Maspin在宫颈鳞癌中的表达及其与肿瘤微淋巴管形成的相关性研究--CNKI机构馆在线
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Maspin在宫颈鳞癌中的表达及其与肿瘤微淋巴管形成的相关性研究
作&&&&者：
来&&&&源： 四川大学
摘&&&&要：
背景：子宫颈癌发病率在我国女性生殖道恶性肿瘤中居第一位，虽然对宫颈浸润癌的治疗已取得了长足进步，但每年仍有约5万人死于宫颈癌；流行病学资料显示宫颈癌发病年龄呈明显的年轻化趋势。淋巴转移是宫颈癌最重要的转移途径之一，也是影响患者预后的重要因素，目前肿瘤微淋巴管在肿瘤淋巴转移中的作用已引起人们关注。由于长期缺乏特异性的淋巴管标记物，肿瘤淋巴管的研究明显滞后于肿瘤微血管的研究。Podoplanin是近年发现的一种43kd的膜蛋白，已证实是较理想的淋巴管特异性标记物，它的出现有力的推动了肿瘤淋巴管的研究。
Maspin是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的新成员，大量研究提示它在诱导肿瘤细胞凋亡、抗肿瘤血管生成等方面功能显著，可能是一个功能全面的抑癌基因。微血管和微淋巴管发生的同源性提出了maspin与肿瘤微淋巴管的生成有无相关性的问题。
目的：本课题拟检测maspin及淋巴管特异性标记物podoplanin在宫颈癌组织中的表达；体外实验检测宫颈癌细胞中maspin高表达对宫颈癌细胞增殖能力的影响；雌性裸鼠实验观察移植瘤生长情况以及maspin、podoplanin在移植瘤组织中的表达。探讨maspin在宫颈癌进展中的作用，以及maspin对宫颈肿瘤新生淋巴管生成的影响。
方法：实验分为三个部分。1．采用免疫组化LSAB法对13例正常宫颈组织、15例宫颈CINⅢ组织、62例宫颈鳞癌组织、13例癌转移盆腔淋巴结组织标本进行maspin蛋白表达检测，以podoplanin抗体标记微淋巴管内皮细胞并计数宫颈癌组织中微淋巴管密度(LMVD)；分析maspin表达与宫颈癌临床病理参数以及肿瘤LMVD的关系。2．以maspin真核表达质粒稳定转染宫颈鳞癌siha细胞株(siha-m)。半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测转染后maspin mRNA表达变化，Western Blot及细胞免疫化学检测maspin蛋白表达变化。MTT法测定细胞生长曲线，流式细胞仪测定细胞周期及凋亡率以检测siha细胞转染maspin后细胞生物学行为的变化。3．雌性裸鼠皮下接种siha-m、siha、siha-pc3三种肿瘤细胞成瘤，检测三组细胞成瘤性、maspin蛋白表达和LMVD，评价体内环境中maspin表达载体对肿瘤细胞生长和肿瘤微淋巴管生成的影响。
结果：1．①maspin在宫颈鳞癌(SCC)细胞胞浆、胞核中均有表达，与正常宫颈组织及CINⅢ组织相比表达明显减弱(P＜0．05)；SCCⅡ期细胞核中maspin的表达较I b期明显下降(P＜0．05)，二者胞浆maspin表达差异无显著性(P＞0．05)：淋巴结转移癌巢maspin表达最弱(P＜0．05)。②SCC胞核maspin表达下降与较晚的临床分期、淋巴结转移显著相关(P＜0．05)；与浸润深度及组织学分级无相关性(P＞0．05)；胞浆maspin表达下降与淋巴结转移显著相关(P＜0．05)。LMVD增加与较晚的临床分期、淋巴结转移及高组织学分级显著相关(P＜0．05)。③SCC胞核maspin表达与临床分期、LMVD呈显著负相关(P＜0．05)；SCC胞浆maspin的表达与LMVD呈显著负相关(P＜0．05)；LMVD与临床分期呈显著正相关(P＜0．05)。
2．以maspin真核表达质粒稳定转染宫颈鳞癌siha细胞后，用RT-PER、Western Blot及细胞免疫化学方法，均证实转染目的基因的siha-m细胞中maspin表达明显增强(P＜0．05)；MTT法细胞生长曲线测定、流式技术细胞周期及凋亡率测定均显示siha-m细胞增殖能力明显弱于转染空载体组(siha-pe3)和未转染组(siha)(P＜0．05)；siha-m凋亡率显著升高(P＜0．05)；siha-pc3与siha组在增殖及凋亡率方面无显著性差异(P＞0．05)。
3．maspin重组质粒转染后，阳性克隆siha-m细胞在裸鼠成瘤缓慢，肿瘤体积明显小于空白对照组和空质粒组。免疫组化显示，maspin转染组肿瘤maspin蛋白表达强于空质粒组和空白对照组；maspin转染组肿瘤LMVD明显小于空质粒组和空白对照组(P＜0．05)，后两者之间LMVD无显著性差异(P＞0．05)。
