc的isomap和表型图分析揭示了三个由唯一标志物表达模式(图23b和c)定义的不同前dc子集(图5c)。
总之，通过cytof追踪从bm到外周血的dc发育阶段，其证明bm中的cdp群分成两个途径，在血液中发育成前dc或pdc(图5a至c)。这个前dc群是异质的，并且作为血液和bm中可检测的不同子集存在(图5c，和图23b和c)。此外，揭露了血液和bmpdc中有趣的异质性，这需要进一步研究(图6c，和图23d和e)。
验证用于mars-seq单细胞转录物组数据归一化的下采样阈值
由于rna输入材料的量低，在单细胞rna测序实验中预期单细胞转录物组质量方面的高度差异。这一警告需要严格的质量控制，以避免低质量单细胞转物录组引入的偏差。因此，在单细胞转录物组学中，通常的做法是去除低质量转录物组以确保无偏见的且生物学上有意义的分析(59,60)。已经使用不同的策略来滤除低质量细胞，包括根据经验确定的用于细胞过滤的截止值(59)，用于归一化和过滤低质量细胞的下采样策略(15)，以及来自600umi/细胞或400umi/细胞的各种过滤截止值(15)，每个细胞的分子计数<500(61)和umi/细胞<200(62)。据我们所知，在任何这些研究中都没有报道数学上确定的截止值。由于这些先前的研究是在小鼠细胞上进行的，并且必须在相应的数据集内建立单细胞数据中的质量过滤器，本方法已经适应人细胞的过滤策略。为了测定当前数据集的质量阈值，使用几种诊断来估计分子计数下采样的最佳截止值。首先，可视化分子计数的累积分布，其中x轴上的细胞通过降低umi计数来排序(图6c)。在这里，在某个区域，每个细胞的分子计数数值有一个强烈下降期。该区域对应于每个细胞400-1200个umi之间的一系列分子计数。用于判断客观阈值的下一个度量(图6d)是所有细胞的分子计数分布。许多细胞条形码的分子计数<650-这些细胞条形码最可能代表当前mars-seq数据集的背景信号。具有一定数量分子的细胞条形码的数量随着每个细胞的分子计数增加而减少；通过这种可视化，确定了在分布中可能用作过滤和归一化的客观阈值的自然断点，因为这些断点标记了数据结构和质量的变化，并指示了从背景到信号的转变，或从低质量转录物组到高质量转录物组的转变。在此，确定了三个值得注意的点(图6d)，其对应于每个细胞650(b)、1,050(r)和1,700(g)的分子计数。为了客观地确定这些点中的哪一个代表数据质量从低质量转录物组到高质量转录物组的转变，需要确定转折点(图6d)。在密度图(图6d，上图版)中，三条线(g、r、b)是密度函数的斜率(密度的一阶导数，图6d，中间图版)突然变化的断点。在b线上，向下斜率(一阶导数)从非常陡峭变为不太陡峭，因此二阶导数在此点时最高。类似地，在r线上，向下斜率从不太陡峭变为更陡峭，因此二阶导数最低。基于这些观察，通过二阶导数确定了三个转折点(图6d，下图版)。当应用650的截止值时，每个细胞的分子计数数目太低，并且主成分分析(pca；图6e)可能无法区分三个dc群——浆细胞样dc(pdc)和常规dc(cdc)子集cdc1和cdc2。当应用1,700的截止值时，保留的细胞数量太少。因此，1,050的截止值是所分析的细胞数量(通过下采样归一化过滤后保留的细胞)与细胞中分子计数的数目(通过下采样丢弃分子计数后剩余的基因表达信息)之间的最佳权衡。
