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在转基因水稻种子中表达一种古细菌来源的葡萄糖淀粉酶
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3秒自动关闭窗口脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus sp.A4）部分糖基水解酶研究及其基因组序列初步分析--《中国农业科学院》2010年博士论文
脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus sp.A4）部分糖基水解酶研究及其基因组序列初步分析
【摘要】：
嗜酸菌是一类广泛分布在酸性环境中极其重要的微生物,然而目前对嗜酸菌的了解还十分有限。脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)作为典型的一个嗜酸耐热菌属,近些年来受到了极大的关注。本文从云南保山高温温泉出水处的土样中分离得到一株嗜酸嗜热的菌株,经16S rDNA比较鉴定,初步确定为脂环酸芽孢杆菌,命名为Alicyclobacillus sp. A4。生长条件实验表明:该株菌的最适生长温度在55–60°C之间,最适生长pH为3.0–3.5。用各种诱导培养基培养后,测到了多种糖基水解酶活性,表明该菌株为产水解酶系丰富的菌株。
在双酶法制糖工艺中,目前广泛应用的是高温淀粉酶和中温糖化酶。然而高温淀粉酶的最适作用温度和pH与中温糖化酶均不相同,需要反复调整pH值和温度。同时,高温淀粉酶不具备降解生淀粉的能力,需要对生淀粉进行糊化,因此造成了生产的较高能耗和环境污染问题。利用可溶性淀粉为碳源,从Alicyclobacillus sp. A4中分离纯化了一个酸性中温α-1,4-淀粉酶(AmyA4)。AmyA4的最适pH值为4.2;最适温度为75°C;在55–75°C范围内都具有很高的活性,这与工业上应用的糖化酶性质相似;同时AmyA4还具有很强的生淀粉降解能力。在模拟双酶法制糖工艺中,以生淀粉为底物,AmyA4在配合商业化糖化酶的作用下,可以达到96.7%的水解率,表明具有很大的应用潜力。
利用大麦葡聚糖为碳源,分离纯化了一个极端酸性β-1,4-葡聚糖酶(CelA4)。CelA4的最适pH为2.6,在酸性pH范围内保持稳定,对大麦β-葡聚糖,纤维素,燕麦木聚糖和甘露聚糖均具有催化活性,同时还能对胃蛋白酶有很高的抗性。在人工模拟胃液中,CelA4可以明显降低大麦豆粕饲料的粘度,具有猪饲料添加剂的应用潜力。通过基质辅助激光解吸离子飞行质谱(MALDI-TOF-MS)和全基因组序列分析,确定了CelA4的基因序列。CelA4编码715个氨基酸,与来源于Alicyclobacillus acidocaldarius第51家族的β-1,4-葡聚糖酶CelB有最高的一致性(44%)。CelA4具有三个明显的结构区,即信号肽区(0–39 AAs)、催化区(40–498 AAs)、和苏氨酸高含量区(499–715 AAs)。对全长的成熟蛋白CelA4F(40–715 AAs)和截短的葡聚糖酶CelA4T(40–498 AAs)分别进行了毕赤酵母的外源表达和性质测定。结果表明,重组的CelA4F和CelA4T具有和原酶CelA4相似的性质。在3.7L发酵罐上,截短的葡聚糖酶CelA4T获得了更高的表达量。SDS-PAGE和脱糖基化后分析表明,重组CelA4F和原酶CelA4一样都发生了截短的现象,苏氨酸高含量区对其表达量有明显作用。
对来源于Alicyclobacillus sp.A4的第九家族β-1,3(4)-葡聚糖酶基因(agl9A)进行了毕赤酵母的外源表达和性质测定。Agl9A与来源于A. acidocaldarius第九家族的葡聚糖酶具有最高的氨基酸一致性(48%)。纯化的重组Agl9A最适pH为5.8,最适温度为75°C,具有钙离子依赖性,对各种中性蛋白酶包括添加到啤酒酿造的蛋白酶Neutrase 0.8L有抗性。在模拟麦芽汁糖化条件下,无论是单独添加Agl9A,还是和木聚糖酶Xyn(商业酶)同时添加均能有效降低麦芽汁的过滤速率和粘度。上述性质表明Agl9A是一个优秀的葡聚糖酶,可应用于啤酒酿造中的葡聚糖降解。
