1、第十章 植物原生质体培养,原生质体（Protoplast,1880, Hanstein：质壁分离时，能够与细胞壁分开的那部分细胞物质。 含义：去掉细胞壁的由质膜包裹、具有生活力的裸露细胞,微 丝,叶绿体,线粒体,质 膜,液 泡,细胞核,内质网,微 管,细胞壁,高尔基体,植物细胞模式图,细胞壁由三种主要成分构成 纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5,一、原生质体培养发展简史及其意义,1、发展简史,1892年：Klercker机械法(利刃)分离原生质体； 1960年： 1960年英国诺丁汉大学Cocking 教授率先利用真菌纤维素酶，制备了大量具有高度活性可再生的番茄幼根细胞原生质体； 192、68年：纤维素酶和果胶酶投入市场； 1968年：Takebe首先用商品酶进行原生质体分离：烟草叶肉原生质体，两步法和一步法,1971年：Takebe培养烟草叶肉原生质体，首次获得再生植株。 1993年有49个科、146个属的320多种植物，经原生质体培养得到了再生植株。其趋势主要是农作物和经济植物，从一年生扩展到多年生，从草本到木本、从高等植物到低等植物，食用菌、藻类、大豆、棉花、油菜、水稻、玉米、柑桔、猕猴桃、桃、苹果、马铃薯、胡萝卜、黄瓜、杨树、云杉等； 1986年：Spangenberg单个原生质体培养成功,2、原生质体培养的意义,1）为细胞融合奠定基础。 有性杂交不能进行细胞质交流,23、）是遗传工程的理想受体。 能够直接摄取外源DNA，细胞器甚至微生物,Isolated protoplast are capable of ingesting foreign material into the cytoplasm. This material includes the introduction of nuclei, chloroplasts, mitochondria, DNA, plasmids, bacteria and viruses,原生质体也具有全能性,原生质体是分子水平和细胞水平上研究遗传信息动态的结合点,3）理论研究,细胞壁再生、细胞膜离子转运、病毒侵染,因为细胞4、壁不仅具有保护功能，还参与细胞的生长和分化等生命活动。 但是必须指出：原生质体必须再生出细胞壁才能继续发育,一）设备与工具 除了需要组织培养的设备和工具之外，还需要一些用具。 1、倒置显微镜 荧光显微镜 反照相设备 普通显微镜：原生质体或细胞培养密度（采用血球计数板） 倒置显微镜：观察培养皿、培养瓶或滴瓶中的培养物 荧光显微镜：检查原生质体活性及去壁情况,二、原生质体的分离,2、细菌过滤器 0.45m的滤膜可以滤去细菌和病毒 （1）可用抽滤瓶接真空泵抽滤灭菌 （2）可用注射器推压过滤灭菌 3、离心机 提纯原生质体500r/min离心3-5min 制备酶液用2500r/min离心10min,二）5、 分离方法 机械法：利刃机械切割 酶解法：果胶酶和纤维素酶处理,1、Machanical isolation,Cut plasmolyzed tissue and subsequent deplasmolysis results in expansion and release of the protoplasts from the cut ends of the cell,In practice this technique is difficult and the yield of viable protoplasts is meager. One advantage, however, 6、is that the deleterious effects of the wall-degrading enzymes on the metabolism of the protoplasts are eliminated,从高度液泡化的细胞,机械法：细胞置于一种质壁分离介质中，然后利用利刃切割，有些质壁分离的细胞只被切去了细胞壁，从而释放出完整的原生质体,缺点：a.