为了确保所选分子截止值的数据再现性、稳定性和独立性，使用650、1,050、1,700和2,350分子计数的截止值模拟初始分析(图6e)。如果使用pca对数据进行降维，则所有四个所选的模拟值都表现出相同的一般数据拓扑，从而证明生物数据结构是稳健的并且与过滤阈值无关。此外，过滤阈值对前两个主成分内基因负荷的影响是相关的。下采样至1,050分子计数的数据集的主成分1(pc1)与下采样至650或1,700分子计数的数据集的pc1高度相关(皮尔逊(pearson)分别为0.996和0.999)。pc2也是如此(皮尔逊分别为0.960和0.925)。这些结果表明，所选择的1,050的滤波截止值具有代表性和且是客观导出的。
通过两个独立的实验(run1和run2)生成本公开获得的mars-seq数据，将它们组合用于进一步的数据分析。归一化后，评估run1中相对run2所有基因的平均分子计数之间的相关性(图6f，其显示在两次运行中，平均分子计数之间的高度相关性(r＝0.994))。在评估批处理效果时，确保运行不决定聚类本身非常重要。绘制了t分布随机邻域嵌入(tsne)值以及它们的密度估计值的图(图6g)(run1和run2的细胞的比例相等)。该分析表明一般分布不受运行控制，因此聚类也不受运行控制，这与观察结果一致，即当前聚类鉴别了与三个dc群(pdc、cdc1和cdc2)明显对应的生物学上合理的群组(图1a)。因此，观察到的簇不是由运行之间的差异来解释，而是由生物学来解释。
在两次运行中，正如通过聚类所确定的，比较了细胞类型的频率(图6h)。这表明不同簇中细胞之间的比例在两次运行之间是相当的。值得注意的是，在两次运行中，所述比率不需要相同(61)。此外，该分析表明，没有簇在单个运行中占据主导地位。由于我们从一个大的总体中采集相对较小的样本，预计细胞类型的频率在运行之间显示出自然变化，这可能解释了细胞频率的轻微变化。
使用无监督scmrnaseq和cytof分析，揭示了单细胞水平上人dc谱系的复杂性，揭示了血液中两个谱系的具有cdp的bm中开始，在前dc和pdc潜能的出现点处趋异，并最终成熟的连续分化过程。
先前使用传统的基于表面标志物方法的研究表明在pbmc中存在较小的前dc群(9)，但是在此采用的高维技术和无偏分析的组合表明这个较小的群被显著低估：由于目前的结果揭示前dc群与breton及其同事(9)在pbmc的cd117+cd303-cd141-部分中所观察到的群重叠，但是是外周细胞中最初估计的细胞数量的10倍以上，并且相当多样化(图11c)。
最近在小鼠中的工作发现了bm中未定向的和子集定向的前dc子集(7,35)。在这里，类似地鉴别了人pbmc、脾和bm中三个功能上和表型上不同的前dc群，它们是：未定向的前dc和两个子集定向的前dc群(图24和图25)。根据从bm向外周连续分化的概念，bm的前dc群中未定向细胞的比例高于血液中的比例。总而言之，这些发现支持dc发育的两步模型，据此，中心转录物组子集特异性程序从cdp阶段开始印记在dc前体上，从而赋予核心子集身份而不管最终组织目的地如何；在该过程的第二步中，发生外周组织依赖性编程以确保位点特异性功能和适应(7,35)。
偏分析的一个重要方面是，并不将细胞基于有关细胞表面表型的先入之见排除在考虑之外。发现前dc表达大多数经典定义的pdc的标志物，例如cd123、cd303和cd304。因此，依赖于这些标志物鉴别和分离pdc的任何策略都会无意中包括cd123+cd33+前dc。虽然这需要重新考虑pdc群生物学的某些方面，但它也可以解释早期的发现，包括：pdc培养物具有cdc潜能并获得cdc样形态(10,11)，如最近在小鼠bmpdc中观察到的(36)；pdc通过产生ifnα和il-12介导th1免疫(10,37-41)；pdc表现出天然t细胞异基因刺激能力(30,39)；和pdc表达共刺激分子并以ifnα分泌为代价表现出抗原呈递/交叉呈递能力(37,42)。