对来源于Alicyclobacillus sp.A4的第十家族β-1,4-木聚糖酶(XynA4)进行了大肠杆菌的外源表达和性质测定。XynA4与来源于Geobacillus stearohermophilus第10家族的木聚糖酶有最高的氨基酸一致性(53%)。纯化的重组XynA4在pH7.0和55°C具有最佳活性,在pH值3.8–9.4范围内,能保持40%以上的最大酶活。该酶还在非常宽的pH范围(pH值2.6–12.0,80%)内保持稳定。由于XynA4具有良好的热稳定性和pH值稳定性,并且在很宽的pH范围内具有活力,因此它具有在造纸行业中应用的潜力。
鉴于脂环酸芽孢杆菌给饮料行业带来的巨大危害和对极端环境的特殊生长要求,并且其16S rDNA序列与已知全基因序列的A. acidocaldarius DSM 446一致性只有95%。因此对Alicyclobacillus sp. A4的全基因组进行了测序,并对测序结果进行了初步分析。结果表明:该菌与A. acidocaldarius DSM 446相似,有共线性。染色体基因组全长2,815,170 bp,编码2,884个基因,GC含量为46.5%。在染色体基因组编码的2,884个基因中,有2,359个基因(81.8%与A. acidocaldarius DSM 446的序列同源,平均一致性为65.4%。质粒基因组全长80,481 bp,编码88个基因,GC含量为52.1%。在质粒基因组编码的88个基因中,有58个基因(65.9%)与A. acidocaldarius DSM 446质粒pAACI01的序列同源,平均一致性为83.3%。对Alicyclobacillus sp. A4的分泌组蛋白进行了分析,结果表明有10.9%的序列被鉴定为具有明显信号肽序列。另外Alicyclobacillus sp. A4的全基因组共含有31条糖基水解酶序列,其中有6条蛋白序列具有明显的信号肽序列。
【关键词】：
【学位授予单位】：中国农业科学院【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：Q78【目录】：
Abstract8-19
第一章 绪论19-43
1 脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)的研究进展19-25
1.1 脂环酸芽孢杆菌的分离19-22
1.2 脂环酸芽孢杆菌的命名和分类22-23
1.3 脂环酸芽孢杆菌的鉴定23-25
1.3.1 形态学鉴定23
1.3.2 细胞膜脂肪酸组分分析23
1.3.3 甲基萘醌分析23
1.3.4 16S rRNA分析23-24
1.3.5 生理生化鉴定24-25
1.3.6 生长条件试验25
2 脂环酸芽孢杆菌的防控技术25-28
2.1 脂环酸芽孢杆菌属快速检测方法25-26
2.2 脂环酸芽孢杆菌属的防控技术研究26-28
3 木聚糖酶28-31
3.1 木聚糖酶的理化性质28-29
3.2 木聚糖酶的分类29
3.3 木聚糖酶的应用29-31
3.3.1 木聚糖酶在造纸工业中的应用29-30
3.3.2 木聚糖酶在饲料工业中的应用30
3.3.3 木聚糖酶在酿造工业中的应用30
3.3.4 木聚糖酶在其他方面的应用30-31
3.4 脂环酸芽孢杆菌属木聚糖酶的研究进展31
4 β-葡聚糖酶31-33
4.1 β-葡聚糖酶的研究进展31-32
4.2 β-葡聚糖酶的应用32
4.2.1 β-葡聚糖酶在啤酒生产中的应用32
4.2.2 β-葡聚糖酶在饲料生产中的应用32
4.3 脂环酸芽孢杆菌属β-葡聚糖酶的研究进展32-33
5 α-淀粉酶(α-amylase)33-37
5.1 α-淀粉酶的种类34
5.2 α-淀粉酶的分子结构34
5.3 α-淀粉酶的应用与展望34-35
5.3.1 α-淀粉酶在面包焙烤中的应用34-35
5.3.2 淀粉的液化和糖化作用35
5.3.3 纤维脱浆35
5.3.4 造纸工业35
5.3.5 α-淀粉酶在洗涤行业中的应用35
5.4 双酶法制糖工艺35-36
5.4.1 淀粉的糊化36
5.4.2 液化36
5.4.3 糖化36
5.5 现状36-37
6 脂环酸芽孢杆菌属基因组测序进展37-38
6.1 核酸测序技术的进展37
6.2 脂环酸芽孢杆菌属基因组测序进展37-38
7 分子克隆研究技术概述38
7.1 Tail-PCR技术38
7.2 简并PCR引物设计(Degenerate PCR)38
8 外源表达系统的介绍38-42
8.1 大肠杆菌表达系统概述38-39
8.1.1 对表达载体的优化39
8.1.2 对宿主细胞的改造39
8.1.3 提高mRNA的稳定性39