产量低 b.由分生细胞和其他液胞化程度不高的细胞分离原生质体时不适用,2、Enzymatic isolation,双子叶外植体/培养细胞,单子叶植物胚性细胞,2-1 材料 获得高质量的原生质体，应选择生长旺盛的植物体幼嫩部分。7、叶肉细胞分离原生质体，来源方便，有明显的叶绿体，便于在融合中认识。 但禾本科叶肉原生质体往往不能分裂,因此常采用悬浮细胞作为分离原生质体的材料，最适宜的细胞是处于对数生长早期的细胞,植物组织外植体 培养材料：培养细胞、悬浮培养细胞、愈伤组织等,材料选择的注意事项,1）选择具有形态分化潜力的材料，使原生质体经培养后容易诱导器官的发生。 2）选择经酶处理后可以得到大量原生质体的材料，使原生质体的产量维持较高水平。 3）经酶处理后原生质体稳定性好，不易破碎。 4）所得到的原生质体活性高，可持续分裂,材料来源影响原生质体产量和活力,最简单、最普遍的来源叶片，可以分离出大量的比较均匀一致的细胞，而又不致8、使植物遭到致命破坏。叶肉细胞排列疏松，酶的作用很容易到达细胞壁,由叶片制备原生质体， 植株的年龄和生长条件非常重要： A.温室或生长室栽培的叶片：低光照强度，短日照，2025，相对湿度6080%，充足的氮肥,B.离体培养的叶片：植物原生质体产量取决于细胞的生长速率和生长时期。频繁继代的悬浮培养物以及处于对数生长早期的细胞，是最适宜的供体材料,2-2 酶的种类和浓度,纤维素酶（Cellulase） Onozuka R-10 果胶酶（Pectolyase）Y-23 半纤维素酶（Hemicellulase） 对幼叶来说，酶浓度较低：0.5-1纤维素酶，果胶酶(0.2-0.5); 酶量少 对愈伤组织、9、悬浮细胞：纤维素酶、果胶酶的浓度要提高到1或2。酶量大,酶液PH值：5.4-5.8 因为PH高，酶活性低 PH低，原生质体损坏多,原生质体分离的情况在很大程度上取决于所用酶的性质和浓度。 纤维素酶消化细胞壁纤维素 果胶酶主要是降解中胶层 半纤维素酶,酶的活性与pH有关。 酶活性的最适温度为4050。 酶的浓度和酶处理持续时间须经若干次实验后才能决定。 酶溶液中保温时间从30min20h,酶溶液的容积和植物组织数量之间关系也可影响原生质体产量。 一般来说，每1g组织用10ml酶溶液常可产生令人满意的效果,2-3 酶液渗透压,裸露的原生质体必须维持在一定的渗透压下，才既不涨破，又不因过度收缩而破坏10、内部结构。因此在酶液中须加入渗透压稳定剂来代替细胞壁对原生质体起保护作用。 常用的渗透压稳定剂是糖醇系统，包括甘露醇、山梨醇、葡萄糖、蔗糖等。 目前大多数使用甘露醇或山梨醇，它们能稳定地维持渗透浓度。浓度一般为0.4-0.8 mol/L。而蔗糖等易被原生质体吸收利用，降低渗透浓度，故不常用,在合适渗透压溶液中，新分离出来的原生质体看上去都是球形的。 原生质体在轻微高渗溶液中比在等渗溶液中更稳定。 较高水平的渗透压可以阻止原生质体破裂和出芽，同时也会抑制原生质体的分裂,用非电解质作为渗透压稳定剂，常要在酶溶液中补加某些盐类，尤其是CaCl2，以便提高质膜的稳定性,2-4 材料预处理 (暗处理，预11、培养和低温处理) 在酶处理前，常把供体组织置于合适浓度的稳压液中，使细胞预质壁分离约一小时后再用酶液处理。 