这些观察结果可能归因于这些研究所描述的pdc群中未检测到的前dc，并且实际上已推测，在这些早期研究中观察到的il-12产生可能是由于存在污染性cd11c+cdc所致(43)。本公开通过从cx3cr1-cd33-cd123+cd303+cd304+“纯”pdc中分离cx3cr1+cd33+cd123+cd303+cd304+前dc并证明pdc可能不极化或诱导天然cd4t细胞增殖解决了这种可能性，而前dc具有这种能力。因此，在未来的研究中，特别是在使用商业pdc分离试剂盒时，将前dc排除在pdc群之外是至关重要的。最后，如果剥夺pdc的所有cdc特性，就出现它们是否真正属于dc谱系，或者更确切地说它们是否是一类独特的先天性产生ifn-i的淋巴样细胞的问题。bmcd34+cd123hicdp群是否也是独立的真正cdc祖细胞和pdc祖细胞的混合物，还有待证明。
除了鉴别前dc之外，目前的数据揭示了循环的成熟dc群中先前未曾认识的转录和表型异质性。这在cdc2和pdc的情况下尤为明显，cdc2和pdc在单细胞rnaseq分析中被分组为多个mpath簇，并且在cytof数据的tsne分析中表现出出显著的分散和表型异质性。cytof数据的isomap分析通过说明bm(包括可能是前pdc的中间细胞)中从cdp向cd2+pdc的进行性表型转变，还揭示了另一个pdc异质性水平。是否存在循环的前pdc群体仍有待作出结论。最后，定义指导未定向的前dc分化为cdc1或cdc2的机制，或将这些细胞维持于其在健康和疾病中的初始未定向状态的机制，可能导致开发调节这种分化过程的新治疗策略。
本公开内容提供了前dc细胞对r5和x4向性病毒的hiv-1感染敏感(图34)，并且在存在vpx(病毒蛋白x)的情况下感染增强(图3)。35)。还公开了用cd169抗体预处理诱导前dc的hiv-1感染减少，同时所述抗体显示出针对x4病毒的较高效力(图36)。
图37提供了除了对hiv-1感染最敏感之外，在存在vpx的情况下，感染的前dc细胞还能够将病毒传输至作为hiv-1感染的主要靶标的活化cd4t细胞。因此，前dc可能是hiv-1治疗的新靶标。
图38显示循环前dc子集在各种炎性疾病状态例如扁平苔癣、特应性皮炎、牛皮癣和肥胖中的比例增加。此外，癌症和传染病也显示出前dc增加(图38)。而且，如图38所示，在系统性红斑狼疮(sle)中循环前dc的比例与sledai分数相关，sledai分数是疾病活动的量度。因此，还提供了基于检测前dc群的变化诊断或预测局部或系统性炎性、自身免疫性、传染性、代谢性疾病/疾病状态进展的方法。
总之，通过cd135和hla-dr的表达鉴别了人血液和组织dc及其在bm中的前体。使用几种集成的高维度分析技术(使用单细胞mrna测序和飞行时间质谱或cytof的细胞术的质谱流失细胞术)，人血液的cd135+hla-dr-部分。这些方法取代了传统的基于表面标志物的方法，并在常规定义的pdc群中鉴别了前dc群。目前的用于dc祖细胞的标志物组合以前从未描述过，并且允许区分前dc子集与循环pdc；实际上，到目前为止，所有有关pdc的实验观察都是在存在污染性前dc的情况下进行的。这些前dc具有独特的表型和先前归因于pdc的不同功能特性。通过将本公开的分析扩展到血液和bm中的所有dc群，鉴别了由bm产生的整个dc谱系，并揭示了前dc向不同dc子集的转录启动。这些数据提供了对dc异质性和个体发育的新见解，并突出强调了研究dc子集特异性靶向的治疗潜力的未开发途径。