结论：maspin在宫颈鳞癌组织表达下调，其中胞核maspin表达下调与较晚的临床分期、淋巴结转移及LMVD增加显著相关：胞浆maspin表达下调与淋巴结转移及LMVD增加显著相关；LMVD增加与晚期、淋巴结转移及高组织学分级显著相关，肿瘤微淋巴管可能参与了区域淋巴结的转移。maspin基因能明显抑制宫颈鳞癌siha细胞的增殖，有效减缓肿瘤生长，抑制肿瘤微淋巴管生成。maspin基因抗淋巴管生成的功能将成为新的研究热点，可望成为宫颈鳞癌基因治疗的新靶点。
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中文摘要8-11
? 英文摘要11-15
? 前言15-18
? 第一部分 maspin在宫颈鳞癌中的表达及其与肿瘤微淋巴管的相关性研究18-38
材料和方法18-22
附图一32-34
附表一34-38
? 第二部分 maspin在宫颈鳞癌的体外研究38-60
材料和方法38-52
附图二59-60
? 第三部分 maspin表达载体与肿瘤微淋巴管生成的体内研究60-71
材料和方法60-62
附图三68-71
? 小结71-74
? 参考文献74-83
? 文献综述83-136
综述一83-120
参考文献106-120
综述二120-136
参考文献130-136
中国学术期刊网络出版总库[1] 谢方民,程园园,邵旭建;;解剖学报;2005年04期
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【求助】请教裸鼠移植瘤模型建立的细节问题--急。。
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这个帖子发布于4年零354天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
已经接种了两次了，都没有长出瘤来。。特请教准备细胞的相关问题：贴壁细胞消化后，是用不含血清的培养液终止消化还是含血清的培养液？老师说的是前者，师兄说的是后者。。。消化后至接种时间最长间隔多久？上两次我消化细胞就用了近一个小时，等到接种上，又过了半个多小时，这么长的时间间隔是不是影响很大？急切等待大家的帮助、、、
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解决的办法1：消化后用不含血清的培养基终止，并且用PBS或NS洗3次。2：接种的时间间隔，就看细胞的活性了。一般的肿瘤细胞都不太受时间的影响，可以4度保存1～2小时至接种。3：没能接种成功的原因，接种前是否混匀细胞，接种的细胞数是否满足生长需要，接种后观察的时间是否够长（3-7天）。
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1.能不能成瘤，首先要考虑你的肿瘤细胞能系能不能成瘤，其次关键是你的肿瘤细胞数，一般肿瘤细胞存活力还是蛮高的，所以你重点要考虑细胞数的问题，但最高不要超过1*10的7次方。2.接种时间，最好在1小时之内完成。但在我实际操作过程中，裸鼠的数量又多，1小时之内根本做不完的，所以你可以预先将细胞放在冰盒里暂为保存。效果还是不错的。3.成瘤时间，每个肿瘤细胞不太一样，细胞数合适，一般一周左右应该能出来了；另外，如果你是打皮下，你要考虑是否有打到深层组织，比如肌肉，那即使成瘤了，也不大好摸出来。
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我有的时候注射的不好，打到肌肉上了，怎么肿瘤长的反而好呢，还有皮下打的深一点的话，细胞就弥散了，皮下是疏松结缔组织，很多脂肪啊，这个深度真不好把握啊，我种的PC3，搞得我郁闷死了
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我有的时候注射的不好，打到肌肉上了，怎么肿瘤长的反而好呢，还有皮下打的深一点的话，细胞就弥散了，皮下是疏松结缔组织，很多脂肪啊，这个深度真不好把握啊，我种的PC3，搞得我郁闷死了