原因：预质壁分离可使胞壁内表层充分暴露，增加胞壁降解酶与胞壁的接触面而提高胞壁降解速度；降低原生质体内电解质渗漏，防止在分离期间外来酶被吸入细胞内，降低原生质体对酶液中可能存在的有害影响的敏感，提高原生质体的稳定性和存活率,要保证酶解充分进行，必须促使酶液渗入到叶片细胞间隙去，采用方法有： A.撕去叶片下表皮，然后以无表皮一面向下，使叶片漂浮在酶溶液中。 B.撕不掉或难撕的叶片，可把叶片或组织切成小块，投入到酶溶液中，与真空渗入结合，效果更好。 C.用金刚砂摩擦叶的下表面,2-6 其它,12、酶液中加入葡聚糖硫酸钾、CaCl2等盐类,保护细胞膜、提高原生质体稳定性和活力,2-5 酶解处理的条件 光：一般黑暗下静止进行； 温度：25，兼顾原生质体及酶活性； 时间：几小时到几十小时，太长不利于原生质体的活性，一般24小时。如烟草叶片酶处理2小时后叶肉细胞解离完毕,2-7 原生质体分离过程：一步法（以烟草叶片为例,第一步：预处理即对烟草植株限制供水 第二步：取幼叶常规表面消毒后在无菌条件下剥去外表皮切成4cm的小块 第三步：制作混合酶液（纤维素酶2%和果胶酶0.5 % ）并加入的0.7 mol甘露醇0.1 m mol CaCl2. PH5.6 第四步：将小块烟叶放入混合酶液25 处理8113、0小时 第五步：过滤、离心、洗涤（ 0.7 mol甘露醇液含0.1 m mol CaCl2 ）。如此23次、得原生质体,图示原生质体分离过程（以叶片为例,三） 原生质体纯化,酶解处理后得到混合液包括原生质体、细胞团和组织碎片等，必须将杂质和酶液除去，才可以继续培养。 原生质体纯化方法有：离心沉淀法，漂浮法，接口法三种,1、 离心沉淀法,原理：应用原生质体的比重大于溶液，离心后原生质体沉于底部。 步骤：第一步原生质体溶液用400目网筛过滤。 第二步离心（5001000r/min离心56min）。 第三步吸取上清液，用洗涤液（含甘露醇）重新悬浮，再离心沉淀。如此23次。 第四步用原生质体培养液洗114、次，收集原生质体,洗涤液成分：0.45mol/L甘露醇， 10mmol/LCaCl2 H2O, 0.7mmolK H2PO4, 洗涤液pH： 5.6,例如,1）将镍丝网滤出液置于离心管中，在75100g下离心23min后弃去上清夜。再把沉淀物重新悬浮于清洗培养基中，在50g下离心35min后再悬浮，如此反复3次,常用原生质体清洗培养基为CPW盐溶液，成分为（mg/L）KH2PO4(27.2)，KNO3(101.0)，CaCl22H2O(1480.0)，MgSO47H2O(246.0)，KI(0.16)，CuSO45H2O(0.025)，pH5.8,2）将悬浮在少量酶混合液或清洗培养基中的原生质15、体沉淀和碎屑置于离心管内蔗糖溶液的顶部，在100g下离心10min。碎屑下沉到管底后，一个纯净的原生质体带出现在蔗糖溶液和原生质体悬浮培养基的界面上,用移液管小心地将原生质体吸出，转入另一离心管中，反复离心和重复悬浮，再将原生质体清洗3次，最后以适当的密度悬浮在培养基中,2 、 接口法,以柑桔为例,原理：选两种不同渗透浓度的溶液，其中一种溶液的密度大于原生质体的密度，另一种溶液的密度小于原生质体的密度，原生质体介于两种溶液之间,只通过一次离心即可得到不混有酶和碎屑的完整无损的原生质体,在离心管中依次加入溶于培养基中的500mmol/L的蔗糖，再加入一层溶于培养基中的140mmol/L蔗糖和3616、0mmol/L山梨醇，最后是一层悬浮在酶溶液中的原生质体，其中含有300mmol/L山梨醇和100mmol/L CaCl2，经400g5min离心后，刚好在蔗糖层之上会出现一个纯净的原生质体层，而碎屑则移到管底,3、 漂浮法,原理：应用渗透剂含量较高的洗涤液使原生质体漂浮在液体的表面。 