pcr正向引物和反向引物图解长度

来源：蜘蛛抓取(WebSpider) 时间：2023-11-25 21:45 标签： 正向引物和反向引物图解
尽管引物设计是PCR实验成功的前提，但是蛮多小伙伴的实战经验稍显不足。今儿就向大家介绍2种引物设计方法。引 物 设 计尽管是老生常谈了，但是小编还是想先把引物设计的原则放出来(其实是复制粘贴啦，哪哪都有)。1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。2、不能形成2级结构。3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。5、碱基要随机分布，尽量均匀。6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。8、引物5‘端可以修饰。9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GC富集的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。10、引物3'端要避开密码子的第三位。11、引物整体设计自由能分布5'端大于3‘端。12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。原则忒多啦，小伙伴们，先别晕，看下方。方法一：PrimerBank法网址：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/index.html打开以上网址，进入PrimerBank网站界面，如下图个人觉得这是最便捷的引物获取方法，该网站可以非常迅速地检索到已经他人验证的引物序列及相关反应条件。图中第一个方框，一般选择NCBI Gene ID；第二个方框选择你所关注的物种，常用的就是Mouse和Human了，如果为其它物种，则选择All Species即可；第三个方框中需要输入你关注的基因ID号码。如何获取基因ID呢，这里就需要打开NCBI网站，选择Gene，并输入你的目的基因如p53 homo，选择第一个，可见其ID号为7157。如下图所示。然后将ID号7157输入上方PrimerBank网站的For text框中，并选择种属为人，点击Submit后，跳转页面如下。网站会自动推荐3对已经验证的引物，小伙伴们可以直接拿着用了。方法二：Ensembl+NCBI BLAST法很多人会推荐大家使用Oligo、PP或DNA man之类的，小编这里想推荐一个更好用的网站，Ensembl，非常实用。网址1：http://asia.ensembl.org/index.html网址2：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome首先打开Ensembl网站，选择物种为Human，检索基因为BRCA2（其它物种可在左下方箭头处寻找）。如下图所示。顺手点击Go，跳转至以下界面。由于我们要拿到转录组的序列，所以需要进一步点击左侧的Transcript筛选框。点击转录组筛选框后，可见以下界面，我们可以选择第一个。继续点进去，然后在左侧选择cDNA，点击后如下图所示。然后点击左侧的Configure this page，跳转界面中除了show exons勾选，其它全部不选择，勾选完后点击右上角的对勾符号。选择可转录为蛋白的序列，接着在页面中下方可以看到该序列的详细内容，不同颜色代表一个间隔的外显子。任意选择一对连续的不同颜色碱基。复制到一个word中，并且标记不同的颜色(事实上，也可以下载一个完整的序列文件)。然后计数不同颜色碱基的个数，下面会用到。接着就是NCBI BLAST验证过程了。打开上面提供的网站，按照下图所示进行填写，其它的默认就行。顺手点击页面下方的Get Primers，跳转后点击All，点击Sumit。得到的序列如下方所示，大家可以自行选择了。完结！撒花！
2021-12-28 09:05
来源:
维真生物
引物是指在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸，其本质是单链 DNA片段。PCR扩增产物的大小及扩增的靶序列在基因组中的位置是由引物限定的，因此，引物的选择对PCR 成功与否具有决定性意义。引物设计质量是影响PCR扩增成败的关键因素，一般要考虑以下几个问题：
① 引物长度一般16~30 bp为宜、20~24 bp为佳。引物长度较短一般会降低扩增特异性，但会提高有效性，扩增的产物种类会增多。
② G+C含量一般为40%~60%为佳，两条引物G+C含量应尽量相似，Tm最好接近，差异最好在1℃以内，最多不超过5℃。
③ 两个引物之间不应发生互补，特别应避免形成"引物二聚体"，如果无法避免，其3'端互补不应大于2个碱基，应尽量避免数个嘌呤或嘧啶连续排列，避免同源序列（尤其 6个碱基以上相同）。
④ 引物内部避免形成次级结构，尤其发卡结构，若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp，必要时应通过计算机进行结构分析。
⑤ 引物的延伸从3'端开始，3'端不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能，3'末端最后1个碱基最好是G或C。
⑥ 引物的5'端限定着PCR产物的长度，对扩增特异性影响不大，因此，5'端可以被修饰而不影响扩增的特异性。
⑦ 引物3'端不要终止于编码区城密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。
引物设计可借助于一些计算机引物设计软件方便地进行。目前用于引物设计的钦件有多种，其中Oligo6、Prmer5.0是非常方便且功能强大的引物设计分析软件。
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