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我还注意到一点，如果肿瘤细胞种的太过于皮下，包膜很紧张，很容易破溃，有的才黄豆大小呢，就破溃了。另外，今天我解剖了几只，我发现，好几只当初也是打在肌肉表面的，但的确长得很好，但与周围组织粘的厉害，剥离起来很麻烦。我觉得这个皮下的度，应该为表皮跟肌肉之间，这样肿瘤剥离下来很easy的。这深度把握得自己把握才行。
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我从网上找了个皮肤的结构示意图，各位大侠示意一下，打到哪一层比较好，我觉得真是皮下的话反正长不好，因为皮下很疏松，很多脂肪组织，肯定不利于肿瘤生长，皮内也不行，是不是真皮内比较好啊
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肿瘤细胞消化后用完全培养基中和（含血清），离心去上层培养基（1000rpm,6min），然后用PBS重选洗涤1-2次，最后用PBS或无血清的培养基重悬，调整细胞浓度，一般为10^6-10^7，接种到裸鼠皮下即可。从消化到接种时间间隔当然越短越好，如果时间较长，可放置4度保存，当然，时间一般不要超过2-3个小时，另外，接种时，可用台盼蓝染色检测死活细胞数，以每100个细胞不超过1-3死细胞为宜。
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--------------------------------------------------------------------------------我有的时候注射的不好，打到肌肉上了，怎么肿瘤长的反而好呢，还有皮下打的深一点的话，细胞就弥散了，皮下是疏松结缔组织，很多脂肪啊，这个深度真不好把握啊，我种的PC3，搞得我郁闷死了 这位guomao2001可不可以留个联系方式啊，我也是做pc3细胞的，请问你移植瘤后几周能看出来，我的一个多月才能看出来，郁闷啊
关于丁香园siRNA沉默PC3细胞中KDR基因表达的实验研究--《第四军医大学》2006年硕士论文
siRNA沉默PC3细胞中KDR基因表达的实验研究
【摘要】：血管内皮生长因子受体-2(Vascular endothelial growth factor receptor-2/kinase-insert domain containing receptor：VEGFR-2／KDR)广泛分布于血管内皮细胞，也分布于部分肿瘤细胞表面，通过两个机制促进肿瘤发生发展：(1)旁分泌促血管生成作用：实体肿瘤细胞分泌VEGF，VEGF作用于肿瘤旁的血管内皮上的KDR，促使血管内皮细胞分裂增殖，促进新血管的生成，提高血管的通透性。(2)自分泌直接刺激肿瘤细胞增殖：部分肿瘤细胞，包括前列腺癌细胞，表达KDR，存在VEGF-KDR自分泌环，VEGF作用于自身后，促进肿瘤细胞生长。阻断KDR表达有望在两个水平起到抗肿瘤作用，KDR是基因治疗的良好靶标。
RNA干扰(RNAi)是由dsRNA介导的转录后基因沉默机制，当外源导入dsRNA被Dicer酶切割成19-23nt的小分子干扰RNAs(siRNA)后，与体内其它成分聚合形成RNA诱导型基因沉默复合体(RISC)，然后活化的RISC可导致与siRNA互补靶序列的降解，从而导致特异的基因沉默效应。RNAi技术在基因敲除或诱导基因沉默等方面都取得了可喜成果，这些为本课题选择RNAi机制来抑制KDR的表达提供了理论依据。
我们首先用免疫细胞化学，免疫印迹技术及RT-PCR技术检测了5个前列腺癌细胞系中VEGF和KDR在蛋白水平及mRNA水平上的表达，
【关键词】：
【学位授予单位】：第四军医大学【学位级别】：硕士【学位授予年份】：2006【分类号】：R73-3【目录】：
缩略语表5-7
中文摘要7-10
英文摘要10-14
前言和文献回顾14-32
第一部分 血管内皮生长因子及其受体KDR在前列腺癌细胞中的表达研究32-46
1.1 实验材料32-35
1.2 方法35-39
1.3 结果39-44
1.4 讨论44-46
第二部分 siRNA抑制PC-3细胞内KDR基因的表达46-69
2.1 实验材料46-48
2.2 方法48-56
2.3 结果56-67
2.4 讨论67-69
第三部分 PC-3细胞KDR基因沉默后的裸鼠体内成瘤实验69-77
3.1 实验材料69
3.2 方法69-71
3.3 结果71-75
3.4 讨论75-77
参考文献78-84
个人简历和研究成果84-85
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