洗涤液：3%蔗糖 + 0.4mol/L甘露醇+ 1480mg/LCaCl22 H2O ，或11%23%的蔗糖溶液,原生质体分离纯化流程图,四） 原生质体活力测定,孢质环流法作为进行活跃代谢的指标 以氧的摄入量为指标 以光合活性做指标 以完整的质膜排斥伊凡蓝的能力做指标。 FDA测原生质体活力的原理,FDA染色测17、定原生质体,取纯化后的原生质体悬浮液0.5ml，置于小试管中，加入贮存于0 ，含2mg/L的FDA的丙酮溶液，最终浓度为0.01%，室温下5min后观察，绿色荧光的为有活力的，无荧光的为无活力的,三、原生质体培养,固体包埋培养 液体浅层培养 固液培养,1、固体包埋培养,原生质体纯化后，离心，用培养基稀释至一定密度，再与0.6%琼脂或低溶点琼脂糖（37C左右）混合，培养于培养皿中,优点：原生质体位置固定不变，可跟踪观察某一个体发育过程。用琼脂糖代替琼脂可以提高植板效率，特别是在琼脂培养基上不易发生分裂的原生质体。易于统计原生质体的分裂频率和植板效率。 缺点：操作要求较严格，尤其是琼脂糖与原生质体18、悬液混合时的温度必须合适，添加渗压剂和转移愈伤组织时操作复杂,1-1、饲养层培养,方法一：X-射线杀死原生质体，与生活力正常的原生质体混合，加入0.6%琼脂，制成混合液，培养于培养皿中,方法二：X-射线杀死原生质体，与0.6%琼脂混合，在培养皿中铺成平板，作为饲养层，再将生活力正常的原生质体与0.6%琼脂混合，培养于饲养层上,1-2、共培养法,将生长迅速的原生质体培养物与难于培养的原生质体混合,前者为后者提供生长因素或成分未知但能促进生长的扩散型化学物质,例如：滤膜饲养法 将生长旺盛的悬浮细胞铺于琼脂糖培养基表面或包埋于琼脂糖培养基内部，经1至数天的生长后将孔径为0.45m的硝酸纤维膜铺于悬浮19、细胞上，再次将原生质体悬液滴于滤膜上进行培养。 滋养细胞的种类、滤膜的种类和孔径等影响培养效果,2、液体浅层培养,2-1 液体浅层培养：将含原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的伤害较小，且便于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：原生质体在培养基中分布不均匀，常常发生原生质体之间的粘连现象或局部密度较高而影响进一步的生长和发育，并难以定点跟踪观察单个原生质体的发育过程,2-2 微滴培养：将0.1ml或更少的原生质体悬浮液用滴管滴于无菌且清洁干燥的培养皿底部，封口后进行培养。 优点：可用于较多组合的试验，亦可进行融合体及单个原生质体培养。 缺点：原生20、质体分布不均匀，小的微滴极易挥发,当植板在琼脂培养基上时，某些物种原生质体不能进行分裂。 经几天培养之后，可用有效方法把培养基渗透压降低。 如果原生质体群体中蜕变组产生了某些能杀死健康细胞的有毒物质，可以更换培养基。 经过几天高密度培养之后，可把细胞密度降低，或把感兴趣的细胞分离出来,液体浅层培养法的优点,3、固、液培养,培养皿底部铺一层固体培养基，在其上进行原生质体浅层培养,固体培养基中的成分可以向液体培养中释放，培养物产生的有害物质，也可被固体部分吸收,3-1 液体浅层-固体平板双层培养法： 在培养皿底部铺一层琼脂糖固体培养基，再将原生质体悬液滴于培养基表面。 