8.1.4 发酵条件39
8.2 毕赤酵母表达系统概述39-42
8.2.1 外源蛋白自身的影响40
8.2.2 启动子的选择40
8.2.3 信号肽的选择40-41
8.2.4 转录后翻译水平41
8.2.5 培养条件的影响41
8.2.6 阻止外源蛋白降解41-42
9 研究目的与意义42-43
第二章 脂环酸芽孢杆菌的筛选与产酶分析43-51
1 实验材料43-44
1.1 土样、菌株和质粒43
1.2 引物合成和核酸序列测序43
1.3 试剂盒、工具酶与生化试剂43
1.4 仪器43
1.5 培养基43
1.6 常用溶液43-44
2 实验方法44-45
2.1 脂环酸芽孢杆菌的筛选及分离44
2.2 菌株的鉴定44-45
2.2.1 菌落形态及生长条件的测定44
2.2.2 基因组DNA的提取44
2.2.3 16S rDNA的PCR扩增44-45
2.2.4 DNA凝胶回收45
2.2.5 DNA片段的连接、转化45
2.2.6 重组子的筛选45
2.3 产酶分析45
2.3.1 产酶培养45
2.3.2 酶活力测定45
3 结果与分析45-48
3.1 菌株的鉴定45-47
3.1.1 菌株的16S rDNA鉴定结果45-47
3.1.2 菌落形态及孢子形态观察47
3.1.3 菌株在不同温度及pH下的生长情况47
3.2 菌株A4 和A15 产酶分析47-48
4 讨论48-50
本章小结50-51
第三章 Alicyclobacillus sp.A4 酸性淀粉酶的分离纯化及其酶学性质研究51-61
1 实验材料51
1.1 菌株51
1.2 生化试剂51
1.3 仪器51
1.4 培养基51
2 实验方法51-54
2.1 α-淀粉酶(AmyA4)粗酶液的获得51
2.2 原酶AmyA4 的纯化51-52
2.3 淀粉酶活性测定52
2.4 分子量的测定52
2.5 纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定52
2.6 淀粉水分测定52
2.7 淀粉的转化率52
2.8 酶学性质52-53
2.8.1 最适pH和pH稳定性52-53
2.8.2 最适温度及热稳定性53
2.8.3 不同金属离子及相关化学试剂对淀粉酶的影响53
2.9 不同来源生淀粉的水解实验53
2.10 不同浓度土豆生淀粉水解实验53
2.11 双酶法制糖工艺研究53-54
2.11.1 土豆淀粉液化53
2.11.2 土豆淀粉糖化53
2.11.3 双酶法制糖工艺53-54
3 结果与分析54-58
3.1 来源于脂环酸芽孢杆菌的酸性淀粉酶AmyA4 的纯化54-55
3.2 淀粉酶的内肽质谱鉴定55
3.3 淀粉酶的酶学性质55-58
3.3.1 淀粉酶AmyA4 的最适作用pH及pH稳定性和最适作用温度及热稳定性55-56
3.3.2 金属离子及其它化学试剂对淀粉酶AmyA4 活性的影响56-57
3.3.3 不同来源生淀粉的水解实验57
3.3.4 不同浓度土豆生淀粉水解实验57
3.3.5 双酶法制糖工艺57-58
4 讨论58-60
本章小结60-61
第四章 Alicyclobacillus sp.A4 酸性葡聚糖酶的纯化和基因克隆研究61-83
1 实验材料61
1.1 菌株61
1.2 生化试剂61
1.3 仪器61
1.4 培养基61
2 实验方法61-69
2.1 原酶CelA4 粗酶液的获得61
2.2 原酶CelA4 的纯化61-62
2.3 分子量的测定62
2.4 葡聚糖酶转PVDF膜62
2.5 纯化蛋白的质谱鉴定与内肽序列的测定62
2.6 葡聚糖酶基因CelA4 的基因序列获得与分析62
2.7 葡聚糖酶基因成熟蛋白CelA4F和截短蛋白CelA4T的基因序列的克隆62-63
2.8 酶切与连接63-64
2.9 葡聚糖酶基因CelA4F和CelA4T在毕赤酵母中的表达64-65
2.9.1 重组表达载体的线性化64
2.9.2 毕赤酵母感受态细胞的制备64-65
2.9.3 电转化65
2.9.4 摇瓶中目的基因在毕赤酵母中的表达65
2.9.5 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵65
2.10 重组酶CelA4 的分离纯化及鉴定65-66
2.11 重组酶的脱糖基化实验66
2.12 酶学性质66-69
2.12.1 酶活单位定义66
2.12.2 葡萄糖标准曲线的制定66-67
2.12.3 蛋白含量的测定67