优点：固体培养基中的成分可以21、缓慢释放到液体培养基中，如果在下层添加一定量的活性炭可以吸附一些毒害物质，促进原生质体分裂及细胞团的生成,3-2 琼脂糖株培养： 将含有原生质体的液态琼脂糖培养基用吸管以大约50l1滴滴于直径5.5cm的培养皿中，待其固化后再添加3ml液体培养基并于摇床上旋转培养，琼脂糖滴就处于液体培养基的包围中,四、原生质体再生（Regeneration,再生细胞壁,荧光增白剂（卡氏白，Calcafluor White,细胞由圆形变为椭圆形,第二次分裂,第一次分裂,第二次分裂,第三次分裂,多细胞团,肉眼可见细胞团,愈伤组织,1.细胞壁的形成,证明细胞壁再生方法： 失去球形外观 卡氏白（Calcafluor 22、white）染色 电镜观察,用卡氏白染色时，将原生质体置于浓度为0.01%或0.1%并含有适当渗压剂的卡氏白溶液中保温5min。经过清洗多余染料后，再把原生质体置于载玻片上渗透压合适的溶液中。卡氏白可以与细胞壁物质结合，能发出荧光,在活跃生长悬浮细胞的原生质体中微纤丝的沉淀要比已分化叶肉原生质体快得多 ，新形成的细胞壁由排列松散的微纤丝组成,壁的形成与细胞分裂有直接关系，凡是不能再生细胞壁的原生质体也就不能进行正常的有丝分裂,2.细胞分裂和愈伤组织的形成,凡能分裂的原生质体可在27天之内进行第1次分裂。 活跃分裂的悬浮培养细胞的原生质体进入第一次有丝分裂的时间比高度分化的叶肉原生质体要早,凡能23、继续分裂的细胞，经23周培养后可长出细胞团，再经2周之后，形成明显的愈伤组织，这时可以转移到不含渗压剂的培养基中,1）营养需要,常用MS、B5培养基，铵离子可降低分裂细胞的频率。 活跃生长的培养细胞原生质体要求较高的生长素/细胞分裂素，高度分化的叶肉细胞得到的原生质体要求较高的细胞分裂素/生长素,2）渗压剂,培养基渗透压一般是由500600mmol/L甘露醇或山梨醇调节。 原生质体再生出细胞壁之后，通过定期加入几滴不含渗压剂或渗压剂水平很低的新鲜培养基，可使培养基渗透压逐渐降低。最后将肉眼可见的细胞团转移至不含渗压剂的新鲜培养基中,3）植板密度,104105个/毫升，容易形成嵌合体。 利用KM24、8P复杂培养基可以适当降低植板密度,饲养细胞层法也可降低植板密度,用剂量5103伦琴的X射线照射原生质体，这一剂量能抑制细胞分裂，但并不破坏细胞代谢活性。 照射后将原生质体清洗23次，植板在琼脂培养基中。 将未经照射的原生质体铺在饲养细胞层上,4）培养条件,新分离出来的原生质体应在散射光或黑暗中培养，57天形成完整细胞壁后，细胞具备了耐光特性，才可转移到光下,5）植物材料,为了获得可重复的高植板效率，供体植株生理状况和原生质体质量非常重要，因而，供体植株应栽培在光、温、水可控条件下,3.禾谷类植物原生质体培养,发展历程分三个阶段,1）1980年以前探索和尝试阶段。 2）1980年转折点。珍珠粟25、中获得再生植株，是禾谷类原生质体培养的首次成功。 3）进一步扩大已获得再生植株的基因型和再生频率,4、植株再生,只有经过遗传饰变的细胞能获得完整植株时，才有可能通过对离体原生质体的遗传饰变进行作物改良,愈伤组织,细胞全能性是一个显性性状，因此，在一项体细胞杂交研究中，至少应有一个亲本的原生质体能表现全能性,1、原生质体定义 2、原生质体培养意义 3、原生质体分离、纯化方法,思考题,第十一章 体细胞杂交,体细胞杂交（somatic hybridization）即原生质体融合（protoplast fusion）为克服植物有性杂交不亲和性、打破物种之间的生殖隔离、扩大遗传变异等提供有效手段,体细胞26、杂交是以原生质体培养技术为基础，借用动物细胞融合方法发展和完善的一门新型生物技术。 不同原生质体之间互相融合，发生胞质基因重组和/或核基因重组,技术体系的3个环节： 原生质体融合；选择融合体； 杂种植株的再生和鉴定,原生质体融合意义,克服杂交不亲合 克服生殖器官败育 克服柑桔多胚,成 就,1972年 Carlson 建立第一株烟草体细胞杂种。 1975年柑桔原生质体培养成功； 现有苹果、猕猴桃、柿、枇杷、马铃薯、番茄、矮牵牛等作物的原生质体培养成功； 木本植物中柑桔最为成功,番茄+马铃薯,利用适当的物理或化学方法，可以将任何两种原生质体融合在一起；利用适宜的培养方法，可以由融合原生质体再生出杂27、种植株，即体细胞杂种（somatic hybrid）。 步骤：原生质体制备、原生质体融合、杂种细胞选择、杂种细胞培养、杂种植株再生以及杂种植株鉴定,一、融合方法,自发融合 (Spontaneous fusion) 诱发融合 (induced fusion) 物理和化学方法,NaNO3 高pH-高Ca离子 PEG 电场融合,一）自发融合,自发融合：在酶解分离原生质体的过程中，有些相邻的原生质体能彼此融合形成同核体（homokaryon），每个同核体包含2至多个核，这种原生质体融合叫。 由幼嫩叶片和分裂旺盛的培养细胞制备的原生质体中常见,二）诱发融合,在体细胞杂交中，彼此融合的原生质体应是不同来源28、的，即形成异核体（heterokaryon）。为了实现诱发融合，需要使用适当的融合剂，首先将不同的原生质体聚集到一起，然后使其粘连，从而实现原生质体融合,1.化学融合法,1.1 NaNO3法,1909年：Kuster证实引起亚原生质体融合 1970年：Power报道可重复控制原生质体融合 1972年： Carlson诱导原生质体融合获得首例杂种植株粉蓝烟草和朗氏烟草体细胞杂种,NaNO3的作用：中和质膜的负电荷，使原 生质体不再相互排斥，而紧密结合在一起 不足：诱导频率不高,A.将分离的原生质体悬浮在含有5.5%NaNO3和10%蔗糖的混合液中，然后在35水浴锅中处理5min； B.在约12029、0r/min下离心5min，使原生质体下沉,方法,C.收集原生质体，然后转入30的水浴锅中处理30min，期间大部分原生质体发生融合； D.用额外含有0.1%NaNO3的培养基轻轻取代混合液（不打破原生质体沉淀物）； E.将原生质体沉淀物轻轻打破，再用培养基洗涤2次，植板培养,缺点：异核体的形成率不高，尤其是利用高度液泡化的叶肉细胞原生质体融合时更加如此,1.2 高pH-高Ca离子法,1973年：Keller和Melchers用pH10.5的50 mMCaCl2溶液在37时，诱发烟草叶肉原生质体融合,优点：杂种产量高。 不足：高pH值对细胞有毒害作用,将两个原生质体的混合物放于含有0.05mo30、l/LCaCl2.2H2O和0.4mol/L甘露醇（pH10.5）的溶液中，在约200r/min下低速离心3min，然后将离心管保持在37水浴锅中40-50min。 融合时，Ca2+浓度非常重要，融合液的pH因植物的种类不同而异,方法,1.3 PEG法,PEG：Polyethylene Glycol（聚乙二醇,1974年： Kao KN和Michayluk采用此法大大提高融合频率。 1976年： Kao发现用高pH和高Ca结合融合频率更高。 用高钙强碱溶液代替培养基清洗PEG,PEG法特点,融合频率高 可重复性强,植物+植物 植物+动物 动物+酵母,诱发融合无特异性,毒性较低,PEG法原理,P31、EG是一种带负电性的高分子化合物，在原生质体融合中起到一种桥梁作用，可以使原生质体凝聚。在洗脱过程中，PEG将被洗掉，导致质膜表面电荷重排。粘连的质膜大面积紧密相连，电荷的重排队导致一个原生质体的负性电荷部位与另一原生质体的正性电荷部位相连而导致融合,先将两种不同的原生质体以适当比例混合，用2858%的PEG溶液处理1530min，然后将原生质体用培养基逐步清洗即可培养,方法,桥梁,示意图,A.