2.12.4 葡聚糖酶K_m值和V_(max)的测定67-68
2.12.5 葡聚糖酶的最适pH和pH稳定性的测定68
2.12.6 葡聚糖酶的反应最适温度及热稳定性的测定68
2.12.7 不同金属离子及相关化学试剂对葡聚糖酶的影响68
2.12.8 葡聚糖酶比活性测定68
2.12.9 底物特异性的测定68
2.12.10 抗蛋白酶能力测定68-69
2.12.11 葡聚糖酶在人工胃液中稳定性的测定69
2.12.12 葡聚糖酶在人工胃液中对大麦葡聚糖中还原糖的水解能力的测定69
2.12.13 葡聚糖酶在人工胃液中对大麦豆粕型日粮粘度的影响69
2.12.14 粘度的测定69
3 结果与分析69-78
3.1 来源于脂环酸芽孢杆菌的葡聚糖酶CelA4 的纯化69-70
3.2 葡聚糖酶的N端测序和内肽质谱鉴定70-71
3.3 葡聚糖酶的基因序列分析71-74
3.4 重组酶CelA4F和CelA4T在毕赤酵母中的表达74-75
3.4.1 具有葡聚糖酶活性的转化子的筛选74
3.4.2 发酵罐水平表达CelA4F和CelA4T74-75
3.5 重组酶CelA4F和CelA4T的分离纯化及鉴定75
3.6 葡聚糖酶的酶学性质75-78
3.6.1 葡聚糖酶CelA4 的pH及温度适用性和稳定性75-76
3.6.2 金属离子及其它化学试剂对葡聚糖酶CelA4 活性的影响76-77
3.6.3 葡聚糖酶CelA4 的反应动力学77
3.6.4 葡聚糖酶CelA4 的底物特异性77
3.6.5 葡聚糖酶CelA4 的抗蛋白酶能力测定77-78
3.6.6 葡聚糖酶CelA4 在人工胃液中的稳定性78
3.6.7 葡聚糖酶CelA4 在人工胃液中水解大麦葡聚糖能力78
4 讨论78-82
本章小结82-83
第五章 Alicyclobacillus sp.A4 第九家族葡聚糖酶的克隆，表达及性质分析83-96
1 实验材料83
1.1 菌株和质粒83
1.2 引物合成83
1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂83
1.4 仪器83
1.5 培养基83
1.6 常用溶液83
2 实验方法83-87
2.1 葡聚糖酶基因Agl9A序列的获得83-84
2.2 葡聚糖酶基因Agl9A序列的克隆84
2.3 酶切与连接84
2.4 重组表达载体的线性化84
2.5 毕赤酵母感受态细胞的制备84
2.6 电转化84
2.7 目的基因在毕赤酵母中摇瓶水平的表达84-85
2.8 重组酶Agl9A的分离纯化及性质测定85-87
2.8.1 酶活单位定义85
2.8.2 葡萄糖标准曲线的制定85
2.8.3 蛋白含量测定85
2.8.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳85
2.8.5 发酵罐水平重组酵母的高细胞密度发酵85
2.8.6 重组酶Agl9A的分离纯化85
2.8.7 重组酶Agl9A酶反应最适pH及pH稳定性测定85
2.8.8 重组酶Agl9A酶反应最适温度及热稳定性测定85
2.8.9 不同金属离子及相关化学试剂对重组酶Agl9A酶活影响的测定85
2.8.10 重组酶Agl9A对Ca~(2+)依赖性的测定85-86
2.8.11 重组酶Agl9A抗蛋白酶能力测定86
2.8.12 重组酶Agl9A比活的测定86
2.8.13 重组酶Agl9A的 Km和Vmax值的测定86
2.8.14 重组酶Agl9A对麦芽汁的水解实验86
2.8.15 过滤速率和粘度的测定86-87
3 结果与分析87-95
3.1 Agl9A基因序列的获得与分析87
3.2 重组酶Agl9A的纯化87
3.3 重组酶Agl9A的酶学性质研究87-93
3.3.1 pH与温度对重组酶Agl9A酶反应的影响87
3.3.2 不同金属离子及相关化学试剂对重组酶Agl9A酶活的影响87
3.3.3 重组酶Agl9A对Ca~(2+)依赖性的测定87-91
3.3.4 重组酶Agl9A抗蛋白酶能力测定91-92
3.3.5 重组酶Agl9A的K_m值和V_(max)测定92-93
3.3.6 重组酶Agl9A降低麦芽汁过滤速率和粘度的测定93
4 讨论93-95
本章小结95-96
第六章 Alicyclobacillus sp.A4 的木聚糖酶基因的克隆，表达及性质分析96-107
1 实验材料96
1.1 菌株和质粒96
1.2 生化试剂96
1.3 仪器96
1.4 培养基96
1.5 常用溶液96
2 实验方法96-100
2.1 原核表达载体pET-226(+)-XynA4 的构建96-99
2.1.1 木聚糖酶基因XynA4 的克隆96-97
2.1.2 DNA片段的回收和连接97
2.1.3 两步Tail-PCR方法获得基因XynA4 上下游序列97-98
2.1.4 pET-226(+)-XynA4 表达载体的构建98-99
2.1.5 酶切与连接99
2.1.6 重组质粒pET-226(+)-XynA4 转化大肠杆菌BL21(DE3)99
2.1.7 重组酶XynA4 在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达99
2.2 重组酶XynA4 的分离纯化及性质测定99-100
2.2.1 酶活单位定义99
2.2.2 木糖标准曲线的制定99
2.2.3 蛋白含量测定99-100
2.2.4 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳100
2.2.5 重组酶XynA4 的分离纯化100
2.2.6 最适pH及pH稳定性100
2.2.7 最适温度及热稳定性100
2.2.8 金属离子和相关化学试剂的影响100
2.2.9 重组酶XynA4 比活的测定100
3 结果与分析100-104
3.1 XynA4 基因的克隆与序列分析100-101
3.2 重组酶XynA4 在大肠杆菌中的表达101-102
3.3 重组酶XynA4 的纯化102-103
3.4 重组酶XynA4 的酶学性质研究103-104
3.4.1 pH与温度对重组酶XynA4 酶活的影响103
3.4.2 金属离子及化学试剂对XynA4 酶活的影响103-104
3.4.3 重组酶XynA4 的K_m值和V_(max)104
4 讨论104-106
本章小结106-107
第七章 Alicyclobacillus sp.A4 全基因组序列初步分析107-124
1 实验材料107
1.1 菌株107
1.2 培养基107
2 实验方法107-108
2.1 脂环酸芽孢杆菌A4 基因组DNA的提取107
2.2 脂环酸芽孢杆菌A4 全基因组测序107
2.3 基因组以及质粒ORF的预测和注释107-108
2.4 代谢途径108
3 结果108-121
3.1 菌株Alicyclobacillus sp.A4 的总基因组提取108
3.2 测序与组装108-109
3.3 染色体基因组序列的基本特征109
3.4 染色体基因组序列的代谢调控109-112
3.5 质粒基因组序列的基本特征112-114
3.6 质粒基因组序列的代谢调控图114-115
3.7 Alicyclobacillus sp.A4 全基因组共线性分析115
3.8 Alicyclobacillus sp.A4 分泌组蛋白分析115-120
3.9 Alicyclobacillus sp.A4 糖基水解酶分析120-121
4 讨论121-123
本章小结123-124
第八章 结论124-126
参考文献126-139
致谢139-140
作者简历140
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京公网安备74号在同一份植物样品中测定α-和β-淀粉酶活力方法的改进--《生物学杂志》1987年02期
在同一份植物样品中测定α-和β-淀粉酶活力方法的改进
【摘要】：正 前言本世纪二十年代Kuhn等发现植物淀粉酶有两种类型,根据酶作用于淀粉时旋光度的变化,水解产物为α—型,有负的变旋光作用的称为α—淀粉酶;产物为β—型,有正的变旋光作用的称为β—淀粉酶。由于α—和β—淀粉酶在植物的生理生化过程和某些食品发酵工业中起着重要的作用,因此,同时测定这两种淀粉酶活力的方法,对农业、食品工业和淀粉酶的生化研究都具有实际的应用价值。苏联植物生理学家X.H.波钦诺克所著《植物生物化学分析方
【作者单位】：
【关键词】：
【正文快照】：
前言 本世纪二十年代Kuhn等发现植物淀粉酶有两种类型〔’一“’,根据酶作用于淀粉时旋光度的变化,水解产物为a一型,有负的变旋光作用的称为a一淀粉酶;产物为日一型,有正的变旋光作用的称为日一淀粉酶。 由于a一和日一淀粉酶在植物的生理生化过程和某些食品发酵工业中起着重
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