将2种不同的原生质体以适当的比例混合后，用细吸管滴于培养皿底部，使其形成小滴状； B.在原生质体小滴上及其周围轻轻加上PEG溶液，处理1030min，使原生质体粘连融合； C.用高Ca2+ 和高pH溶液32、清洗PEG，再用培养基清洗去高Ca2+ 和高pH,1.4 PEG-高Ca2+-高pH,影响因素,A.PEG分子质量，一般15006000； B.原生质体密度，一般106个/ml； C.温度，3537； D.PEG的清洗应逐步进行,5）化学融合的机制,原生质体融合过程包括3个主要阶段： A.聚集阶段，其间2个或2个以上的原生质体的质膜彼此靠近； B.在很小的局部区域质膜紧密粘连，彼此融合，在2个原生质体之间的细胞质呈现连续状态，即出现“桥”； C.细胞质桥扩展，融合完成，形成球形的异核体（或同核体,植物原生质体表面带有负电荷，高Ca2+ -高pH能够中和正常的表面电荷，因此可使聚集原生质体的质膜33、紧密接触。 高温能促进质膜的融合 经PEG处理原生质体立即聚集,2.物理融合法-电融合法,Senda 1979年首先利用此方法实现原生质体融合,电融合仪中有一个融合室，小室两端装有电极，一定密度的原生质体悬浮液置于其中。在不均匀交变电场的作用下，使原生质体彼此靠近、接触，排成一条链，再给予一个点脉冲，使原生质膜发生可逆性电击穿，从而导致融合,电融合仪,电融合法原理,交流电场使原生质体表面电荷偶极化，沿着电极排列，形成串珠,施加直流电场后，形成串珠的原生质体在质膜接触处发生穿孔，开始遗传物质的交流,原生质体的融合过程包括3个主要阶段： 1)两个或多个原生质体的质膜彼此靠近； 2)局部区域质膜紧密34、粘连，彼此融合； 3)融合完成，形成球形的异核体或同核体,方法,A.将分离得到的原生质体用0.5mol/L甘露醇溶液（可同时加入0.001mol/L CaCl2.2H2O ）洗涤1次（1200r/min，4min离心）； B.收集原生质体，用这种洗涤液将原生质体密度调至28104个/ml，再以适当比例混合两融合亲本的原生质体,C.将混合原生质体悬浮液滴入电融合小室中，先给两极以交变电流，使原生质体沿着电场方向排列成串珠状，接着就给以瞬间高强度的电脉冲，使原生质体膜局部破损而导致融合； D.电融合处理后，将融合产物移入培养基中，可直接进行培养,影响因素,原生质体密度 电极液中CaCl2.2H2O35、浓度 交变电流的强弱 电脉冲的大小以及脉冲期宽度与间隔等,电融合的优点,A.操作简便、快速，融合同步性好，可在显微镜下观察融合全过程，整个过程的各种参数容易控制； B.一次可融合大量原生质体，特别适合于大量融合研究； C.融合产物多数只包含2个或3个原生质体，在各种参数适宜的情况下，还可进行特异融合； D.电融合不使用任何融合剂，无任何毒害作用，因而融合细胞无需重复洗涤，可直接用于培养,二、杂种细胞的选择,A.利用或创造各种缺陷型或抗性细胞系，用选择培养基将互补的杂种细胞选择出来； B.利用或人为地造成两个亲本间原生质体的物理特性差异，从而选出杂种细胞 C.利用或人为地造成细胞生长或分化能力的36、差异，从而进行选择,细胞系互补包括叶绿素缺失互补、营养缺陷互补、抗性互补等,1互补选择法,两次不同培养条件的培养） 第一次培养条件只适合于甲亲本而不适合乙亲本，一段时间后，生存下来的是：1)未经融合的甲亲本；2)甲甲融合的产物；3)有甲亲本基因存在的甲乙融合产物。 转入第二个培养条件，只适合乙亲本原生质体生长，甲原生质体死亡。 两次培养之后，能存活下来的只有具甲乙亲本基因并得到互补的杂种细胞,当非等位隐性基因控制的两个突变体细胞融合后，由于每一个亲本细胞贡献正常的等位基因，纠正了亲本对方的缺陷，使杂种细胞表现正常,当两个抗性系的原生质体融合时，每一个亲本 的药物敏感性被亲本对方的抗性所掩盖，因37、而两个单抗的亲本融合后产生双抗的杂种细胞，用相应的选择培养基就能将杂种细胞选择出来,2.利用物理特性差异的选择方法,原生质体的物理特性，如大小、颜色、漂浮密度等也可作为选择的依据。 对于不具备物理差异的原生质体，可以人为地进行处理以便选择,3.依据生长特性差异的选择方法,原生质体的植株再生能力是广为应用的选择依据，可将原生质体的植株再生能力看作显性性状，用来淘汰无再生能力的一方亲本，与其他选择方法相结合，将能再生的一方亲本淘汰，就可选择出杂种植株,细胞在培养基上的生长差异还可以人为地产生，如利用一些代谢抑制剂处理原生质体以抑制其分裂,异硫氰酸荧光素（FITC）和 异硫氰酸罗丹明（RITC） 分38、别发出绿色和红色,4. 荧光染料法 两个亲本原生质体在融合前用能发不同颜色荧光的荧光染料进行染色。 细胞分类器辨别和收集发两种荧光的异核体。 但仪器价格昂贵，不常用,三、杂种细胞培养和杂种植株再生,不少情况下，由于缺乏合适的选择系统，或者选择系统使用起来非常复杂，往往对杂种细胞不加以选择，而是将含有异核体、同核体、未融合原生质体的融合产物直接进行混合培养，待再生出植株后再对其杂种性进行鉴定，以确定真正的体细胞杂种,四、体细胞杂种的鉴定,形态学 细胞学 遗传标记,1.形态学鉴定方法,比较再生植株与融合亲本在形态上的异同 株高、株型、叶片大小、形状、气孔的大小与多少，花的形状、大小及颜色,2.细胞39、学鉴定方法,1）经典细胞学鉴定方法 （2）分子细胞学鉴定方法,1）经典细胞学鉴定方法,通过对植株染色体数目、形态等的细胞学观察来鉴定体细胞杂种。其中染色体数目的观察最常用。 一般来说，对称体细胞杂种的体细胞染色体数为融合双亲体细胞染色体数之和；非对称杂种染色体数在受体染色体数和双亲染色体数目之和之间,根据染色体数目进行鉴定时，也要考虑体细胞无性系的影响。如果融合双亲染色体形态差异较大，通过染色体形态观察也可以鉴别杂种,2）分子细胞学鉴定方法,基因组原位杂交（GISH）：利用各染色体组DNA同源性程度的差异，对某一染色体或某个物种的染色体组进行标记，同时用适量的另一物种总DNA作封阻，以减少或消40、除探针DNA与非同源或部分同源DNA的交叉杂交，提高了探针DNA与同源DNA杂交的机会,3.遗传标记,SSR RFLP 同工酶 RAPD AFLP,分析所鉴定植株是否具有融合亲本的遗传物质,再生植株同时具有亲本的带； 再生植株在一种情况下具有一个亲本的带，在另一种情况下具有另一个亲本的带,RAPD带型,RAPD带型,五、体细胞杂种的核型,只有少数是双二倍体，染色体数是两个亲本染色体数之和。 由于核质互作导致了与有性杂种不同的结果。 两个以上的原生质体发生了融合。 体细胞杂种倍数性水平的变异也可能是由原生质体的自发融合造成的，或是由原生质体供体细胞的细胞学状态造成的,在两个亲本中，只要一个亲本的染色体组确有一部分能够充分整合到另一亲本的染色体组，那么染色体的选择性丢失可能会有其好处,六、对称融合和非对称融合,1.对称融合,对称融合（symmetric fusion）是指融合时，双方原生质体均带有核基因组和细胞质基因组的全部遗传信息，是植物体细胞杂交最初采用的融合方法,一般来说，对称融合多形成对称杂种，结果在导入有用基因的同时，也带入了亲本的全部不利基因,2.非对称融合,非对称融合（asymmetric fusion）：是指一方亲本的全部原生质与另